Anda di halaman 1dari 41

Pengenalan Kultur Sel

Mamalia

Puji Astuti

Animal Cell
Cytoplasm

Nucleolus
Nucleus

Ribosomes
Cell Membrane
Mitochondria

Rough
Endoplasmic
Reticulum
Golgi Bodies

Smooth
Endoplasmic
Reticulum

Pengenalan Kultur Sel Mamalia


Apakah Kultur Sel?
Kultur sel dapat di definisikan sebagai
pemindahan sel dari binatang dan dilanjutkan
pertumbuhannya dalam lingkungan artifisial
yang mendukung
Sel dapat dipisahkan langsung dari jaringan dan
didisintegrasi dengan reaksi enzimatis atau
mekanik sebelum dikulturkan, atau dapat
diturunkan dari suatu cell line atau strain sel
yang sudah ada/establish

Cara memperoleh Cell line


Kita bisa membuat kultur sel primer sendiri atau membeli
dari kultur sel yang sudah establih secara komersial atau
non-profit suppliers (i.e., cell banks);
Reputable suppliers mempunyai cell lines dengan
kualitas yang tinggi yg telah ditest dengan baik
integritasnya untuk menjamin kultur sel bebas dari
kontaminan;
Disarankan untuk tidak meminjam kultur dari
laboratorium yang lain karena mereka umumnya
beresiko kontaminan.
Dari manapun sumbernya, pastikan cell line yang baru di
uji keberadaan kontaminasi mycoplasma sebelum
digunakan

Kultur Sel/Lines

Primary culture/Kultur Primer dapat didefinisikan sebgai kultur yang


diperoleh setelah sel disolasi dari jaringan dan berproliferasi dalam kondisi
yang sesuai sampai mereka menempati seluruh tempat tumbuh (mencapai
confluence). Pada tahap ini, sel harus disubkultur (i.e., passaged) dengan
cara memindahkannya ke dalam tempat tumbuh yang baru berisi media
baru untuk melanjutkan pertumbuhan;
Setelah subkultur pertama, sel kultur primer disebut suatu cell line atau
subclone. Cell lines yang diturunkan dari kultur primer mempunyai waktu
hidup terbatas (i.e., they are finite), dan seiring proses subkultur, sel dengan
kapasitas pertumbuhan tertinggi akan mendominasi, menghasilkan suatu
tingkat keseragaman genotip dan fenotip dalam populasi;
Jika suatu subpopulasi suatu cell line diseleksi dari kultur dengan kloning
atau dengan metode lain, cell line ini menjadi suatu cloned cell strain.
Suatu cell strain kadang mengalami penambahan perubahan genetik
setelah pembuatan parent line.

http://www.invitrogen.com/

Morfologi sel Mammalian


Hampir semua sel mamalia dapat dikategorikan menjadi
3 kategori dasar menurut morfologi:
1) Fibroblastic (atau fibroblast-like) cells adalah bipolar atau
multipolar, mempunyai bentuk memanjang dan tumbuh melekat
pada suatu substrate/tempat tumbuh;
2) Epithelial-like cells adalah berbentuk polygonal dengan dimensi
yang teratur, dan tumbuh melekat pada substrate dalam pola yang
dapat dibedakan;
3) Lymphoblast-like cells adalah berbentuk spheric dan umumnya
tumbuh seperti suspensi tanpa melekat pada permukaan

http://www.invitrogen.com/

Morfologi sel mamalia


Selain kategori dasar di atas, sel tertentu mempunyai
karakteristik morfologi yang spesifik, tergantung
perannya dalam inangnya.
Neuronal cells nampak dalam bentuk dan ukuran yang berbeda,
tetapi secara garis besar dapat dikategorikan menjadi 2: tipe I
dengan axon panjang digunakan untuk menggeraklan signal dalam
jarak jauh dan tipe II tanpa axons. Suatu neuron khusus nampak
sebagai perpanjangan dengan banyak cabang dari badan sel,
disebut dendritic tree.

http://www.invitrogen.com/

Sel neuron

Morfologi sel mamalia


Human Embryonic Kidney 293 cells, sering disebut HEK 293, 293
cells, atau HEK cells adalah cell line spesifik yang diturunkan dari
human embryonic kidney cellsdan ditumbuhkan dalam kultur
jaringan.
1

Gambar phase contrast


memperlihatkan morfologi
293 sel sehat ditumbuhkan
dalam kultur melekat pada
80% confluency (1) dan
kultur suspensi (2)

http://www.invitrogen.com/

Finite vs Continuous Cell Line


Sel normal umumnya membelah dengan jumlah
terbatas sampai kemudian hilang kemampuan
berproliferasi, suatu event genetik yang disebut
senescence; cell lines ini disebut finite.

Namun, beberapa cell lines menjadi immortal


melalui proses yang disebut transformasi, dapat
terjadi secara spontan atau dapat diinduksi
secara kimia atau diperantarai virus. Ketika
suatu finite cell line mengalami transformasi
dan memiliki kemampuan membelah tidak
terbatas, maka sel tersebut menjadi suatu
continuous cell line.
http://www.invitrogen.com/

Stem Cells
Embryonic Stem Cells: pluripotent stem cells
yang diturunkan dari masa sel bagian dalam dari
suatu blastocyst, suatu early-stage
preimplantation embryo

Stem Cells
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs):
Suatu jenis pluripotent stem cell yang dapat
dihasilkan langsung dari sel dewasa.
(1) Isolasi dan kultur sel donor
(2) Transfect stem cell-associated
genes dalam sel dengan
perantara viral vectors. Sel
berwarna merah menandakan
sel yang mengekspresikan
exogenous genes.
(3) Panen dan kultur sel dengan
mitotically inactivated feeder
cells (lightgray).
(4) Kelompok kecil sel yang telah
tertransfesi menjadi sel iPS dan
menghasilkan ES-like colonies.

Stem Cells
Hematopoietic Stem Cells (HSCs): adalah
sel darah yang menghasilkan semua jenis
sel darah dan diturunkan dari mesoderm.
Sel tersebut berada di red bone marrow,
yang menjadi pusat hampir semua tulang.

Stem Cells
Mesenchymal Stem Cells: MSCs, adalah
multipotent stromal cells yang dapat
berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel,
termasuk osteoblasts (bone cells),
chondrocytes (cartilage cells), dan
adipocytes (fat cells).

Stem Cells
Neural Stem Cells & Glial Precursor Cells
Neural stem cells (NSCs) adalah self-renewing,
multipotent cells yang menghasilkan fenotip
utama sistem syaraf.
Glial precursor cells (GPCs), disebut juga glial
restricted progenitors (GRP) atau
oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), adalah
sel yang berpotensi untuk berdiferensiasi
membentuk oligodendrocytes atau astrocytes.
Diturunkan dari jaringan atau dari sel pluripotent
yang diinduksi faktor eksternal.

Isolat astrocyte dilihat confocal


microscopy, dicat GFAP (merah), focal
adhesion kinase (hijau), dan nuclear
stain To-Pro (biru)

Pemilihan Cell Line yang Cocok


Kriteria pemilihan cell line untuk penelitian:
Spesies: Non-human dan non-primate cell lines
biasanya punya batasan biosafety yang lebih sedikit,
tetapi pada dasarnya jenis penelitian menentukan
apakah menggunakan kultur spesies spesifik atau tidak;
Karakteristik Fungsional: Apa tujuan
penelitian? Contoh: cell line yang diturunkan dari hati
dan ginjal lebih cocok untuk testing toksisitas;

Finite atau continuous: finite cell lines pilihan untuk


penelitian yang mengarah pada fungsi ekspresi yang
lebih tepat, continuous cell lines lebih mudah digunakan
untuk kloning dan maintanance;
http://www.invitrogen.com/

Pemilihan Cell Line yang Cocok


Kondisi dan Karakteristik Pertumbuhan : Apakah persyaratan
untuk kecepatan pertumbuhan, kerapatan jenuh dan kemampuan
tumbuh dalam suspensi? Contoh untuk mengekspresikan proterin
dalam jumlah tinggi diperlukan cell line dengan kecepatan
pertumbuhan tinggi dan kemampuan tumbuh dalam suspensi.
Normal atau transformed: Transformed cell lines umumnya
mempunyai kecepatan pertumbuhan tinggi, plating efficiency lebih
tinggi, continuous, dan membutuhkan serum lebih sedikit dalam
media, tetapi sel tersebut mengalami perubahan permanen pada
fenotipnya karena transformasi genetik;

Kriteria lain: Kalau menggunakan finite cell line, apakah stoknya


cukup? Apakah cell line sudah terkarakterisasi baik atau perlu
proses validasi? Jika menggunakan abnormal cell line, apakah
punya normal cell line yang ekuivalen yang digunakan sbg kontrol?
Apakah cell linenya stabil? Jika tidak seberapa mudah diklon dan
dibuat untuk stock frozen yang cukup untuk penelitian?
http://www.invitrogen.com/

Tipe sel

Faktor
pertumbuhan
dan perlekatan

Konsentrasi
yg
disarankan
(ng/ml)

Mediu
m

Serum
Suppl.

MCF
7

Human
mammary
carcinoma

EGF(a)

100

DMEM

2%
FBS

HF

Human foreskin
EGF(a)
fibroblast

DMEM

10%
FBS

--

Primary
hepatocyte

EGF(a)

10

DMEM

10%
FBS

WB

Rat hepatic
epthelium

EGF(a)

10

Richter' 10%
s MEM FBS

HeLa

Human cervical
carcinoma

EGF(a)

2.5 x104

DMEM

10%
FBS

Epidermal
carcinoma

EGF(a)

2.5 x 104

DMEM

10%
FBS

1x103

MEM
Earle's

Cell
Line

A431
--

Primary human
fibroblast

EGF(a)

10%
FBS

Cell
Line

Tipe sel

Faktor
pertumbuhan
dan perlekatan

Konsentrasi
yg
disarankan
(ng/ml)

Mediu
m

Serum
Suppl.
8%
FBS

MKN7

Human
adenocarcinom
a

EGF(a)

50

DMEM

BALB
/c
3T3

Mouse
fibroblast

EGF(a)

50

DMEM/
-F-12

TM-4

Mouse testes
epithelium

EGF(a)

DMEM/
-F-12

NRK49F

Rat fibroblast

EGF(a)

50

DMEM/
-F-12

GH3

Rat
neuroblastoma

bFGF

F-12

BHK21

Baby hamster
kidney

bFGF

DMEM/ 5%
F-12
Calf

MKN7

Human
adenocarcinom
a

EGF(a)

50

DMEM

--

8%
FBS

Kondisi kultur
Kondisi kultur sangat berbeda untuk tiap jenis sel, tetapi lingkungan

artificial dimana sel ditumbuhkan tidak beragam yang umumnya


terdiri dari:
substrate atau medium yg mensuplai essential nutrients (asam
amino, karbohidrat, vitamin, mineral)
Faktor pertumbuhan (FBS; defined media supplements)
Hormones (extra)
gases (O2, CO2)
Lingkungan fisiko-kimia yang diatur (pH, tekanan osmosis,
temperature)
hampir semua sel anchorage-dependentdan harus dikulturkan
dengan melekatkan pada solid atau semi-solid substrate (adherent
atau monolayer culture), yang lain dapat ditumbuhkan mengapung
dalam medium kultur (suspension culture).

http://www.invitrogen.com/

Avi: 7

Menghitung sel dengan Hemacytometer


Bersihkan chamber dan cover
slip dgn alkohol. Keringkan
dan tempatkan coverslip dlm
posisi yg tepat.
Panen sel. Tambahkan 10 L
sel dlm hemacytometer. Jgn
berlebihan.
Tempatkan chamber dlm
inverted microscope, 10X
objective. gunakan phase
contrast untuk membedakan
sel.
Hitung sel pd bagian kotak yg
besar tengah bergaris (1
mm2). Kotak bergaris ada dlm
lingkaran. Kalikan 104 untuk
memperkirakan jml sel per
mL. Lakukan 2 X dan hitung
rata-rata.
http://www.invitrogen.com/

HepatoPac
HepatoPac Platform
Hepregen diekmbangkan
sebagai suatu bioengineered
microliver platform yang unik
sebagai model fungsional liver
in vivo.
Teknologi rekayasa jaringan
Microfabrikasi dikombinasi
untuk menghasilkan model
miniatur hati manusia yg
terorganisasi
Multiwell plate yg
terstandarmicropattern level
industri mengandung koloni sel
hati dikelilingi penyokong
stroma

http://www.hepregen.com/technology.html

Sel manusia untuk skrining


hES-CMC2D adalah sel hES
yg diturunkan dari klaster
cardiomyocyte, dibuat sebagai
monolayers dalam format 96well plate.
Keuntungan:
Sel manusia
Sumber homogen
Lingkungan asli dari multiple
ion channels
High toxicological relevance
Secara genetik unmodified
Suplai tidak terbatas
Fresh dan ready to use
Figure 1: Schematic illustration of an in vitro testing platform for hES-CMC2D (adapted from Mandenius et al, 2011)

http://www.cellartis.com/

Penggunaan stimulus elektrik atau kimia dapat


menghasilkan awal proses parthenogenesis

hpSC (human pluripotent stem cell)


Ketika digunakan untuk transplant-based stem
cell therapies, stem cells kemungkinan besar
menghadapi problem Human leukocyte antigen
(HLA) matching issues yang sama yang
membatasi solid organ allogeneic transplants
dan menyebabkan immune rejection. Resiko
penolakan proporsional dgn tingkat perbedaan
cell-surface antigen-presenting proteins donor
dan recipient.

Stem cells

Produk kesehatan berbasis sel


1. Manipulasi bersifat substansi: selama proses proses
produksi sel atau jaringan dimanipulasi sehingga
karakteristik biologi, fungsi fisik atau strukturnya
dimodifikasi untuk mencapai fungsi. Contoh: seleksi
dan ekspansi sel, sel yg dimanupilasi genetik
2. Penggunaan non homologous: sel atau jaringan
tidak ditujukan untuk digunakan untuk fungsi yg
sama antara resipient dan donor. Contoh bone
marrow aspirate digunakan untuk pasien penderita
jantung untuk regenerasi myocardium

Produk kesehatan berbasis sel

c. 15.000 patients

Produk kesehatan berbasis


rekayasa jaringan
In vitro skin

Neurotech
Encapsulated Cell Technology

www.neurotechusa.com/

Neurotech

Age-related macular degeneration (AMD) adalah penyebab utama kebutaan


pada orang tua di negara barat dengan prevalensi 30% pada individu umur
lebih dari 70 tahun. Degenerasi macula (bagian pusat retina) menyebabkan
hilangnya penglihatan pada bagian pusat.
Retinitis Pigmentosa (RP) menyebabkan degenerasi fotoreseptor sel di retina
(rod dan cone), yang dalam waktu lama mengurangi penglihatan malam
dan periferal yang memicu kebutaan

Kultur sel Neurotech


Produk Neurotech, NT-501, terdiri dari
encapsulated human cells genetically
modified to secrete ciliary neurotrophic
factor (CNTF). CNTF adalah faktor
pertumbuhan yg mengatasi
photoreceptors yang melemah dan
melindungi dari degenerasi. NT-501
didesign untuk secara terus menerus
menghasilkan dosis terapi yg rendah dan
aman ke bagian belakang mata.

Cell based medicinal products


Cell-based MPs

EudraCT Clinical trial applications (3Q 2005 4Q 2009)


3Q / 2005

3Q / 2006

3Q / 2007

3Q / 2008

4Q / 2009

Cancer immunotherapy

23

45

70

103

Cardio-vascular therapies

17

31

44

49

Skin/liver/eye/diabetes/intestine/bone TE

12

28

48

74

Neurological

Lymphohistiocystosis (HLH)

AIDS

Infertility

_________________________________________________________________________________________

Products (trials)
Data from Dr. E.Flory/Eudra CT

13 (25)

59 (73)

112 (132) 171 (213)

236 (329)
246 (2010)

R&D around CADUCEUS


1. J Cell Mol Med. 2012 Jan 6.
Dose-Dependent Functional Benefit of Human Cardiosphere
Transplantation in Mice with Acute Myocardial Infarction.
Shen D, Cheng K, Marbn E.
2. Circulation. 2012 Jan 3.
Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats
transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells.
Malliaras K, Li TS, Luthringer D, Terrovitis J, Cheng K, Chakravarty
T, Galang G, Zhang Y, Schoenhoff F, Van Eyk J, Marbn L, Marbn
E.
3. J Am Coll Cardiol. 2011 Jan 25;57(4):455-65.
Intramyocardial injection of autologous cardiospheres or
cardiosphere-derived cells preserves function and minimizes
adverse ventricular remodeling in pigs with heart failure postmyocardial infarction.
Lee ST, White AJ, Matsushita S, Malliaras K, Steenbergen C, Zhang
Y, Li TS, Terrovitis J, Yee K, Simsir S, Makkar R, Marbn E.

Physiological role of cells in


circulation?
J Cell Mol Med. 2011 Aug;15(8):1726-36. Circulating stem cell vary
with NYHA stage in heart failure patients. Fortini C, et al.

We have investigated the blood levels of subclasses of stem cells (SCs) [mesenchymal stem
cells (MSCs), haematopoietic stem cells (HSCs),
endothelial progenitor cells/circulating
endothelial cells (EPCs/CECs) and tissuecommitted stem cells (TCSCs)] in heart failure
(HF) patients at different stage of pathology and
correlated it with plasmatic levels of
proangiogenic cytokines.
PDF: 1

MSC

Harnessing the Mesenchymal


Stem Cell Secretome
for the Treatment of
Cardiovascular Disease
Cell Stem Cell 10, March 2, 2012

iPS
Avi: 2B, 2