OLEH :

NURSIDAH, SKM, M.Ked

A. PENDAHULUAN
Imunofluoresens adlh metode imunologi

utk mdeteksi Ab dr bbagai kls

imunoglobulin dlm serum, cairan ludah,
cairan otak dgn cara mereaksikan Ag
spesifik & anti-Ab yg dilabel dgn Fluoresence
Isothiocyanat (FITC), shg tpancar sinar
bwrna hijau atau merah jika dilabel dgn
rodhamin.

 Kompleks Ab dgn zat wrna ini akan tetap

mikat Ag & bila dilihat dgn mikroskop UV

akan tampak fluoresensi
Pdeteksian Ab & Ag yg perlu diperhatikan adlh

fiksasi protein spesifik dgn bahan kimia.

 Shg diperlukan pemilihan yg tepat bahan kimia

yg tbaik spt :
Formaldehyde
Aceton

Metanol
Alkohol

Shg tdk merusak epitop & paratop pd saat

direaksikan utk ikatan kompleks Ag & Ab

B. PEMBAGIAN METODE IMUNOFLUORESENS

1. Diret Fluoresensi (Cara Langsung)

Ab digabgkan dgn zat wrna bfluoresensi

(fluokrom) & konjugat dipai utk mdeteksi
Ag.
Misal pd sediaan mikroskopis lendir hapus
tenggorokan utk mengetahui adanya kuman
pneumokokus

 Maka sediaan tdi diwarnai dgn Ab thdp

polisakarida pneumokokus yg dilabel dgn
fluorescein-isothiocyanate
Bila pos dgn mikroskop UV dpt dilihat kuman

pneumokokous bfluoresensi

2. Indirect Fluorescens (cara tdk lgs)

Ag direaksikan terlebih dlu dgn Ab kemudian
diwarnai dgn konjugat yg tdiri dari
antiimunoglobulin & fluokrom
Misal : sediaan hapus tenggorok direaksikan

dulu serum kelinci yg mengandung Ab thdp

kuman pneumokokus

 Stlh dicuci, sediaan diwarnai dgn anti-Ig

kelinci yg dilabel dgn fluoresein

Hsilnya di bawah mikroskop UV akan tampak
kuman pneumokokus bfluoresensi
Keuntungan dr indirect flurescense :
Fluoresensinya lbh terang
Hy butuh 1 macam konjugat anti-Ig kelinci yg

dpt mberi fluoresensi pd bbagai macam Ab

kelinci thdp macam2 kuman

3. Sandwich Fluorescens
Misal utk melihat brp byk sel limfosit yg
mbuat Ab thdp polisakarida kuman
pneumokokus, caranya :
Dibuat sediaan sel limfosit & difiksasi dgn

etanol
Siram dgn larutan yg mengandung polisakarida
pneumokokus

 Biarkan sebentar
Cuci utk mhilangkan zat yg tdk menempel pd

limfosi
Beri larutan Ab thdp polisakarida yg dilabel
Shg sel limfosit yg mikat polisakarida krn
mbuat Ab thdpnya akan tampak bfluoresensi

C. PRINSIP KERJA DARI IMUNOFLUORESENSI

Antigen + Antibodi + Label Imunokomplek

Antigen + Antibodi + Konjugat (FITC)

Imunokomplek
Antigen + Antibodi + monos + FITC + Rhodamin
Imunokomplek

D. CONTOH APLIKASI METODE IMUNOFLUORESENSI

Persiapan :
Deckglass, objek glass, serum sampel, Ag dri sel
kultur atau Ag dr jaringan, Aceton, Feotal Calf
Serum (FCS), Phosphat Buffer Saline (PBS),
Pinset, Gelas inkubator, Kotak inkubator,
inkubator 37oC, Konjugat fragmen Ig,
mikroskop fluoresens, Rhodamin

D.1. DIRECT IMUNOFLUORESEN (DETEKSI Ag)

1.
2.
3.

4.
5.
6.
7.

Sel pd deckglass yg diinfeksi dgn virus diviksasi dgn

aseton -20oC slm 15 mnt
Cuci dgn PBS & keringkan pd temperatur ruangan
sampai kering
Masukkan deckglass pd PBS yg mengandung 1% FCS &
biarkan 15 mnt
Siapkan serum sampel & encerkan dgn PBS sesuai dgn
keperluan
Tetskan 2o l serum sampel di atas objek glass
Taruh deckglass di atas sampel dgn bagian sel di bawah &
letakkan dlm kotak & kertas yg tlh dibasahi dgn air
Inkubasi pd inkubator dgn suhu 37oC 45 mnt

8. Cuci dgn PBS 1% FCS slm 15 mnt

9. Siapkan konjugat fragmen Ig dgn pengenceran 1:100 l
10. Teteskan konjugat 20 l di atas objek glass & letakkan
deckglass di atasnya
11. Inkubasi dgn inkubator 37oC 45 mnt
12. Cuci dgn PBS 1% FCS slm 15 mnt , angkat deckglass &
sentuhkan deckglass pd kertas tissue agar airnya bkurang
(kering tp basah)
13. Teteskan glyserin 50% 20 l di atas objek glass, letakkan

deckglass di atasnya
14. Lihat dgn mikroskop fluoresensi dgn objektif 40x

D.2 INDIRECK FLUORESCENSE

1.

Sel pd deckglass yg diinfeksi dgn virus difiksasi dgn

etanol -20oC slm 15 mnt

2. Cuci dgn PBS & keringkan pd suhu kamar sampai

3.
4.
5.
6.
7.

kering
Masukkan deckglass pd PBS yg mengandung FCS 1%
& biarkan 15 mnt
Siapkan serum sampel & encerkan dgn PBS 1:10 atau
sesuai keperluan
Encerkan Ab monoklonal 1:100
Tambahkan sama byknya no.4 & no. 5
Teteskan 20 l serum sampel di atas objek glass

8. Letakkan deckglass di atas sampel dgn bagian sel di

bawah & letakkan dlm kotak & kertas yg tlh dibasahi
dgn air
9. Inkubasi dgn inkubator 37oC 45 mnt

10. Cuci dgn PBS 1% FCS slm 15 mnt

11. Sipakan konjugat fragmen Ig dgn pengenceran
1:100 l
12. Siapkan Rhodamin dgn pengenceran 1:100 l
13. Campur sama byknya no.11 & no.12
14. Teteskan campuran konjugat & Rhodamin 20l di
atas objek glass & letakkan deckglass di atasnya

15. Inkubasi dgn inkubator 37oC 45 mnt

16. Cuci dgn PBS 1% FCS slm 15 mnt & selanjutnya

angkat deckglass & sentuhkan pd kertas tissue
agar airnya bkurang (kering tp basah)
17. Teteskan glyserin 50% 20l di atas objek glass,
tutup dgn deck glass di atasnya
18. Periksa di bawah mikroskop fluoresensi dgn obyektif
40x
Cttn: Preparat dpt disimpan pd suhu 4oC sampai 2-3
minggu