Praktikum

Biokimia
Lanjut
Nama anggota:
Islam Adiguna
Maria Veronika K.
Mimin Nur Handayani
Nia Nur Dinia Rahmah
Ellyas Enda Hadinata B.
Indah Rahayu Kartika
Amirotul Muniroh

(080810636)
(081115007)
(081115028)
(081115065)
(081115086)
(081115088)
(081115089)

Isolasi Enzim Xylosidase

Rekombinan
Dosen pembimbing:
Prof. Dr. Ni Nyoman Tri
Puspaningsih, M.Si

METODE PENELITIAN
Produksi

ekstrak kasar

1% biakan inokulum
ke dalam 1000 mL
media produksi

diinkubasi pada suhu

37C ,kecepatan 150
rpm selama 2,5 jam

Pelet sel + buffer lisis

dihomogenkan
(dikocok)

disentrifugasi pada suhu

4C , 3500 rpm selama
30 menit

dilisis dengan
ultrasonikator pada
80 Hz selama 4 x 1
menit

disentrifugasi
kembali

Pada OD600, jika

absorbansi sebesar
0,5-0,7 maka +100
L 1M IPTG /100 mL
media

Diinkubasi
kembali
Isolasi : sentrifugasi
kembali dengan
kecepatan 10.000
rpm selama 15 menit

METODE PENELITIAN
Produksi

ekstrak kasar

Supernatan dipanaskan pada

suhu 60C (suhu optimum
enzim GbtXyl43B) selama 30
menit

disentrifugasi lagi agar

diperoleh ekstrak kasar
enzim -xylosidase
rekombinan

tahap pemurnian

METODE PENELITIAN
Pemurnian

parsial dengan pengendapan

amonium sulfat

ekstrak kasar + ammonium

sulfat (dengan persen
kejenuhan 30%, 40%, 50%,
60%, 70%, dan 80%)

didialisis pada 4oC

dengan membran
penyaring 0,45m.
Buffer diganti
sebanyak tiga kali
setiap 8 jam sekali.

Pelet + 50mM
buffer natrium
asetat (pH 5,5)

diaduk selama satu jam

pada 4oC lalu disentrifugasi
kec.14.000rpm selama 45
menit

terbentuk dua lapisan,

pelet dipisahkan dari
supernatan

METODE PENELITIAN
Pemurnian

afinitas

Kolom dialiri
akuades 5 ml,
lalu 10 mL buffer
pengikat pH 8

protein dengan kromatografi

+5 mL sampel (ekstrak
kasar enzim) diinkubasi
selama 1 jam pada
suhu 40C

kolom dicuci: 10 mL buffer Striping pH 7.5

(10 mM fosfat, 500 mM NaCl dan 50 mM
EDTA), 10 mL buffer pengikat, 10 mL dH2O,
0.1 M NiSO4, 5 mL dH2O, 5 mL buffer
pengikat dan terakhir 5 mL etanol 20%.

dialirkan buffer
elusi pH 8 dengan
variasi konsentrasi
imidazol 30 mM; 60
mM; 100 mM; 300
mM dan 500 mM
masing-masing
sebanyak 5 mL

buffer elusi yang

melewati kolom
ditampung 500
L tiap fraksi

METODE PENELITIAN

Uji Aktivitas Enzim -Xylosidase

dengan Metode DNS

Kontrol

METODE PENELITIAN
Uji I dan II

METODE PENELITIAN

Penentuan Kadar Protein

Menggunakan Metode Bradford
BLANKO
100 L akuades +1 mL pereaksi Coomasive Briliant Blue G-250
SAMPEL
100 L enzim + 5 mL
pereaksi Coomasive
Brilliant Blue G-250

dikocok dan
dibiarkan
selama 5 menit

Absorbansi
diukur pada
= 595 nm

STANDAR PROTEIN
Bovine Serum Albumin (BSA) pada kisaran 0,05 0,25 mg protein mL-1
dari stok BSA 2 mg mL-1.

METODE PENELITIAN
Analisis

hasil pemurnian enzim -Xylosidase

dengan SDS-PAGE

20 sampel + 5
sampel buffer 5 ke
dalam penangas air
mendidih selama 5
menit.
gel dipindahkan ke
dalam larutan
destaining untuk
memudarkan
kelebihan warna
pada gel.

Sampel
dimasukkan ke
dalam sumur
gel penahan

Gel SDS PAGE

direndam dalam
larutan staining
selama 1 jam
sampai
penampakan pita
protein terlihat.

Power suply pada

120 volt

Elektroforesis
dihentikan saat
pergerakan protein
sekitar 1 cm dari
batas bawah gel
pemisah.

HASIL PENGAMATAN

Tabel Purifikasi
Larutan

Volume
(mL)

Total
Protein
(mg)

Total
Spesifik
Aktivitas aktivitas
(Unit)
(unit mg-1)

Crude
Kromatografi
kolom

7
5

0,044
0,024

0,045
0,024

Ammonium
sulfat

0,426

Yield
(%)

Purification
fold

1,02
1,00

100
53,34

1
0,98

LAMPIRAN

Gambar 1. Pembuatan media LB

padat untuk peremajaan isolat

Gambar 2. Pembuatan media LB cair

untuk tahap inokulasi

LAMPIRAN

Gambar 3 . Pemurnian parsial dengan

pengendapan amonium sulfat

LAMPIRAN

Gambar 4. Pemurnian protein

dengan kromatografi afinitas

LAMPIRAN

Gambar 5. Uji Aktivitas Enzim -Xylosidase dengan

Metode DNS

LAMPIRAN

Gambar 6. Analisis hasil pemurnian

enzim -Xylosidase dengan SDS-PAGE