Pendahuluan
tujuan
Bebas sel DNA janin merupakan sumber materi genetik janin yang dapat digunakan untuk non-invasif
diagnosis prenatal dari ibu. Biasanya kurang dari 10% dari total sel DNA bebas dalam plasma ibu
merupakan mayoritas yang berasal dari ibu. Mengoptimalkan kondisi untuk memaksimalkan hasil dari
sel-bebas DNA janin akan sangat penting untuk pelaksanaan yang efektif dari pengujian. Kami
mengeksplorasi faktor yang mempengaruhi hasil DNA janin dari sampel darah ibu, termasuk penilaian
tabung koleksi yang mengandung sel-menstabilkan agen, suhu penyimpanan, interval untuk pengolahan
sampel dan metode ekstraksi DNA yang digunakan.
metode
Mikofluida digital PCR dilakukan untuk secara tepat mengukur laki-laki (janin) DNA, DNA total dan
fragmen DNA yang panjang (indikasi DNA sel ibu). Real-time qPCR digunakan untuk assay untuk
keberadaan sinyal SRY laki-laki dalam sampel.
hasil
Jumlah sel-bebas kuantitas DNA meningkat secara signifikan dengan waktu dalam sampel disimpan
dalam tabung K3EDTA, tetapi hanya minimal dalam sel menstabilkan tabung. Kenaikan ini semata-mata
karena adanya fragmen DNA panjang tambahan, dengan tidak ada perubahan dalam kuantitas DNA
janin atau pendek, menghasilkan penurunan yang signifikan dalam proporsi sel-bebas DNA janin dari
waktu ke waktu. Penyimpanan pada suhu 4 C tidak mencegah perubahan ini.
kesimpulan
Ketika sampel dapat diproses dalam waktu delapan jam imbang darah, tabung K3EDTA dapat digunakan.
Waktu transfer berkepanjangan dalam tabung K3EDTA harus dihindari karena proporsi hadir DNA janin
berkurang secara signifikan, dalam situasi penggunaan tabung sel menstabilkan adalah lebih baik.
Ekstraksi DNA kit yang digunakan dapat mempengaruhi tingkat keberhasilan dari tes diagnostik.
Kutipan: Barrett AN, Zimmermann BG, Wang D, A Holloway, Chitty LS (2011) Pelaksana Diagnosis
Prenatal Berdasarkan your Bebas DNA janin: Identifikasi Akurat Faktor yang Mempengaruhi Hasil DNA
janin. PLoS ONE 6 (10): e25202. doi: 10.1371/journal.pone.0025202
Editor: Giuseppe Novelli, Tor Vergata Universitas Roma, Italia
menantang dan mungkin tergantung pada deteksi perubahan kecil dalam proporsi relatif alel
menggunakan metode seperti PCR digital [13], [14] atau sequencing generasi berikutnya [15], [16], [17].
Dalam konteks ini, optimalisasi proporsi sel-bebas hasil DNA janin dapat menjadi kritis. Studi pada
sukarelawan sehat telah menunjukkan bahwa jumlah sel-bebas DNA meningkat dalam serum
dibandingkan dengan sampel plasma, dan meningkat ketika darah disimpan selama 24 jam sebelum
sentrifugasi, efek diduga menjadi sekunder untuk lisis sel dari waktu ke waktu [18]. Penelitian lebih
lanjut dengan menggunakan darah yang diambil dari wanita hamil menunjukkan peningkatan serupa
dalam jumlah sel-bebas DNA dari waktu ke waktu, tetapi menggunakan real-time PCR menunjukkan
bahwa jumlah mutlak bebas sel DNA janin tetap konstan [19].
Layanan diagnostik genetik di Inggris dan Eropa cenderung regionalisasi, dan praktek saat ini adalah
bahwa sampel pasien diangkut ke laboratorium untuk analisis yang tepat. Sementara waktu transportasi
sering kurang dari satu hari, itu bisa jauh lebih lama, dengan beberapa pengambilan sampel hingga satu
minggu untuk tiba. Di sini, kita mengevaluasi faktor-faktor yang dapat memaksimalkan hasil dari selbebas DNA janin, menggunakan digital PCR untuk secara akurat menentukan jumlah dari kedua (188192 bp) amplikon singkat (45-46 bp) dan panjang dalam tes paralel untuk menghitung jumlah DNA
pendek (terutama janin) dan panjang (terutama ibu) fragmen [20], [21]. Data ini akan menginformasikan
pengembangan standar yang dibutuhkan untuk penerapan teknologi ini ke dalam praktek klinis rutin.
Modul 3
Untuk membandingkan pengaruh suhu penyimpanan pada komposisi DNA sel-bebas, enam 5 ml K3EDTA
tabung darah dikumpulkan dari sepuluh wanita hamil. Tabung 1 itu segera diproses (0 sampel jam).
Tabung 2 dan 3 disimpan selama delapan jam, satu pada suhu kamar dan yang kedua pada 4 C. Tabung
4 dan 5 yang disimpan selama 24 jam pada suhu kamar dan 4 C masing-masing. Tabung 6 disimpan
pada suhu kamar selama 72 jam dan kemudian diproses.
Modul 4
Untuk mengevaluasi penggunaan tabung sel-menstabilkan (your bebas BCTs DNA, Streck )
dibandingkan dengan tabung K3EDTA, darah dari 20 orang itu ditarik ke dalam tiga dari setiap jenis
tabung. Satu K3EDTA dan satu sel-menstabilkan tabung itu segera diproses (0 sampel jam), salah satu
dari masing-masing pada 24 jam, dan salah satu dari masing-masing pada 72 jam. Semua sampel
disimpan pada suhu kamar.
Modul 5
Untuk mengeksplorasi kemungkinan mengurangi jumlah hasil yang kurang jelas mengikuti NIPD untuk
penentuan seks janin yang QIAamp Qiagen Beredar Nucleic Acid (CNA) kit digunakan untuk mengekstrak
DNA dari sampel plasma beku yang sebelumnya ditemukan tidak meyakinkan bila diekstraksi
menggunakan QIAamp MinElute Virus Putar (QV). Kuantitatif real time PCR menggunakan alat tes Ykromosom tertentu (SRY) dilakukan pada setiap sampel diekstraksi secara paralel, dengan menggunakan
CCR5 sebagai kontrol untuk mengkonfirmasi keberadaan DNA dalam sampel diekstraksi.
Untuk semua modul plasma dipisahkan dari sel darah dengan sentrifugasi pada 1500 g selama sepuluh
menit. Supernatan kemudian dipindahkan ke tabung segar, memastikan bahwa buffy coat tetap utuh.
Plasma disentrifugasi pada 16000 g selama sepuluh menit untuk menghilangkan sel-sel yang tersisa,
ditransfer menjadi dua ml Lo-Bind tabung (Eppendorf Inggris) dan disimpan pada -80 C sampai
ekstraksi DNA.
DNA diekstraksi dari 2 ml plasma menggunakan QIAamp Beredar kit Nucleic Acid (Qiagen, Inggris) sesuai
dengan instruksi pabrik, dan dielusi menjadi volume akhir 50 ml buffer elusi.
Dua duplex digital PCR tes didirikan untuk amplifikasi simultan baik urutan pendek atau panjang dari
kromosom Y (DYS14) dan kromosom 18 (ZCCHC2). Urutan primer dan probe yang tercantum dalam
Tabel 1. ZCCHC2 probe diberi label dengan Cal Fluor Orange dan DYS14 probe berlabel dengan FAM
(Biosearch Technologies, Novato, CA). Uji (45-46 bp) pendek digunakan untuk menentukan jumlah total
DNA (ibu ditambah janin) dan persentase DNA janin laki-laki dalam sampel DNA plasma. The (188-192)
panjang bp tes digunakan untuk mengukur jumlah dan persentase molekul DNA yang panjang (terutama
ibu).
Diskusi
Dalam studi ini kami telah menunjukkan bahwa peningkatan total sel DNA bebas yang terjadi dengan
waktu meningkat dari mengambil darah sebagian besar dapat dicegah dengan mengambil darah ke
tabung yang menstabilkan sel-sel ibu, sehingga memungkinkan proporsi bebas sel DNA janin tetap lebih
atau kurang konstan. Studi sebelumnya telah digunakan semua kuantitatif real-time PCR untuk
mengukur bebas sel DNA dalam sampel bawah kondisi yang berbeda. Di sini, kami menerapkan
teknologi digital PCR untuk lebih akurat menentukan jumlah salinan DNA total menggunakan sangat
singkat tes PCR, dan menggunakan amplikon PCR lagi (terutama ibu mendeteksi sel-bebas DNA) untuk
mengetahui pengaruh dari berbagai pra-analitis faktor terhadap hasil dan Komposisi sel-bebas DNA.
Digital PCR memiliki keuntungan lebih kuantitatif PCR karena mampu membedakan perbedaan kurang
dari dua kali lipat dengan akurasi besar. Karena teknologi ini didasarkan pada menghitung molekul
template, tidak ada kebutuhan untuk menormalkan untuk referensi, menghilangkan efek sekunder
untuk perbedaan dalam efisiensi dalam reaksi PCR untuk dua gen atau antara sampel dan referensi.
Sebuah uji PCR singkat untuk gen pada kromosom 18 ZCCHC2 digunakan untuk menghitung jumlah total
sel salinan bebas DNA per ml plasma, sementara alat tes yang panjang untuk gen yang sama digunakan
untuk menentukan kontribusi dari DNA seluler ibu untuk angka ini . The DYS14assay pendek
menunjukkan jumlah total DNA janin dalam sampel, hanya sekitar 10% dari laki-laki DNA terdeteksi
dengan tes panjang untuk DYS14, menyatakan bahwa DNA janin didominasi apoptosis. Peningkatan
jumlah mutlak copy setelah penyimpanan lama adalah sama dengan pengukuran dengan tes PCR
singkat, menunjukkan bahwa DNA seluler yang baru dirilis secara eksklusif panjang dan bahwa tidak ada
fragmentasi DNA sel-bebas terjadi setelah pengambilan darah.
Pada seri pertama dari eksperimen kami menganalisis sampel darah individu siap pada waktu yang
berbeda-poin setelah imbang darah dan menunjukkan bahwa ada peningkatan yang signifikan dalam
DNA total, tetapi tidak bebas sel DNA janin sebagai waktu untuk meningkatkan proses. Sampel ini tidak
hanya disiapkan di berbagai interval waktu, mereka juga diambil pada usia kehamilan di seluruh
kehamilan. Hal ini diketahui bahwa sel-bebas tingkat DNA janin meningkat dengan usia kehamilan [3]
dan bahwa DNA sel-bebas ibu dapat berfluktuasi setiap hari [23]. Untuk menghilangkan kemungkinan
bias karena ini, penelitian lebih lanjut dilakukan untuk menilai efek dari waktu ke proses dalam wanita,
suhu penyimpanan, dan menstabilkan sel-tabung dengan mengambil beberapa sampel dari individu
yang sama pada waktu yang sama. Penurunan proporsi sel-bebas DNA janin hanya dicegah atau
dikurangi dengan mengambil darah ke tabung yang stabil sel darah ibu, usia kehamilan dan suhu
penyimpanan tidak berpengaruh. Kami telah menunjukkan bahwa ini bukan hasil dari degradasi tingkat
DNA janin tetap konstan, DNA ibu yang agak tambahan dilepaskan, dan DNA ini didominasi (jika tidak
eksklusif) lama. Persentase DNA yang panjang (lihat informasi pendukung dalam Tabel S1 dan S2) dapat
digunakan untuk menentukan kualitas sampel plasma darah untuk analisa lebih lanjut. Semakin rendah
persentase DNA yang panjang, semakin baik, karena ini menunjukkan bahwa ada kontaminasi kurang
dari sel-sel ibu dari DNA sel-bebas. Penelitian sebelumnya, dengan menggunakan PCR real time
menyarankan bahwa sel-menstabilkan tabung bisa mempertahankan proporsi bebas sel DNA janin
dalam waktu lama [24]. Namun, dengan menggunakan metode yang lebih sensitif digital PCR, kami telah
menunjukkan bahwa jumlah sel-bebas DNA tidak meningkat secara bertahap dari waktu ke waktu,
sehingga pada 72 jam terjadi peningkatan kecil dan secara statistik sangat signifikan dari total panjang,
dan dengan demikian ibu, DNA. Penelitian ini mungkin memiliki implikasi untuk aplikasi klinis dan itu
akan menarik untuk melihat apakah efek ini lebih jelas dengan interval waktu yang lebih lama. Dari
catatan, penurunan proporsi sel-bebas DNA janin dalam jumlah kecil sampel EDTA diposting ke
laboratorium tampaknya tidak mempengaruhi SRY real-time PCR. Namun, jika ada penundaan yang
signifikan dalam transfer sampel ini dapat mempengaruhi kinerja, seperti yang disarankan oleh Finning
et al mana mereka disebabkan dua dari tiga palsu mereka RhD-negatif hasil mengetik RhD janin untuk
penundaan pos hingga dua minggu [25]. Selain itu, ada kemungkinan bahwa persiapan prompt plasma
atau penggunaan tabung koleksi yang mencegah lisis sel ibu, akan diminta untuk mengoptimalkan
proporsi sel-bebas hadir DNA janin ketika melakukan analisis berdasarkan penghitungan sensitif
menyalin nomor untuk estimasi rasio alelik.
Analisis kami dapat membantu untuk mengurangi cahaya pada laporan kontroversial oleh Dhallan, yang
melaporkan peningkatan pemulihan DNA janin menjadi rata-rata 25% dari darah dikumpulkan menjadi
formaldehyde yang mengandung tabung [26]. Sementara beberapa kelompok mampu mereplikasi
temuan ini [27], yang lain menemukan perbedaan dalam persentase DNA janin tidak signifikan [28], [29].
Telah menyarankan bahwa temuan ini bertentangan disebabkan oleh waktu pengolahan yang berbeda
antara sampel yang tidak diobati dan sampel stabilisasi formalin yang sedang dibandingkan [30]. Kami
telah menunjukkan bahwa pada empat jam dan delapan jam setelah pengambilan darah tidak ada
perbedaan proporsi DNA janin dalam plasma dari sel-sel yang tersimpan dalam tabung K3EDTA atau selstabilisasi tabung, tapi setelah penyimpanan 24 jam 'ada manfaat yang signifikan untuk menggunakan
sel- stabilisasi tabung. Perbedaan lain adalah bahwa Dhallan terdeteksi persentase jauh lebih besar dari
DNA janin menggunakan teknologi yang berbeda untuk orang lain menggunakan real-time PCR.
Persentase sel-bebas DNA janin dalam sampel plasma ibu ditentukan oleh PCR menggunakan DNA
plasma serial-diencerkan dan mengamati seri pengenceran tertinggi di mana gen itu terdeteksi.
Pendekatan pengenceran membatasi dapat dilihat sebagai pendahulu untuk mikofluida digital PCR yang,
dengan menggunakan ratusan ulangan pada pengenceran membatasi dan poisson statistik,
memungkinkan pengukuran yang lebih tepat banyak DNA. Jumlah salinan janin dideteksi oleh Dhallan
tetapi tidak proporsi sangat cocok dengan hasil kami. Ini sangat mungkin bahwa DNA janin melaporkan
median 25% sebenarnya akibat dari bawah-deteksi kontrol DNA total.
Akhirnya kami telah menunjukkan bahwa penggunaan QIAamp Beredar Asam Nukleat kit untuk
ekstraksi cffDNA memiliki potensi untuk mengurangi jumlah hasil yang kurang jelas dan meningkatkan
akurasi dengan menghindari hasil negatif palsu dalam sampel ibu yang digunakan untuk menentukan
jenis kelamin janin pada kehamilan beresiko seks terkait gangguan. Ini mungkin merupakan cerminan
dari peningkatan volume plasma yang digunakan untuk ekstraksi menggunakan kit (2 ml) dibandingkan
dengan Qiagen QIAamp MinElute Virus Spin (QV) yang menggunakan 400 ml . Namun, karena volume
kecil plasma tersedia untuk analisis dalam modul ini kami tidak dapat secara akurat mengevaluasi
kuantitas hadir cffDNA. Hasil ini menunjukkan perlunya evaluasi lebih lanjut dari kit ekstraksi DNA untuk
mengoptimalkan kuantitas cffDNA tersedia untuk analisis diagnostik definitif.
Singkatnya, kami telah menunjukkan bahwa penyimpanan sampel darah pada 4 C tidak memberikan
keuntungan lebih dari penyimpanan pada suhu kamar untuk memaksimalkan proporsi bebas sel DNA
janin dalam plasma. Jika memungkinkan, sentrifugasi sampel segera setelah imbang darah lebih, ketika
waktu untuk proses akan menjadi lebih besar dari delapan jam, penggunaan tabung yang mengandung
bahan untuk menstabilkan sel-sel yang berguna untuk mengoptimalkan sel-bebas tingkat DNA janin.
Ekstraksi DNA kit, dan / atau volume plasma diekstraksi dapat mempengaruhi keandalan pengujian
dalam situasi klinis. Temuan kami mungkin memiliki implikasi signifikan untuk menerapkan non-invasif
diagnosis prenatal didasarkan pada sel-bebas DNA janin dalam praktek klinis.
Pendukung Informasi
Tabel S1.
Data mentah.
(DOC)
Tabel S2.
Ringkasan statistik.
(DOC)
Penulis Kontribusi
Disusun dan dirancang percobaan: ANB BGZ LSC. Melakukan percobaan: ANB BGZ DW. Kontribusi
reagen / bahan / alat analisis: DW AH. Menulis kertas: ANB BGZ LSC. Dianalisis dan diinterpretasikan
data: ANB BGZ LSC. Mengumpulkan sampel dan melakukan persiapan sampel: DW AH.