Anda di halaman 1dari 4

Teknik Isolasi DNA

Deoxyribosa Nucleic Acid (DNA) adalah asam nukleat yang mengandung materi
genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara
ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein
histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi
dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu
hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA
nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya,
struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak
memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear
dan memiliki protein histon.
DNA merupakan materi hereditas yang terdiri dari tiga komponen kimia yaitu fosfat,
deoksiribosa dan basa nitrogen (adenine, guanine, timin dan sitosin). DNA adalah molekul
yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat
dengan mata. Tetapi DNA dapat diekstrak dari ribuan sel sehingga DNA dapat terlihat karena
jumlahnya yang sangat banyak. Tahapan dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel,
keluarnya DNA dari nukleus dan pengendapan/presipitasi DNA. Ekstraksi DNA memiliki
banyak aplikasi praktis, diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sitematik,
konservasi, dan lain-lain. Proses isolasi DNA dari sel merupakan tahap awal dari berbagai
prosedur laboratorium dibidang bioteknologi, dengan memisahkan DNA dari substansi yang
tidak diinginkan dari sel.
DNA dapat diisolasi baik dari sel tubuh manusia, hewan maupun tumbuhan. DNA
manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus
lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan
karbon dioksida). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih
dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada
tumbuhan juga dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan bawang merah (Allium cepa) dan
pada pisang (Musa sp).
Setiap percobaan manipulasi gen membutuhkan sumber asam nukleat yang
membentuk DNA atau RNA. Metode yang sesuai merupakan hal penting dalam isolasi
komponen tersebut di dalam sel. Tiga konsep dasar yang harus dilakukan adalah (1)
pembukaan sel pada sampel untuk mengeluarkan asam nukleatnya, (2) memisahkan asam
nukleat dari komponen sel yang lain, dan (3) pemurnian asam nukleat. Isolasi fragmen DNA
spesifik dari genom suatu organisme dapat digunakan untuk menentukan sekuens basa dan
mengetahui fungsinya. Molekul DNA harus memenuhi kriteria diantaranya adalah memiliki
kestabilan, mampu bereplikasi dan dapat bermutasi sehingga struktur dari DNA akan
menentukan fungsinya.
Semua organisme hidup memiliki gen sehingga organisme tersebut dapat memiliki
DNA yang dapat diekstrak. Tahapan pertama yang harus dilakukan untuk mengisolasi DNA
adalah dengan merusak sel terlebih dahulu. Perusakan sel tersebut dapat dilakukan dengan

cara mekanik yaitu diblender atau dapat juga menggunakan bahan kimia untuk mendegradasi
dan melarutkan komponen dinding sel. DNA akan terpisah menjadi suatu larutan dan dapat
dimurnikan (dipurifikasi) melalui dua cara yang umum dilakukan yaitu sentrifugasi dan
ekstraksi kimia. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan yang tinggi sehingga komponen
yang berukuran lebih besar atau lebih berat akan mengendap membentuk sedimen pada
bagian bawah tabung. DNA dan komponen lain yang berukuran lebih besar akan mengendap
pada bagian bawah dan hasil kontaminan dari perusakan dinding sel berada pada bagian
suspense. DNA tersebut kemudian dilarutkan kembali dengan kondisi yang masih bercampur
dengan protein dan RNA.
Setelah memperoleh DNA, perlu diketahui konsentrasi dari DNA tersebut. Hal itu
dapat dilakukan dengan penentuan konsentrasi secara kualitatif yaitu dengan menggunakan
elektroforesis dan secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometri spektrum UV.
Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan dan purifikasi fragmen DNA, RNA,
atau protein. Prinsip dasar dari elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan
perbedaan sifatnya, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik
yang berberda-beda.
Elektroforesis DNA biasanya digunakan untuk memisahkan DNA berdasarkan
perbedaan ukurannya. Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebutfase
diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi menyaring objek yang akan dipisah,
sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali
ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek
elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat
elektroforesis gel.
Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisi elektroda
negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak
dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda,
tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah.
Ada dua alternatif macam gel untuk pemisahan DNA yaitu poliakrilamida dan
agarosa. Poliakrilamida memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel
poliakrilamida dapat memisahkan DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi
gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA satu sama lainnya yang berbeda ukurannya hanya
beberapa atau bahkan satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa
ratus pasang basa saja (dibawah 1000 pasang basa). Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih
rendah tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa.
Agarose merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut. Ukuran pori agarose sesuai
untuk pemisahan polimer asam nukleat yang tersusun dari ratusan nukleotida. DNA yang
berukuran sangat panjang tidak dapat melewati pori gel bahkan pori gel agarosa. DNA yang
sangat besar melewati matriks dengan satu ujung bergerak lebih dulu sedang ujung lainnya
mengikuti. Akibatnya DNA diatas ukuran tertentu (30 -50 kb) bermigrasi dengan jarak yang
sama sehingga tidak dapat diamati pemisahannya. DNA yang sangat panjang ini dapat

dipisahkan satu sama lainnya jika daerah listrik diaplikasikan dalam pulses yang berasal
secara orthogonal satu sama lainnya.
Skema Elektroforesis

Tingkat migrasi DNA saat dielektroforesis pada gel agarosa tergantung pada ukuran
DNA, bentuk DNA, konsentrasi gel agarosa, tegangan listrik elektroforesis, dan buffer
elektroforesis. Mobilitas DNA berat molekul besar lebih rendah daripada DNA dengan berat
molekul kecil. Konsentrasi gel agarosa dan tegangan listrik yang digunakan disesuaikan
dengan berat molekul fragmen DNA yang akan dipisahkan. Molekul yang tidak terlarut, di
dalam medan listrik akan berpindah dengan kecepatan yang diketahui berdasarkan rasio
massanya. Contohnya, apabila terdapat dua molekul yang memiliki bentuk dan massa yang
identik, salah satu molekul yang memiliki muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat
menuju elektroda.
Proses elektroforesis ini juga dapat diketahui dengan adanya loading dye yang
dicampurkan pada sampel DNA dan dimasukkan ke dalam sumur. Menurut Bowen (2000)
loading dye merupakan pewarna pelacak yang ikut bermigrasi di sepanjang gel, bermuatan
negatif seperti DNA dan berfungsi sebagai petunjuk seberapa jauh proses elektroforesis
berlangsung. Larutan etidium bromide ditambahkan ke dalam gel digunakan untuk dapat
memvisualisasi DNA di bawah sinar UV. Menurut Bowen (2000) etidium bromide
merupakan pewarna fluorescent yang dapat mengikat basa-basa asam nukleat (untuk
mewarnai asam nukleat). Penambahan EtBR ini dapat dilakukan saat pembuatan gel ataupun
merendam gel dalam larutan EtBr (ethidium bromide).
(A)
(B)

(A) perangkat elektroforesis dan (B)Visualisasi hasil elektroforesis


Pengukuran secara kuantitatif DNA dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer
UV. Spektrofotometri merupakan metode analisis berdasarkan pengukuran banyaknya energi
radiasi yang diabsorpsi oleh suatu zat sebagai suatu fungsi panjang gelombang. Teknik
spektrofotomeri pada daerah ultra violet biasa disebut spektrofotometri UV. Spektroskopi UV
paling banyak digunakan dalam analisis biologis. Dari spectrum absorpsi dapat diketahui

panjang gelombang dengan absorbans maksimum dari suatu unsur atau senyawa. Analisis
protein biasa dilakukan dengan pengukuran langsung pada panjang gelombang 280 nm.
Gambar spektrofotometer GeneQuant

Metode Spektrofotometri digunakan untuk melihat kemurnian dan konsentrasi DNA


dimana DNA memiliki nilai absorbansi maksimal pada panjang gelombang 260 nm ( 260
nm) sedangkan protein memiliki absorbansi maksimal pada panjang gelombang 280 nm (
280 nm). Kemurnian DNA diketahui dari nilai rasio absorbansi DNA pada 260 nm dengan
280 nm (A260/A280). Nilai rasio untuk DNA untai ganda murni yaitu 1,8-2,0. Nilai rasio
dibawah 1,8 menunjukkan adanya kontaminan senyawa berat molekul besar misalnya
protein. Nilai rasio diatas 2,0 menunjukkan adanya kontaminan senyawa berat molekul kecil
misalnya RNA. Hubungan antara absorbansi DNA pada 260 nm (A260) dengan konsentrasi
DNA ([DNA]) yaitu A260 = 260.[DNA] dimana 260 adalah extinction coefficient pada
260. Nilai koefisien DNA untai ganda sebesar 0,02/ug.cm pada pengukuran di pH netral
atau sedikit basa. Sehingga jika A260 adalah 1 maka [DNA] sebesar 1/0,02 = 50 ug/ml.
Sehingga [DNA] = A260.50 ug/ml.

Nur, M. Anwar dan Adijuana, Hendara. 1989. Terknik Spektroskopi Dalam Analisis Biologi. Bogor:
Departemen Pendidikan dan Kebudayaan IPB.
Jusuf, Muhammad. 2001. Genetika I. Jakarta: CV. Sagung Seto.