Anda di halaman 1dari 16

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL

ANALISA PROFIL HEAT-ACID STABLE PROTEINS PADA SERUM MENGGUNAKAN SDS-PAGE

Tanngal

: 26 November 2014

Nama

: Alvita Khoridatul Bahiya

NIM

: 135090107111011

Kelompok

: 5

PJ ASISTEN

: Regina Putri

Kelompok : 5 PJ ASISTEN : Regina Putri LABORATORIUM FISIOLOGI TUMBUHAN, KULTUR JARINGAN, DAN

LABORATORIUM FISIOLOGI TUMBUHAN, KULTUR JARINGAN, DAN MIKROTEHNIK JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYA

2014

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Dasar Teori Asam amino jika bergabung dengan ikatan kovalen dan ikatan peptida maka akan menjadi protein. Ikatan peptida adalah ikatan amida yang dibentuk antara ikatan asam karboksilat asam amino yang satu dengan gugus amina asam amino yang lain. Setiap asam amino mengandung paling tidak satu gugus amina dan satu gugus asam karboksilat. Dan juga mungkin dapat terjadi ikatan peptida antara gugus asam karboksilat valin dengan gugus amina glisin sehinga akan menghasilkan valilglisin. Sedangkan protein dapat terbentuk dari ratusan asam amino yang berhubungan dengan ikatan peptida untuk membentuk sebuah rantai

peptida.

disebut dengan ikatan primer, dimana terdapat satu gugusan asam amino bebas pada ujung yang satu dan satu gugusan karboksil pada ujung yang lain (Lis,2001). Protein memiliki sifat yang berbeda-beda tergantung dengan jumlah dan jenis asam amino yang membentuk molekul protein tersebut. Dan juga tergantung pula dengan struktur dan urutan asam amino yang terdapat dalam rantai molekul protein. Berdasarkan dengan besarnya molekul protein maka protein dalam air tidak berbentuk larutan murni, melainkan merupakan suatu dispersi koloidal molekul protein tidak dapat melalui membran semipermiabel, tetapi protein dapat menimbulkan tekanan osmosa, yaitu dapat menimbulkan suatu potensial pada membran semipermiabel (Winarno,2007). Pada titik isolistrik protein mempunyai muatan positif dan negatif yang sama, sehingga tidak bergerak ke arah elektroda positif maupun negatif apabila ditempatkan di antara kedua elektroda tersebut. Protein mempunyai titik isolistrik

Ikatan peptida yang mengikat asam-asam amino dalam molekul protein

yang berbeda-beda. Pada pH di atas titik isolistrik protein bermuatan negatif, sedangkan di bawah titik isolistrik, protein bermuatan positif. Titik isolistrik pada albumin adalah pada pH 4,55-4,90 (Khopkar,2007). Denaturasi merupakan suatu proses dimana ikatan-ikatan terpecah-pecah sepeti pada ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya

lipatan molekul protein.

Denaturasi protein adalah suatu keadaan telah terjadinya

perubahan struktur protein yang mencakup perubahan bentuk dan lipatan molekul.

Denaturasi pada protein meliputi gangguan dan kerusakan yang mungkin terjadi

pada struktur sekunder dan tersier protein.

proses presipitasi dan koagulasi protein.

panas dan alkohol. Redenaturasi adalah denaturasi protein yang berlangsung secara reveresibel (Girinda,2000). Analisa profil pita protein serum menggunakan metode SDS-PAGE. Terdapat tiga tahapan yakni preparasi sampel, pembuatan gel (stacking gel dan separating gel) dan running gel. Sampel serum debanyak 15 μl ditambah dengan 15 μl RSB (reducing sample buffer) didenaturasi pada air dengan suhu 100oC selama 5 menit. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam sumuran masing-masing dengan jumlah yang sama. Running dilakukan pada tegangan arus listrik sebesar 30 mA dan 130 V

Koagulasi adalah denaturasi protein akibat

arus listrik sebesar 30 mA dan 130 V Koagulasi adalah denaturasi protein akibat Denaturasi yang umum

Denaturasi yang umum ditemui adalah

selama 1-2 jam. Proses running dihentikan jika warna penanda (tracking dye) berada pada kurang lebih 0,5 cm dari batas bawah casting gel. Gel kemudian dipindahkan pada wadah dan dituangi dengan pewarna (staining) selama 30-60 menit sambil digoyang. Gel kemudian direndam dalam larutan destaining selama 30 menit. Gel didokumentasi menggunakan scanner (Fatchiyah, dkk, 2012).

1.2 Tujuan Adapun tujuan dari praktikum kali ini adalah “untuk menganalisa adanya heat- acid stable protein pada serum menggunakan SDS-PAGE”.

BAB II

METODOLOGI

2.1 Waktu dan Tempat Praktikum kali ini yang berjudul “Analisa Profil Heat-Acid Stable Pada Serum Menggunakan SDS-PAGE” di lakukan pada hari selasa tanggal 26 November 2014 yang bertempat di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Kultur jaringan,dan mikrotehnik,. Jurusan Biologi,. Fakultas Matematika dan ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijay,. Malang.

2.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah tabung eppendorf, mikropipet dan tip, water bath, electrophoresis aparatus, dan refrigerated centrifuge. Sedangkan bahan yang digunakan pada praktikumkali ini meliputi serum, asam asetat 0,2M, reducing sampel bufer (RSB), phosphat buffer pH 7,4, kertas lakmus, reagen-reagen untuk SDS-PAGE, coomise staining dan destening.

2.3 Cara Kerja Disiapkan Electrophoresis apparatus, kemudian disiapkan 5 buah tabung eppendorf dan label dengan angka 1,2,3, dan 4. Diambil serum sebanyak 10 µl dan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 1 dan ditambahkan 20 µl phosphat dan 30 µl RSB. Diambil serum sebanyak 1000 µl menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 2, kemudian dimasukkan dalam water bath suhu 100°C selama 5 menit. Sentrifus tabung eppendorf 2 pada 27.000 g selama 15 menit. Diambil 30 µl supernatan dan dipindahkan ke tabung eppendorf 3, kemudian tambahkan 30 µl RSB. Ditambahkan 30 ml phosphat bufer ke dalam tabung eppendorf 2 dan homogenkan dengan cara pipeting. Diatur pada pH (digunakan kertas lakmus) menggunakan 200 µl asam asetat 0,2 M, diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Disentrifus tabung eppendorf 2 pada 27.000 g selama 15 menit. Diambil 30 µl supernatan dan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf 4 dan ditambahkan 30 µl RSB. Dimasukkan tabung eppendorf 1,2,3 dan 4 ke dalam water bath 100° selama 5 menit. Diaplikasikan 20 µl ke dalam semuran gel elektroforesis. Sesudah gel diwarnai dengan coomassie, diamati posisi atau pita (band) protein yang berbentuk dan dibandingkan dengan kontrol (sebelum perlakuan panas dan asam pada tabung eppendorf 1).

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Analisa Prosedur Serum yang digunakan pada praktikum ini adalah serum manusia (human) dan serum rat (tikus). Prosedur pertama yang dilakukan yaitu Menyiapkan 5 tabung reaksi sebagai tempat larutan, setelah itu serum diambil sebanyak 10 µl dan dimasukkan tabung eppendorf 1 ditambahkan 20 µl pohosphat bufer dan 30 µl RSB untuk mempertahankan stabilitas protein, setelah protein telarutkan serum diambil 50 µl dimasukkan ke tabung 2 dan dimasukkan water bath 100°C selama 5 menit untuk menguji protein terhadap ketahanan suhu tinggi. Kemudian tabung 2 disentrifugasi 13.000 rpm selama 15 menit untuk memisahkan protein yang stabil dan yang telah terdenaturasi atau untuk memisahkan protein yang tahan panas dan tidak tahan panas. Supernatan 30 µl dipindah ke tabung 3 ditambah 30 µl RSB untuk mempertahankan stabilitas protein yang stabil. Ditambah 30 µl phosphat bufer ke tabung 2 dan di pipeting untuk menstabilkan pH protein dan menghomogenkan. Diatur pada pH 5 menggunakan 200 µl asam asetat 0,2 M diinkubasi di suhu ruang selama 30 menit, hal ini bertujuan untuk mengkondisikan larutan pada kondisi asam dan menfasilitasi terjadinya reaksi optimal pada suhu ruang, setelah diperoleh protein tahan panas dengan asam dan tahan panas tidak tahan asam, tabung 2 disentrifugasi pada 27.000 g selama 15 menit untuk memisahkan protein yang terdenaturasi dan yang stabil. Dihasilkan supernatan dengan protein tahan panas dan asam dan pelet dengan protein tahan panas dan tidak tahan asam. 30 µl supernatan diambil dan dipindahkan ke tabung 4 kemudain ditambah 30 µl RSB untuk mempertahankan stabilitas protein yang stabil, diperoleh protein yang tahan panas dan asam stabil. Tabung 1,3 dan 4 dimasukkan water bath 100 °C selama 5 menit untuk mengkondisikan protein dalam suhu yang tinggi. 20 µl diaplikasikan ke dalam sumuran gel elektroforesis untuk mewarnai gel dengan comassie, setelah comassie mewarnai gel, posisi atau pita protein yang terbentuk diamati dan dibandingkan dengan perlakuan kontrol. Prinsip yang digunakan pada elektroforesis yaitu memisahkan protein berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid. Protein terseparasi dalam medan listrik dilanjutkan dengan pewarnaan, penghilangan warna dan pembilasan gel. Pembacaan berat molekul dapat dilakukan dengan melihat pita yang terbentuk oleh marker.

Gambar 1 . Elektroforesis vertikal untuk analisis protein ( Singgih, 2014). Elektroforesis adalah suatu proses

Gambar 1. Elektroforesis vertikal untuk analisis protein (Singgih, 2014). Elektroforesis adalah suatu proses migrasi molekul bermuatan di dalam suatu media yang bermuatan listrik, dimana kecepatan migrasinya tergantung pada muatan, ukuran dan bentuk setiap molekul yang terlibat. Pada saat arus listrik dibiarkan, molekul bermigrasi melalui media (biasanya berupa gel), molekul yang kecil akan bermigrasi lebih cepat daripada yang besar, sehingga akan terjadi pemisahan (Singgih, 2014). Analisa profil pita protein serum menggunakan metode SDS-PAGE. Terdapat tiga tahapan yakni preparasi sampel, pembuatan gel (stacking gel dan separating gel) dan running gel. Sampel serum debanyak 15 μl ditambah dengan 15 μl RSB (reducing sample buffer) didenaturasi pada air dengan suhu 100oC selama 5 menit. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam sumuran masing-masing dengan jumlah yang sama. Running dilakukan pada tegangan arus listrik sebesar 30 mA dan 130 V selama 1-2 jam. Proses running dihentikan jika warna penanda (tracking dye) berada pada kurang lebih 0,5 cm dari batas bawah casting gel (Fatchiyah, dkk, 2012). Gel kemudian dipindahkan pada wadah dan dituangi dengan pewarna (staining) selama 30-60 menit sambil digoyang. Gel kemudian direndam dalam larutan destaining selama 30 menit. Gel didokumentasi menggunakan scanner (Fatchiyah, dkk, 2012).

3.2. Analisa Hasil 3.2.1. Hasil Pengamatan Setelah melakukan praktikum didapatkan hasil pengamatan pada sampel sebagai berikut:

didapatkan hasil pengamatan pada sampel sebagai berikut: Gambar 2. Hasil Pengamatan SDS-Page Protein Berdasarkan

Gambar 2. Hasil Pengamatan SDS-Page Protein

Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan. Dari perlakuan H1 diperoleh beberapa protein dengan berat molekul 15 kDa, 17 kDa, 25 kDa, 76 kDa dan 99 kDa. Untuk perlakuan H3 diperoleh beberapa protein dengan berat molekul 15 kDa, 17 kDa, 25 kDa, 76 kDa, 80 kDa, 95 kDa dan 125 kDa. Pada perlakuan H4s diperoleh hanya 2 protein dengan berat molekul 85 kDa dan 95 kDa. Pada perlakuan H4p ditemukan beberapa protein dengan berat molekul 25 kDa, 85 kDa, 100 kDa, dan 125 kDa. Sedangkan untuk perlakuan R1 diperoleh protein dengan berat molekul 25 kDa dan 95 kDa, untuk pelakuan R3 diperoleh protein dengan berat molekul sebesar 25 kDa, 65 kDa, 80 kDa, 95 kDa, dan 100 kDa. Pada perlakuan R4s diperoleh protein dengan berat molekul 80 kDa, dan 95 kDa, lalu pada perlakuan R4p ditemukan protein dengan berat molekul 17 kDa, 25 kDa, 76 kDa, 85 kDa, dan 95 kDa. Pada perlakuan M tidak terlihat adanya pita protein, yang mana hal ini ditunjukkan dengan adanya band band biru yang nampak usai pewarnaan dengan menggunakan CBB.

Gambar 3 . SDS-Page Protein pada manusia (Abcam,2014). SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan detergen anionik,

Gambar 3. SDS-Page Protein pada manusia (Abcam,2014).

SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan detergen anionik, yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan negatif dalam range pH yang luas. Fungsi utama SDS pada metode SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis) yaitu untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein, mempermudah menyamakan kondisi, dan menyederhanakan protein (bentuk, ukuran, dan muatan). Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian stuktur kompleks protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada suatu medan listrik (Anam,2009). Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) adalah suatu teknik pemisahan molekul-molekul protein berdasarkan perbedaan berat masing-masing. Prinsip dari SDS PAGE adalah dengan memanfaatkan perbedaan kemampuan migrasi masing-masing molekul protein. Kemampuan migrasi tiap molekul akan berbeda disebabkan perbedaan berat molekul protein (Davis,2004: Campbell,2002). Terdapat perbedaan metode elektroforesis dengan mtode SDS- PAGE. Elektroforesis menggunakan gel agarosa sebagai medium. SDS-PAGE menggunakan gel berupa gel poliakrilamid. Sifat dari gel agarosa non- toxic sementara pada gel poliakrilamid adalah neurotoxic atau bersifat racun syaraf. Gel agarosa memiliki pori yang lebih besar daripada gel poliakrilamid. Selain gel, komponen yang digunakan dalam metode SDS-PAGE dan elektroforesis juga berbeda. Komponen yang digunakan dalam SDS-PAGE antara lain adalah SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) dan gel poliakrilamid (Seidman & Moore 2000). Elektroforesis gel merupakan elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fasediam untuk memisahkan molekul-molekul seperti DNA dan protein menjadi pita- pita yang masing-masing terdiri atas molekul-molekul dengan panjang yang sama. Elektroforesis gel merupakan teknik memisahkan suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel yang dibantu dengan tenaga listrik. Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan laju

perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Media atau gel yang dapat digunakan yaitu agarose gel (elektroforesis DNA) dan poliakrilamid gel (elektroforesis protein). Laju pergerakan molekul dipengaruhi oleh ukuran molekul, konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis (Martin, 2006). Protein dengan berat molekul 151,4 kDa diduga sebagai heat shock protein. Heat shock protein merupakan protein yang disintesis untuk melindungi sel dari kerusakan. Menurut Park dkk., (2003) heat shock protein dengan berat 151,4 kDa merupakan oxygen-regulated protein 150 (ORP-150), protein ini memiliki berat molekul berkisar antara 150-170 kDa jika dianalisa dengan menggunakan SDS- PAGE. Oxygen-regulated protein 150 (ORP-150) dikenal juga sebagai glucose- regulated protein (GRP170) dan Hyou1 yang merupakan anggota dari family protein heat shock 70 yang pembentukannya di retikulo endoplasma dan mitokondria. Heat shock protein adalah suatu protein yang dihasilkan karena adanya heat shock response. Heat shock respon berfungsi sebagai tanggapan sel terhadap gangguan yang bersifat fisiologik dan gangguan yang berasal dari lingkungan (Snoeck dkk.,

2011).

Pola pita protein sel mikrobia pada Poly Acrilamid Gel Eelectrophoresis (PAGE) bersifat spesifik dan reprodusibel. Protein didenaturasi dengan menggunakan panas atau deterjen, dan untuk menghasilkan subunit polipeptida yang kemudian dapat dipisahkan dalam elektroforesis berdasarkan berat molekulnya. Agar diperoleh hasil yang maksimal, maka kultur bakteri yang akan dianalisis ditumbuhkan terlebih dahulu dalam medium kaya dan dilakukan pemanenan sel pada akhir fase eksponensial atau awal fase stasioner (Laemli,200). Pita-pita bisa terbentuk atau nampak disebabkan karena adanya sejumlah partikel sampel yang tersangkut pada titik-titik tertentu dalam gel akibat adanya muatan listrik pada sampel yang bergerak menuju katoda. Partikel yang memiliki berat molekul sama akan terakumulasi di titik yang sama, sehingga membentuk beberapa pita dengan panjang berbeda yang terpisah berdasarkan berat molekulnya

(Hames,2004).

Ketebalan pita yag berbeda tidak menunjukkan adanya berat molekul protein yang berbeda tetapi jumlah protein yang termigrasi yang berbeda kandungan/kuantitas proteinny, pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan konsentrasi atau banyaknya protein yang memiliki berat molekul sama yang berada pada posisi pita yang sama. Semakin tinggi konsentrasi sampel semakin tebal pita yang terbentuk. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan,yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Supriyadi, 2006). Protein-protein tersebut dapat terpisah karena adanya proses separasi pada protein memisahkan molekul-molekul protein menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul protein dengan panjang yang sama. Protein dapat terpisah dengan cara memberi gaya pada protein tersebut untuk melewati medium berisi gel (poliakrilamid) yang dibantu dengan adanya listrik. Protein yang bermuatan listrik

ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul dari protein akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Pemisahan molekul protein berdasarkan pada tingkat migrasi dan berat molekulnya dalam sebuah medan listrik (Wibowo,2010). Cara mengidentifikasi jenis protein yang membentuk pita pada gel elektroforesis yaitu dengan membandingkan posisi pita sampel dengan pita pada jalur marker/standar yang telah diketahui berat molekulnya. Marker atau penanda merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda yang dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul (Martin,2006). Metode SDS-PAGE telah dibuktikan mampu membedakan sejumlah besar strain bakteri karena memiliki tingkat resolusi diskriminatif sampai level spesies dan subspesies atau antar strain dalam satu spesies. Metode ini juga terbukti memiliki kesesuaian dengan metode hibridisasi DNA-DNA. Nilai similaritas yang diperoleh dari SDS-PAGE cenderung sama dengan nilai similaritas hasil hibridisasi DNA sebesar 70 % (Towne & Cockayne,2005; Vandamme, 2006).

BAB IV

PENUTUP

4.1. Kesimpulan Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa pada serum manusia (human) dan rat (tikus) didapatkan beberapa protein dengan berat molekul seperti pada perlakuan H1 diperoleh beberapa protein dengan berat molekul 15 kDa, 17 kDa, 25 kDa, 76 kDa dan 99 kDa. Untuk perlakuan H3 diperoleh beberapa protein dengan berat molekul 15 kDa, 17 kDa, 25 kDa, 76 kDa, 80 kDa, 95 kDa dan 125 kDa. Pada perlakuan H4s diperoleh hanya 2 protein dengan berat molekul 85 kDa dan 95 kDa. Pada perlakuan H4p ditemukan beberapa protein dengan berat molekul 25 kDa, 85 kDa, 100 kDa, dan 125 kDa. Sedangkan untuk perlakuan R1 diperoleh protein dengan berat molekul 25 kDa dan 95 kDa, untuk pelakuan R3 diperoleh protein dengan berat molekul sebesar 25 kDa, 65 kDa, 80 kDa, 95 kDa, dan 100 kDa. Pada perlakuan R4s diperoleh protein dengan berat molekul 80 kDa, dan 95 kDa, lalu pada perlakuan R4p ditemukan protein dengan berat molekul 17 kDa, 25 kDa, 76 kDa, 85 kDa, dan 95 kDa.

4.2. Saran Praktikum selanjutnya diharapkan agar praktikan lebih tertib lagi dalam melaksanakan praktikum dan sebaiknya saat melakukan peraktikum atau pengamatan dilakukan oleh semua praktikan agar semua praktikan dapat mengerti tujuan dari praktikum tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

Campbell, Neil .A., J.B. Reece, L.G. Mitchell. 2002. Biologi. Penerbit Erlangga. Jakarta. Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 2004. Basic methods: Molecular biology. 2nd ed. Appleton & Lang. Norwola. Fatchiyah,. S. Widyarti, E. L. Arumningtyas., dan S. Permana. 2012. Buku Praktikum Teknik Analisis Biologi Molekuler. Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Brawijaya. Girinda, A. 2000. Biochemistry. Printia Hall. New York. Khopkar S. 2007.Konsep Dasar Biokimia. Universitas Indonesia. Jakarta. Lis Sopya,M.eng. Malcom P. Steven. 2001. Kimia Polimer. Erlangga. Jakarta. Laemmli UK. 2000. Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of The Head of Bacteriophage T4. Nature.362-368. Martin, R. 2006. Gel Electroforesis: Nucleid Acids . Oxford: Bros Scientific Publishers Ltd. Park, J., D. P. Easton., X. Chen., I. J. MacDonald., X. Y. Wang., and J. R. Subjeck. 2003. The Chaperoning Properties of Mouse grp170 , A Member of The Third Family of hsp70 Related Proteins. Biochemistry 42: 14893-14902. Seidman, L.A. & C.J. Moore. 2000. Basic laboratory for biotechnology: Textbook and Laboratory Reference. Prentice Hall, Inc., New Jersey. Singgih, Marlia, W.2014. Elektroforesis. School Of Pharmacy ITB pdf. Diakses tanggal 25 November 2014. Snoeck, L. H. E. H., R. N. Cornelussen., Van Nieuwenhoven, R. S. Reneman., and Van der Vusse. 2001. Heat Shock Protein and Cardiovascular Pathophysiology. Physiological Rev ; 81(4): 1461-85. Supriyadi. 2006. Keanekaragaman Genetik Populasi Wereng Hijau, Nephotettix virescens Asal Wilayah Endemi dan Nonendemi Virus Tungro Padi. Disertasi. Universitas Gajah Mada Yogyakarta. Towner KJ, & Cockayne A, 2005. Molecular Methods for Microbial Identification and Typing. Chapman & Hall. London. Vandamme P, Pot B, Gillis M, De Vos P, Kersters K, & Swings J, 2006. Polyphasic Taxonomy, a Concensus Approach to Bacterial Systematics. Microbiology Review. 60:407-438. Winarno, F.G. 2007. Kimia Pangan Dan Gizi. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

LAMPIRAN

LAMPIRAN