Anda di halaman 1dari 25

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat Pelaksanaan Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi Fakultas

Farmasi USU dan Balai Laboratorium Kesehatan Daerah Provinsi Sumatera

Utara, di jalan Wiliem Iskandar Pasar V Barat I No. 4 Medan.

3.2 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimental. Dengan tahapan

meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, karakterisasi simplisia, skrining

fitokimia, pembuatan ekstrak n-heksan, etilasetat, dan etanol, serta uji aktivitas

antibakteri secara in vitro dengan metode difusi agar menggunakan pencetak

lubang (punch hole) terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis, Escherichia coli dan Salmonella typhi.

3.3 Alat dan Bahan

3.3.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, autoklaf

(Fisons), blender (Philips), bola karet, desikator, cawan porselen berdasar rata,

freeze dryer (Modulio), inkubator (Fiber Scientific), jangka sorong, jarum ose,

Laminar Air Flow Cabinet (Astec HLF 1200L), lemari pendingin (Toshiba),

mikroskop, neraca kasar (Sun), neraca listrik (Vibra AJ), oven (Memmert),

penangas air (Yenaco), pinset, pipet mikro (Eppendorf), rotary evaporator

(Haake D), silinder logam, alat maserasi, alat destilasi air, kertas perkamen,

aluminium foil, kertas saring, tissu dan kapas steril.

22

Universitas Sumatera Utara

3.3.2

Bahan

Bahan penelitian yang digunakan adalah daun kembang bulan, etanol

96% (teknis), etanol 70% (teknis), air suling, suspensi Mc. Farland, Mueller

Hinton Agar (Difco), Nutrient agar (Difco), larutan Nutrien Broth (Difco),

aquadest

steril,

biakan

bakteri

Staphylococcus

aureus

ATCC

25923,

Staphylococcus epidermidis ATCC 25924, Eschericia coli ATCC 25922 dan,

Salmonella typhi ATCC 25925.

Bahan kimia yang digunakan adalah berkualitas pro analisa yaitu £ naftol,

asam klorida pekat, toluena, asam asetat anhidrida, asam asetat glasial, asam

nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi (III) klorida, bismut (III) nitrat,

etanol, etilasetat, n-heksan, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat,

kloroform,

metanol,

natrium

hidroksida,

natrium

klorida,

natrium

sulfat

anhidrat, raksa (II) klorida, serbuk magnesium dan timbal (II) asetat.

3.4 Penyediaan sampel

3.4.1 Pengumpulan bahan

Sampel

yang

digunakan

adalah

daun

kembang

bulan

(Tithonia

diversifolia

(Hemsley)

A.

Gray)

yang

diperoleh

dari

Kecamatan

Siborong-borong,

Kabupaten

Tapanuli

Utara,

Provinsi

Sumatera

Utara.

Pengambilan sampel dilakukan secara purposive yaitu tanpa membandingkan

dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain.

3.4.2 Identifikasi sampel

Identifikasi sampel dilakukan oleh “Herbarium Bogoriense”, Bidang

Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor.

23

Universitas Sumatera Utara

3.4.3

Pengolahan bahan

Daun kembang bulan dibersihkan dari kotoran dengan cara mencuci di

bawah air mengalir hingga bersih dan ditiriskan, lalu ditimbang berat basah,

kemudian dikeringkan dalam lemari pengering pada suhu 40-50 0 C. Daun

kembang bulan dianggap kering apabila sudah rapuh, lalu ditimbang berat

kering. Selanjutnya sampel diserbukkan dengan menggunakan blender, lalu

disimpan dalam wadah plastik di tempat yang terlindung dari cahaya sebelum

digunakan.

3.5 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia

3.5.1 Pemeriksaan organoleptik

Pemeriksaan secara organoleptik meliputi pemeriksaan warna, bau dan

rasa dari daun segar dan simplisia daun kembang bulan.

3.5.2 Pemeriksaan makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar

dari

daun

segar

dan

simplisia

daun

kembang

Lampiran 2, halaman 54-55.

bulan,

3.5.3 Pemeriksaan mikroskopik

dapat

dilihat

pada

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun segar dan serbuk

simplisia. Daun segar dipotong tipis secara melintang, kemudian letakkan di

atas kaca preparat lalu diteteskan larutan kloralhidrat dan dipanaskan diatas api

bunsen

kemudian

ditutup

dengan

kaca

penutup

dan

diamati

di

bawah

mikroskop.

Pemeriksaan

mikroskopik

dilakukan

terhadap

serbuk

simplisia dengan

cara menaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi

24

Universitas Sumatera Utara

dengan

kloralhidrat

dan

ditutup

dengan

kaca

penutup,

kemudian

dilihat

dibawah

mikroskop.

Pemeriksaan

mikroskopik

dilakukan

terhadap

daun

kembang bulan segar dan serbuk simplisia untuk melihat struktur anatomi

tumbuhan tersebut secara lengkap, dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 56.

3.5.4 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi (Destilasi

Toluena). Alat meliputi labu alas 500 ml, alat penampung, tabung penerima 5

ml berskala 0,05 ml, pendingin, tabung penyambung, pemanas.

Cara kerja: Kedalam labu alas bulat di masukkan 200 ml toluen dan 2 ml air

suling, destilasi selama 2 jam, biarkan menjadi dingin selama 30 menit dan

volume air dalam tabung penampung dibaca. Selanjutnya ke dalam labu

dimasukkan 5 gram serbuk simplisia lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit.

Setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur yaitu 2 tetesan per detik

sampai

sebagian

air

terdestilasi,

kemudian

kecepatan

destilasi

dinaikkan

sampai 4 tetes per detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin

dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung

penampung dibiarkan dingin sampai sama dengan suhu kamar.

Setelah

air

dan

toluena

memisah

sempurna,

dibaca

volume

air

dengan

ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan

kandungan air di dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen

(WHO, 1992). Hasil dapat dilihat pada Tabel 4.2.1, halaman 39.

3.5.5 Penetapan kadar abu total

Sebanyak lebih kurang 2 g serbuk simplisia yang telah digerus dan

ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan

25

Universitas Sumatera Utara

ditara, kemudian diratakan. Krus dipijarkan pada suhu 600 0 C sampai arang

habis, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap.

Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes,

1989). Hasil dapat dilihat pada Tabel 4.2.1, halaman 39.

3.5.6 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam

Abu yang telah diperoleh dari penetapan kadar abu total dididihkan

dengan 25 ml asam klorida 2N selama 5 menit, bagian yang larut dalam asam

dikumpulkan, disaring melalui kertas

saring dipijarkan pada suhu 600 0 C

sampai bobot tetap, didinginkan kemudian ditimbang. Kadar abu yang tidak

larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara

(Depkes, 1989). Hasil dapat dilihat pada Tabel 4.2.1, halaman 39.

3.5.7 Penetapan kadar sari larut dalam air

Sebanyak

5

g

serbuk

simplisia

yang

telah

dikeringkan

diudara

dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air kloroform (2,5 ml kloroform dalam

air suling 1000 ml), dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama

6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring, sejumlah 20 ml

filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata

yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105 0 C sampai diperoleh bobot

tetap. Kadar sari yang larut di dalam air dihitung terhadap bahan yang telah

dikeringkan di udara (Depkes, 1989). Hasil dapat dilihat pada Tabel 4.2.1,

halaman 39.

3.5.8 Penetapan kadar sari larut dalam etanol

Sebanyak

5

g

serbuk

simplisia

yang

telah

dikeringkan

di

udara

dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96% dalam labu bersumbat

26

Universitas Sumatera Utara

sambil dikocok sesekali 6 jam pertama dan dibiarkan selama 18 jam dan

disaring. Sejumlah 20 ml filtrat ditara. Sisanya dipanaskan dalam oven pada

105 0 C sampai diperoleh bobot konstan kadar sari yang larut didalam air

dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara (Depkes, 1989). Hasil

dapat dilihat pada Tabel 4.2.1, halaman 39.

3.6 Pembuatan Larutan Pereaksi

Pembuatan

larutan

pereaksi

besi

(III)

klorida

1%,

Bouchardat,

Dragendorff, Mayer, Molish, asam klorida 2 N, asam sulfat 2 N, kloralhidrat,

natrium hidroksida 2 N, Liebermann-Bouchard (Timbal (II) asetat 0,4 M.

3.6.1 Besi (III) klorida 1%

Sebanyak 1 g besi (III) klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100

ml kemudian disaring.

3.6.2 Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air

suling, ditambahkan iodium sebanyak 2 g dan dicukupkan dengan air suling

hingga 100 ml.

3.6.3 Dragendorff

Sebanyak 0,85 g bismut (III) nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan

dalam 100 ml asam asetat glasial ditambahkan 40 ml air suling. Pada wadah

lain ditimbang 8 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling, lalu

campurkan kedua larutan sama banyak, ditambahkan 20 ml asam asetat glasial

dan diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.

27

Universitas Sumatera Utara

3.6.4

Mayer

Sebanyak 1,35 g raksa (II) klorida dilarutkan dalam 60 ml air suling.

Pada wadah lain

sebanyak 5 g kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml air lalu

campurkan keduanya dan ditambahkan air suling hingga 100 ml.

3.6.5 Molish

Sebanyak 3 g £-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam

nitrat 0,5 N hingga volume 100 ml. (Depkes, 1995)

3.6.6 Asam klorida 2 N

Sebanyak 17 ml asam klorida pekat dilarutkan dalam air suling hingga

volume 100 ml.

3.6.7 Asam sulfat 2 N

Sebanyak 5,4 ml asam sulfat pekat kemudian diencerkan dengan air

suling hingga 100 ml.

3.6.8 Natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling

hingga 100 ml.

3.6.9 Kloralhidrat

Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan dalam 20 ml air suling (Depkes,

1979).

3.6.10 Liebermann-Bouchard

Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 5 ml asam

sulfat pekat kemudian ditambahkan etanol hingga 50 ml (Harbone, 1987).

28

Universitas Sumatera Utara

3.6.11

Timbal (II) asetat 0,4 M

Sebanyak

15,17

g

timbal

(II)

asetat

dilarutkan

dalam

air

bebas

karbondioksida hingga 100 ml (Depkes, 1989).

3.7

Skrining Fitokimia

 

Skrining fitokimia terhadap simplisia dan ekstrak n-heksan, etilasetat

dan

etanol

daun

kembang

bulan

meliputi

pemeriksaan

senyawa

steroid/triterpenoid, alkaloida, glikosida, flavonoid, saponin, dan tanin.

3.7.1 Pemeriksaan steroid/triterpenoid

Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan

selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada

sisanya ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat

(pereaksi Liebermann-Burchard). Apabila terbentuk warna ungu atau merah

yang berubah menjadi biru hijau menunjukkan adanya steroid/triterpenoid

(Farnsworth, 1966).

3.7.2 Pemeriksaan Alkaloida

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml

asam klorida

2

N dan

9

ml

air suling, dipanaskan air selama 2 menit,

didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut :

b. Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer

c. Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat

d. Diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendrof

Alkaloida dianggap positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau tiga

dari percobaan diatas (Depkes, 1995).

29

Universitas Sumatera Utara

3.7.3

Pemeriksaan glikosida

Serbuk simplisia sebanyak 3 g, lalu disaring dengan 30 ml campuran

etanol 95% dengan air (7:3) dan 10 ml asam klorida 2N, direfluks selama 2

jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air

suling dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu

disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform

(2:3), dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan

pada temperatur tidak lebih dari 50 o C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol.

Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan

dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuapkan di atas penangas air. Pada sisa

ditambahkan

2

ml

air

dan

5

tetes

pereaksi

Molish.

Kemudian

secara

perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung,

terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan

adanya glikosida (Depkes, 1978).

3.7.4 Pemeriksaan flavonoid

Sebanyak 10 g serbuk simplisia kemudian ditambahkan 100 ml air panas,

dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, filtrat yang

diperoleh kemudian diambil 5 ml lalu di tambahkan 0,1 g serbuk Mg dan 1 ml

HCl pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok, dan dibiarkan memisah. Flavonoid

positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol

(Farnsworth, 1966).

3.7.5 Pemeriksaan Saponin

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam

tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan, kemudian

30

Universitas Sumatera Utara

dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang

stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes

asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin (Depkes, 1978).

3.7.6 Pemeriksaan tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling, disaring

lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2

ml larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 ttes pereaksi besi (III) klorida. Terjadi

warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin (Farnsworth,

1966).

3.8 Pembuatan

ekstrak daun kembang bulan (Tithonia diversifolia

(Hemsley) A. Gray).

Pembuatan

ekstrak

dilakukan

secara

perkolasi

berkesinambungan

menggunakan tiga pelarut. Cara kerja: sebanyak 250 gram serbuk simplisia

halus dimasukkan ke dalam wadah kaca dan dibasahi dengan n-heksan dalam

wadah tertutup rapat, kemudian dimaserasi selama 3 jam. Massa dipindahkan

sedikit demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan dengan

hati-hati, kemudian cairan penyari n-heksan dituangkan secukupnya sampai

cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan

penyari, perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Kran perkolator

dibuka dan diatur cairan menetes dengan kecepatan 1 ml/menit dan dipasang

reservoir penyari sehingga tetap dapat dipertahankan selapis cairan penyari

diatas serbuk simplisia sampai cairan yang keluar tidak berwarna lagi atau

cairan yang terakhir keluar bila diuapkan tidak meninggalkan sisa (Depkes,

2000). Perkolat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan alat rotary

31

Universitas Sumatera Utara

evaporator setelah itu diuapkan hingga diperoleh ekstrak kental dan ditimbang.

Kemudian

ampasnya

dikeringkan

lalu

diperkolasi

kembali

dengan

menggunakan

pelarut

berturut-turut

etilasetat

dan

etanol

70%,

prosedur

dilakukan sama seperti yang diatas.

3.9. Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan

terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan didalam oven pada

suhu 170°C selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C

selama 15 menit. Jarum ose dan pinset dengan lampu bunsen (Lay,1994).

3.10 Pembuatan Media

3.10.1Pembuatan Nutrient Agar

Komposisi:

Beef extract

3,0 g

Peptone

5,0 g

Agar

15,0 g

Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 23 g serbuk nutrient agar kemudian

disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit

demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali

diaduk sampai bahan larut sempurna dan jernih. Tutup erlenmeyer dengan

kapas yang dilapisi dengan aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada

suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit (Difco Laboratories, 1977).

3.10.2 Pembuata Muller Hinton Agar (MHA)

Komposisi:

Beef infusion from

300 g

Casein hydrolysate

17,5 g

32

Universitas Sumatera Utara

Starch

1,50 g

Bacto – Agar

17,0 g

pH = 7,4

Cara

pembuatan:

ditimbang

sebanyak

36

g

serbuk

MHA

kemudian

disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit

demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali

diaduk sampai bahan larut sempurna dan jernih. Tutup erlenmeyer dengan

kapas yang dilapisi dengan aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada

suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit (Difco laboratories, 1977).

3.10.3 Pembuatan Nutrient Broth (NB)

Komposisi:

Beef extract

3 g

Bacto Pepton 5 g

 

Ditimbang

sebanyak

8

gram

serbuk

nutrient

broth

kemudian

disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit

demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan sebentar sambil sekali-sekali diaduk

sampai terbentuk larutan jernih. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi

aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm

selama 15 menit (Difco Laboratories, 1977).

3.11 Pembuatan Suspensi Standar Mc. Farland

Suspensi

Standar

Mc.

Farland

adalah

suspensi

yang

menunjukkan

konsentrasi kekeruhan bakteri sama dengan 10 8 CFU/ml.

Komposisi:

Larutan Asam sulfat 1%

9,5 ml

Larutan Barium klorida

0,5 ml

33

Universitas Sumatera Utara

Cara pembuatan:

dicampur kedua larutan tersebut dalam tabung reaksi

dikocok dan dihomogenkan. Apabila kekeruhan suspensi bakteri uji adalah

sama dengan kekeruhan suspensi standar, berarti konsentrasi suspensi bakteri

adalah

10 6 CFU/ml (Power, 1988).

3.12

Pembiakan Bakteri

3.12.1

Pembuatan Stok Kultur Bakteri

Biakan bakteri Staphylococcus aureus dari strain utama diambil dengan

jarum ose steril dengan metode sinambung pada permukaan nutrien agar

miring, ditutup mulut tabung reaksi dengan kapas. Diinkubasi selama 18-24

jam

pada

suhu

37 o C.

Dilakukan

prosedur

yang

sama

terhadap

bakteri

Staphylococcus

epidermidis,

Escherichia

coli

dan

Salmonella

typhi

(Depkes, 1995).

 

3.12.2 Pembuatan Inokulum Bakteri

Bakteri Staphylococcus aureus hasil inkubasi diambil dengan jarum ose

steril lalu disuspensikan kedalam tabung yang berisi 10 ml larutan nutrien

broth steril, kemudian dihomogenkan hingga diperoleh kekeruhan suspensi

bakteri yang sama dengan kekeruhan suspensi standar Mc. Farland, ini berarti

konsentrasi suspensi bakteri adalah 10 8 CFU (Colony Forming Unit)/ml.

Setelah itu dilakukan pengenceran dengan memipet 0,1 ml biakan bakteri

(10 8 CFU/ml), dimasukkan kedalam tabung steril yang berisi larutan nutrien

broth sebanyak 9,9 ml dan dikocok homogen maka diperoleh suspensi bakteri

dengan konsentrasi 10 6 CFU/ml. Dilakukan prosedur yang sama terhadap

bakteri Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli dan Salmonella typhi

(Depkes, 1995).

34

Universitas Sumatera Utara

3.13

Pembuatan Larutan Uji dengan Berbagai Konsentrasi

3.13.1 Pembuatan larutan uji ekstrak n-heksan, etilasetat, dan etanol

Sebanyak 1 gram ekstrak n-heksan dilarutkan dengan pelarut n-heksan

hingga 2 ml maka konsentrasi ekstrak adalah 500 mg/ml kemudian dibuat

pengenceran. Selanjutnya larutan tersebut diencerkan kembali dengan ekstrak

n-heksan dengan konsentrasi 400 mg/ml; 300 mg/ml; 200 mg/ml; 100 mg/ml;

90

mg/ml; 80 mg/ml ; 70 mg/ml; 60 mg/ml; 50 mg/ml; 40 mg/ml; 30 mg/ml;

20

mg/ml; 10 mg/ml; 9 mg/ml; 8 mg/ml; 7 mg/ml; 6 mg/ml; 5 mg/ml; 4 mg/ml;

3 mg/ml; 2 mg/ml; 1 mg/ml. Dilakukan prosedur yang sama terhadap ekstrak

etilasetat dengan pelarut etilasetat dan ekstrak etanol dengan pelarut etanol.

3.14 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak n-Heksan, Etilasetat, dan

Etanol Daun Kembang Bulan.

Sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri konsentrasi 10 6 CFU/ml dimasukkan

ke

dalam

(45-50 o C)

cawan

petri

kemudian

ditambahkan

lalu

dihomogenkan

dan

didiamkan

20

ml

hingga

media

media

MHA

cair

memadat.

Selanjutnya dibuat lubang dengan pencetak lubang dan diteteskan larutan

ekstrak mulai dari konsentrasi 500 mg/ml hingga pengenceran 10 mg/ml

masing-masing 0,1 ml pada lubang dan sebagai kontrol diteteskan 0,1 ml

larutan

n-heksan,

etilasetat

dan

etanol

96%.

Ditutup

cawan

petri

dan

dibungkus. Didiamkan selama 10-15 menit kemudian diinkubasi pada suhu

37 o C selama 18-24 jam. Setelah itu diukur diameter hambat pertumbuhan

bakteri pada daerah bening di sekitar lubang dengan menggunakan jangka

sorong.

Dilakukan

prosedur

yang

sama

terhadap

bakteri

Staphylococcus

epidermidis, Escherichia coli dan Salmonella typhi.

35

Universitas Sumatera Utara

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan

Hasil identifikasi tumbuhan dilakukan oleh “Herbarium Bogoriense”,

Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogoradalah tumbuhan kembang

bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray) dari suku Asteraceae. Hasil

dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 53.

4.2 Hasil Pemeriksaan Karakterisasi

Hasil pemeriksaan organoleptik daun kembang bulan segar yaitu daun

berwarna hijau, berbau khas dan rasa pahit. Hasil pemeriksaan makroskopik

daun kembang bulan segar adalah daun tunggal, bertoreh sampai setengah

panjang tulang daun, bergerigi, berseling, panjang daun 26-32 cm, lebar 15-25

cm, ujung dan pangkal daun runcing, pertulangan menyirip, berwarna hijau.

Hasil

pemeriksaan

mikroskopik

daun

segar

menunjukkan

adanya

rambut

penutup tunggal multiseluler, kutikula, epidermis atas, palisade, trakea bentuk

spiral, jaringan bunga karang, epidermis bawah, dan mulut daun tipe diasitik.

Hasil

pemeriksaan

organoleptik

simplisia

adalah

bewarna

kuning

kecoklatan, keriput, rapuh, berbau khas dan rasa pahit.Hasil pemeriksaan

makroskopik simplisia adalah berwarna kuning kecoklatan, keriput, rapuh,

panjang daun 13-16 cm, lebar 5-10 cm. Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk

simplisia menunjukkan adanyarambut penutup tunggal multiseluler, trakea

bentuk spiral, mulut daun tipe diasitik, pembuluh kayudan jaringan bunga

karang.

36

Universitas Sumatera Utara

Hasil pemeriksaan karakterisasi simplisia daun kembang bulan dapat dilihat

pada Tabel 4.2.1 di bawah ini.

Tabel 4.2.1 Hasil pemeriksaan karakterisasi simplisia

Tabel 4.2.1 Hasil pemeriksaan karakterisasi simplisia daun kembang bulan

No.

 

Parameter

   

Hasil (%)

1

Kadar air

 

7,99

2

Kadar abu total

   

5,25

3

Kadar abu tidak larut asam

   

0,29

4

Kadar sari larut dalam air

   

22,95

5

Kadar sari larut dalam etanol

   

15,21

Hasil

yang

diperoleh

pada

penetapan

kadar

air

7,99%

berarti

standarisasi simplisia memenuhi persyaratan. Apabila kadar air simplisia lebih

besar dari 10% maka simplisia tersebut akan mudah ditumbuhi kapang pada

saat penyimpanan sehingga mutu simplisia akan menurun. Kadar sari yang

larut dalam air adalah 22,95%, sedangkan kadar sari yang larut dalam etanol

adalah 15,21%. Berdasarkan hasil penetapan kadar sari menunjukkan bahwa

simplisia daun kembang bulan lebih banyak mengandung senyawa yang larut

dalam air dari pada yang larut dalam etanol. Penetapan kadar sari larut air

dilakukan untuk mengetahui kadar senyawa yang bersifat polar sedangkan

kadar sari larut dalam etanol untuk mengetahui senyawa yang terlarut dalam

etanol baik polar maupun non polar. Penetapan kadar abu total dilakukan untuk

mengetahui kadar senyawa anorganik alam simplisia misalnya Mg, Ca, Na, dan

K sedangkan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam untuk mengetahui

kadar senyawa yang tidak larut dalam asam misalnya silika (Gunawan, 2010).

37

Universitas Sumatera Utara

4.2.2

Hasil Skrining Fitokimia

 

Hasil

skrining

fitokimia

serbuk

simplisia

dan

ekstrak

n-heksan,

etil

asetat,

dan

etanol

daun

kembang

bulan

dijumpai

adanya

steroid/triterpenoid, glikosida, flavonoid, saponin dan tanin dapat dilihat pada

Tabel 4.2.2.

Tabel4.2.2 Hasil skrining fitokimia

No

Senyawa

 

Serbuk

Ekstrak

Ekstrak

Ekstrak

simplisia

n-heksan

Etilasetat

Etanol

1

Alkaloida

 

- -

-

-

2

Glikosida

 

+ -

+

+

3

Saponin

 

+ -

-

+

4

Flavonoid

 

+ -

+

+

5

Tanin

 

+ -

-

+

6

Steroid/Triterpenoid

   

+ +

-

+

Keterangan :

+ = Mengandung golongan senyawa - = Tidak mengandung golongan senyawa

 
 

Berdasarkan

hasil

pemeriksaan

skrining

fitokimia

terhadap

serbuk

simplisia daun kembang bulan terdapat kandungan senyawa kimia golongan

steroid/triterpenoid, glikosida, flavonoid, saponin dan tanin. Hasil pemeriksaan

skrining fitokimia terhadap ekstrak n-heksan, ekstrak etilasetat dan ekstrak

etanol daun kembang bulan menunjukkan hasil yang berbeda. Pada ekstrak

n-heksan daun kembang bulan hanya terdapat kandungan senyawa kimia

golongan steroid/triterpenoid, pada ekstrak etilasetat daun kembang bulan

terdapat kandungan senyawa kimia golongan glikosida dan flavonoid, serta

pada

ekstrak

etanol

terdapat

kandungan

senyawa

kimia

golongan

steroid/triterpenoid, glikosida, flavonoid, saponin dan tanin.

38

Universitas Sumatera Utara

4.3

Hasil Perkolasi

Hasil

perkolasi

250

g

simplisia

daun

kembang

bulan

dengan

menggunakan ekstrak n-heksan, etilasetat, dan etanol 70%. Perkolat diuapkan

dengan

rotary

evaporator,

kemudian

diuapkan

hingga

mengental

dan

ditimbang

hasilnya,

diperoleh

ekstrak

n-heksan

sebanyak

4,7

g,

ekstrak

etilasetat sebanyak 7,3 g dan ekstrak etanol sebanyak 31,6 g. Ekstrak n-heksan,

etilasetat dan etanol ini kemudian digunakan untuk uji aktivitas antibakteri

terhadap Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli

dan Salmonella typhi

4.4 Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak daun kembang bulan terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Eschericia coli dan Salmonella typhi. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak daun kembang bulan terhadap

bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli

dan Salmonella typhi dapat dilihat pada Tabel 3.4.1 dibawah ini.

Tabel 4.4.1

Hasil uji aktivitas anti bakteri ekstrak n-heksan tumbuhan daun kembang bulan

Konsentrasi Ekstrak n-heksan mg/ml

Diameter Daerah Hambat Pertumbuhan Bakteri (mm) *

Staphylococcus

Staphylococcus

Eschrichia

Salmonella

aureus

epidermidis

coli

typhi

500

23,50

27,10

-

-

400

22,34

26,13

-

-

300

21,37

25,55

-

-

200

20,92

23,08

-

-

100

19,18

22,37

-

-

90

18,5

20,18

-

-

80

17,82

19,23

-

-

70

16,58

16,22

-

-

60

15,22

15,42

-

-

50

14,35

14,63

-

-

40

-

13,40

-

-

30

-

12,29

-

-

20

-

- -

 

-

10

-

- -

 

-

Blanko

-

- -

 

-

39

Universitas Sumatera Utara

Keterangan :

* = Rata-rata pengukuran 2x

- = Tidak ada hambatan

Pada Tabel 4.4.1 di atas dalam pengujian ekstrak n-heksan daun

kembang bulan dapat memberikan kemampuan menghambat pertumbuhan

bakteri yang efektif. Diameter daerah hambat yang efektif dari ekstrak n-

heksan pada bakteri Staphylococcus aureus sebesar 50 mg/ml dengan diameter

hambat 14,35 mm, dan pada bakteri Staphylococcus epidermidis sebesar 50

mg/ml dengan diameter 14,63 mm. Dimana Menurut Depkes (1995), diameter

daerah hambat antibakteri yang paling efektif terhadap uji antibakteri adalah

14 sampai 16 mm.

Tabel 4.4.2

Hasil uji aktivitas anti bakteri ekstrak etilasetat tumbuhan daun kembang bulan

Konsentrasi Ekstrak Etilasetat mg/ml

Diameter Daerah Hambat Pertumbuhan Bakteri (mm) *

Staphylococcus

Staphylococcus

Eschrichia

Salmonella

aureus

epidermidis

coli

typhi

500

28,92

30,15

-

-

400

27,53

29,17

-

-

300

26,62

27,56

-

-

200

26,22

26,24

-

-

100

25,16

25,54

-

-

90

19,40

24,42

-

-

80

18,74

23,25

-

-

70

18,13

22,82

-

-

60

17,57

22,30

-

-

50

17,0

21,44

-

-

40

15,32

19,49

-

-

30

14,54

18,15

-

-

20

13,51

17,28

-

-

10

12,57

15,57

-

-

9

11,45

14,19

-

-

8

8,51

13,40

-

-

7

-

11,53

-

-

6

-

9,42

-

-

5

-

8,59

-

-

4

-

7,18

-

-

Blanko

-

-

-

-

40

Universitas Sumatera Utara

Keterangan :

* = Rata-rata pengukuran 2x

- = Tidak ada hambatan

Pada Tabel 4.4.2 di atas dalam pengujian ekstrak etilasetat daun kembang

bulan dapat memberikan kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri yang

efektif. Diameter daerah hambat yang efektif dari ekstrak etilasetat pada

bakteri Staphylococcus aureus sebesar 30 mg/ml dengan diameter hambat

14,54 mm, dan pada bakteri Staphylococcus epidermidis sebesar 9 mg/ml

dengan diameter 14,19 mm. Menurut Depkes (1995), diameter daerah hambat

antibakteri yang paling efektif terhadap uji antibakteri adalah 14 sampai 16

mm.

Tabel 4.4.3

Hasil uji aktivitas anti bakteri ekstrak etanol tumbuhan daun kembang bulan

Konsentrasi

Diameter Daerah Hambat Pertumbuhan Bakteri (mm) *

EkstrakEtanol

mg/ml

Staphylococcus

Staphylococcus

Eschrichia

Salmonella

aureus

epidermidis

coli

typhi

500

14,68

19,30

-

-

400

13,44

18,09

-

-

300

12,55

17,33

-

-

200

11,32

16,40

-

-

100

10,34

14,60

-

-

90

8,42

14,04

-

-

80

7,36

13,44

-

-

70

-

12,40

-

-

60

-

11,29

-

-

50

-

10,55

-

-

40

-

9,25

-

-

30

-

- -

 

-

20

-

- -

 

-

10

-

- -

 

-

Blanko

-

- -

 

-

Keterangan :

* = Rata-rata pengukuran 2x

- = Tidak ada hambatan

41

Universitas Sumatera Utara

Pada Tabel 4.4.3 di atas dalam pengujian ekstrak etanol daun kembang bulan

dapat memberikan kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri yang efektif.

Diameter

daerah

hambat

yang

efektif

dari

ekstrak

etanol

pada

bakteri

Staphylococcus aureus sebesar 500 mg/ml dengan diameter hambat 14,68 mm,

dan

pada

diameter

bakteri

Staphylococcus

epidermidis

sebesar

90

14,04

mm.

Menurut

Depkes

(1995),

diameter

mg/ml

daerah

dengan

hambat

antibakteri yang paling efektif terhadap uji antibakteri adalah 14 sampai

16 mm.

Berdasarkan data diatas menunjukkan bahwa ekstrak daun kembang

bulan

dapat

menghambat

pertumbuhan

bakteri

Staphylococcus

aureus

dan bakteri Staphylococcus epidermidis tetapi tidak pada bakteri Escherchia

coli dan bakteri Salmonella typhi. Hasil uji aktivitas dari ekstrak n-heksan

tersebut

diperoleh

Konsentrasi

Staphylococcus

aureus

sebesar

Hambat

50

mg/ml

Minimum

dan

bakteri

(KHM)

bakteri

Staphylococcus

epidermidis sebesar 30 mg/ml, hasil uji aktivitas dari ekstrak etilasetat tersebut

diperoleh

Konsentrasi

Hambat

Minimum

(KHM)

bakteri

Staphylococcus

aureus sebesar 8 mg/ml dan bakteri Staphylococcus epidermidis sebesar

4 mg/ml,

dan

hasil

uji

aktivitas

dari

ekstrak

etanol

tersebut

diperoleh

Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) bakteri Staphylococcus aureus sebesar

80 mg/ml dan bakteri Staphylococcus epidermidis sebesar 40 mg/ml. Pada

bakteri

Escherichia

coli

dan

bakteri

Salmonella

typhi

tidak

mempunyai

aktivitas

antibakteri

sehingga

ekstrak

daun

kembang

bulan

menghambat

pertumbuhan

bakteri

Staphylococcus

aureus

dan

bakteri

Staphylococcus

epidermidis dibandingkan bakteri Escherichia coli dan bakteri Salmonella

42

Universitas Sumatera Utara

typhi.

Bakteri Escherichia coli dan bakteri Salmonella typhi merupakan

bakteri Gram negatif sedangkan bakteri Staphylococcus aureus dan bakteri

Staphylococcus epidermidis merupakan bakteri Gram positif.

Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode difusi agar

dengan diukur diameter hambat pertumbuhan bakteri pada daerah bening

di sekitar lubang dengan menggunakan jangka sorong. Diameter hambat

pertumbuhan bakteri pada daerah bening di sekitar lubang semakin meningkat

pada kenaikan konsentrasi.

Etanol 70% merupakan pelarut yang paling baik karena etanol 70%

merupakan pelarut polar sehingga dapat menarik senyawa-senyawa yang

bersifat polar. Menurut Robinson (1995), senyawa flavonoid, saponin dan tanin

merupakan senyawa kimia yang memiliki potensi sebagai antibakteri dan

antivirus.Adanya

kandungan

golongan

senyawa

fenol

diketahui

memiliki

aktivitas antimikroba yang bersifat bakterisida namun tidak bersifat sporisida

(Pratiwi, 2008). Senyawa fenol bekerja dengan cara mendenaturasi protein sel

dan

merusak

dinding

sel

bakteri

sehingga

bakteri

mati,

juga

dapat

meningkatkan protein secara aktif dan merusak lipid pada membran sel melalui

mekanisme penurunan tegangan permukaan membran sel (Pelczar dan Chan,

1986). Aktivitas antibakteri ekstrak daun kembang bulan terhadap bakteri

tersebut

dapat

disebabkan

oleh

kandungan

kimianya

yaitu

senyawa

triterpenoid/steroid, flavonoid dan tanin. Beberapa senyawa terpenoid yang

telah diteliti memiliki aktivitas sebagai antibakteri antara lain monoterpenoid

linalool,

diterpenoid

hardwicklic

acid,

phytol,

triterpenoid glikosida (Gunawan, et al., 2008).

43

triterpenoid

saponin

dan

Universitas Sumatera Utara

Senyawa flavonoid bekerja pada bakteri dengan cara merusak membran

sitoplasma. Membran sitoplasma bakteri yang berfungsi mengatur masuknya

bahan makanan dan nutrisi, apabila membran sitoplasma rusak maka metabolit

penting dalam bakteri akan keluar dan bahan makanan untuk menghasilkan

energi tidak dapat masuk sehingga sel bakteri tidak mampu tumbuh dan

akhirnya terjadi kematian (Dzen, 2003).

Berdasarkan data diatas dapat disimpulkan bahwa ekstrak n-heksan,

etilasetat dan etanol dapat memberikan efek antibakteri dengan Konsentrasi

Hambat Minimum (KHM) terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan bakteri

Staphylococcus epidermidis sedangkan terhadap bakteri Escherichia coli dan

bakteri Salmonella typhi tidak mempunyai hambatan.

Hal ini membuktikan bahwa peningkatan konsentrasi terhadap ekstrak

daun kembang bulan memiliki korelasi positif terhadap peningkatan diameter

zona hambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis, Escherichia coli dan Salmonella typhi.

Hasil

penelitian

terlihat

bahwa

ekstrak

daun

kembang

bulan

memberikan daya antibakteri yang berbeda terhadap bakteri Staphylococcus

aureus dan Staphylococcus epidermidis. Bakteri Gram Positif dan Gram

Negatif tersebut memiliki komponen dan struktur dinding sel yang berbeda.

Dinding sel bakteri Gram Negatif mengandung komponen lipid lebih banyak

yaitu

11%-

22%

dari

pada

struktur

dinding

bakteri

Gram

positif

yang

mengandung komponen lipid 1% - 4% (Pelczar, 1986).

44

Universitas Sumatera Utara

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Hasil karakterisasi serbuk simplisia daun kembang bulan diperoleh kadar

air 7,99%, kadar abu total 5,25%, kadar abu tidak larut asam 0,29%, kadar

sari larut dalam air 22,95%, dan kadar sari larut dalam etanol 15,21%.

2. Hasil

skrining

fitokimia

simplisia

dan

ekstrak

daun

kembang

bulan

menunjukkan

adanya

kandungan

golongan

senyawa

kimia

triterpenoid/steroid, glikosida, flavonoid, saponin dan tanin.

3. n-heksan, etilasetat, dan etanol daun kembang bulan mempunyai

Ekstrak

aktivitas

antibakteri

terhadap

bakteri

Staphylococcus

aureus

dan

Staphylococcus

epidermidis.

Pengujian

hasil

uji

aktivitas

antibakteri

ekstrak n-heksan dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus

aureus pada konsentrasi 50 mg/ml dengan diameter hambat yang efektif

14,35 mm pada bakteri Staphylococcus epidermidis pada konsentrasi

50 mg/ml dengan diameter hambat yang efektif 14,63 mm. Ekstrak

etilasetat dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus

pada

konsentrasi

30

mg/ml

dengan

diameter

hambat

yang

efektif

14,54 mm, dan pada bakteri Staphylococcus epidermidis pada konsentrasi

9 mg/ml dengan diameter hambat yang efektif 14,19 mm. Ekstrak etanol

dapat

menghambat

pertumbuhan

bakteri

Staphylococcus

aureus

pada

konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter hambat yang efektif 14,68 mm,

dan pada bakteri Staphylococcus epidermidis pada konsentrasi 90 mg/ml

dengan diameter hambat yang efektif 14,04 mm.

45

Universitas Sumatera Utara

5.2 Saran

Disarankan pada peneliti selanjutnya menguji secara in vivo ekstrak daun

kembang bulan menjadi sediaan antibakteri topikal.

46

Universitas Sumatera Utara