Anda di halaman 1dari 8

TUGAS FITOKIMIA LANJUTAN

cara isolasi dan metode metabolit sekunder

NURIHARDIYANTI
G 701 11 035
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS TADULAKO
PALU,2014

1 . FLAFONOID
Isolasi
1. Isolasi Dengan Charaux Paris
Serbuk tanaman diekstraksi dengan metanol,lalu diuapkan sampai kental
dan ekstrak kental ditambah air panas dalam volume yang sama, Ekstrak air
encer lalu ditambah eter, lakukan ekstraksi kocok, pisahkan fase eter lalu
uapkan sampai kering yang kemungkinan didapat bentuk bebas. Fase air dari
hasil pemisahan ditambah lagi pelarut etil. asetat diuapkan sampai kering yang
kemungkinan didapat Flavonoid O Glikosida. Fase air ditambah lagi pelarut n
- butanol, setelah dilakukan ekstraksi, lakukan pemisahan dari kedua fase
tersebut. Fase n-butanol diuapkan maka akan didapatkan ekstrak n - butanol
yang kering, mengandung flavonoid dalam bentuk C-glikosida dan
leukoantosianin. Dari ketiga fase yang didapat itu langsung dilakukan
pemisahan dari komponen yang ada dalam setiap fasenya dengan
mempergunakan kromatografi koLom. Metode ini sangat baik dipakai dalam
mengisolasi flavonoid dalam tanaman karena dapat dilakukan pemisahan
flavonoid berdasarkan sifat kepolarannya.
2. Isolasi dengan beberapa pelarut.
Serbuk kering diekstraksi dengan kloroform dan etanol, kemudian ekstrak
yang diperoleh dipekatkan dibawah tekanan rendah. Ekstrak etano lpekat
dilarutkan dalam air lalu diekstraksi gojog dengan dietil eter dan n-butanol,
sehingga dengan demikian didapat tiga fraksi yaitu fraksi kloroform, butanol
dan dietil eter.
Metode
Metode yang biasa digunakan dalam mengisolasi senyawa flavonoid
adalah dengan mengekstrak jaringan segar dengan metanol. Terhadap bahan
yang telah dihaluskan, ekstraksi dilakukan dalam dua tahap. Pertama dengan
metanol:air (9:1) dilanjutkan dengan metanol:air (1:1) lalu dibiarkan 6-12
jam. Penyaringan dengan corong buchner, lalu kedua ekstrak disatukan dan

diuapkan hingga 1/3 volume mula-muIa, atau sampai semua metanol


menguap dengan ekstraksi menggunakan pelarut heksan atau kloroform
(daIam corong pisah) dapat dibebaskan dari senyawa yang kepolarannya
rendah, seperti lemak, terpen, klorofil, santifil.
Cara lain yang dapat dipakai untuk pemisahan adalah ekstraksi cair-cair,
kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas. Isolasi
dan pemurnian dapat dilakukan dengan kromatografi lapis tipis atau
kromatografi kertas preparatif dengan pengembangan yang dapat memisahkan
komponen paling baik (Harborne, 1987). Flavonoid (terutama glikosida)
mudah mengalami degradasi enzimatik ketika dikoleksi dalam bentuk segar.
Oleh

karena

itu

disarankan

koleksi

yang

dikeringkan

atau

dibekukan. Ekstraksi menggunakan solven yang sesuai dengan tipe flavonoid


yg dikehendaki. Polaritas menjadi pertimbangan utama. Flavonoid kurang
polar (seperti isoflavones, flavanones, flavones termetilasi, dan flavonol)
terekstraksi dengan chloroform, dichloromethane, diethyl ether, atau ethyl
acetate, sedangkan flavonoid glycosides dan aglikon yang lebih polar
terekstraksi dengan alcohols atau campuran alcohol air. Glikosida
meningkatkan kelarutan ke air dan alkohol-air. Flavonoid dapat dideteksi
dengan berbagai pereaksi, antara lain:
a.

Sitroborat

b.

AlCl3

c.

NH3
Sebelum melakukan suatu isolasi senyawa, maka yang dilakukan adalah
ekstraksi terlebih dahulu.

2 . ALKALOID
Isolasi
Dengan menarik menggunakan pelarut-pelarut organik berdasarkan azas
Keller. Yaitu alkaloida disekat pada pH tertentu dengan pelarut organik. Prinsip
pengerjaan dengan azas Keller yaitu alkaloida yang terdapat dalam suatu bakal
sebagai bentuk garam, dibebaskan dari ikatan garam tersebut menjadi alkaloida
yang bebas. Untuk itu ditambahkan basa lain yang lebih kuat daripada basa
alkaloida tadi. Alkaloida yang bebas tadi diekstraksi dengan menggunakan
pelarut pelarut organic misalnya Kloroform. Tidak dilakukan ekstraksi dengan
air karena dengan air maka yang masuk kedalam air yakni garamgaram alkaoida
dan zat-zat pengotor yang larut dalam air, misalnya glikosida-glikosida, zat
warna, zat penyamak dan sebagainya. Yang masuk kedalam kloroform disamping
alkaloida juga lemaklemak, harsa dan minyak atsiri. Maka setelai alkaloida
diekstraksi dengan kloroform maka harus dimurnikan lagi dengan pereaksi
tertentu. Diekstraksi lagi dengan kloroform. Diuapkan, lalu didapatkan sisa
alkaloid baik dalam bentuk hablur maupun amorf. Ini tidak berate bahwa
alkaloida yang diperoleh dalam bentuk murni, alkaloida yang telah diekstaksi
ditentukan legi lebih lanjut. Penentuan untuk tiap alkaloida berbeda untuk tiap
jenisnya. Hal-hal yang harus diperhatikan pada ekstraksi dengan azas Keller,
adalah :
a.

Basa yang ditambahkan harus lebih kuat daripada alkaloida yang akan
dibebaskan dari ikatan garamnya, berdasarkan reaksi pendesakan.

b.

Basa yang dipakai tidak boleh terlalu kuat karena alkaloida pada umumnya
kurang stabil.

c.

Setelah bebas, alkaloida ditarik dengan pelarut organik tertentu, tergantung


kelarutannya dalam pelarut organik tersebut.

Metode
Alkaloid biasanya diisolasi dari tumbuhannya dengan menggunakan
metode ekstraksi. Pelarut/maserasi yang digunakan ketika mengekstraksi
campuran senyawanya yaitu molekul air yang diasamkan. Pelarut ini akan
mampu melarutkan alkaloid sebagai garamnya. Selain itu juga dapat
membasakan

bahan

tumbuhan

yang

mengandung

alkaloid

dengan

menambahkan natrium karbonat. Basa yang terbentuk kemudian dapat


diekstraksi dengan pelarut organic seperti seperti kloroform atau eter.
Untuk alkaloid yang bersifat tidak tahan panas, isolasi dapat dilakukan
menggunakan teknik pemekatan dengan membasakan larutannya terlebih
dahulu. Dengan menggunakan teknik ini maka alkaloid akan menguap dan
selanjutnya dapat dimurnikan dengan metode penyulingan uap. Metode ini
biasanya dilakukan untuk pemurnian senyawa nikotin.
Sedangkan untuk larutan alkaloid dalam air yang bersifat asam maka
larutannya harus dibasakan terlebih dahulu. Selanjutnya alkaloid dapat
diekstraksi dengan menggunakan pelarut organic.
Cara lain untuk mendapatkan alkaloid dari larutan yang bersifat basa
adalah dengan metode penjerapan menggunakan pereaksi Lloyd. Alkaloid
yang diperoleh kemudian dielusi dan diendapkan menggunakan Pereaksi
Meyer.

Setelah itu

,endapan

yang

dipisahkan menggunakan metode kromatografi pertukaran ion.

terbentuk

3 . STEROID
Isolasi
Serbuk kering diekstraksi dengan cara maserasi dengan metanol. Ekstrak
metanol dipekatkan kemudian difraksinasi dengan menggunakan n-heksana dan
masing- masing diuji steroid. Ekstrak n-heksana merupakan fraksi yang positif
steroid kemudian dipisahkan dengan cara kromatografi kolom menggunakan fase
diam silika gel dan dielusi secara isokratik menggunakan eluen n- heksankloroform (7:3). Semua fraksi dilakukan analisis menggunakan kromatografi
lapis tipis. Fraksi yang sama digabungberdasarkan pola noda yang sama dan diuji
steroid. Fraksi yang positif steroid (vial 15-22) menghasilkan kristal dan
rekristalisasi dengan menggunakan metanol p.a sampai diperoleh steroid yang
murni. Uji kemurnian dilakukan dengan menggunakan KLT. Penentuan struktur
molekul isolat murni dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer
inframerah dan spektrofotometer NMR-H.
Isolat murni yang diperoleh dari fraksi n- heksana sebanyak 18 mg berupa
kristal berwarna putih berbentuk jarum dengan titik leleh 170- 171C. Uji
fitokimia dengan menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard memberikan
warna hijau, menunjukkan bahwa isolat tersebut positif steroid.
Metode
Uji

kandungan

steroid

dalam

ekstrak

simplisia

dilakukan

dengan

menggunakan kromatograrfi lapis tipis. KLT merupakan metode kromatografi


yang paling sederhana. Fase diam yang digunakan berupa lapisan tipis dan fase
gerak berupa cairan. Bercak atau noda yang dihasilkan ditandai, jika tidak
tampak dapat dialkukan penyemprotan dengan pereaksi penampak noda tertentu.
Metode termudah adalah dengan menggunakan nilai Rf yaitu perbandingan jarak
tepuh noda dengan jarak tempuh eluen dalam sistem kromatografi.
Pertama tama ekstrak ditambah dengan beberapa tetes etanol, sehingga
didapat fase organik. Etanol dipilih katrena secara umum etanol merupakan
pelarut yang dianggap dapat melarutkan seluruh golongan metabolit sekunder,

termasuk terpenoid dan steroid bebas. Dalam identifikasi ini, tidak dilakukan
proses hidrolisis karena bentuk terpenoid dan steroidnya adalah bentuk bebas,
tidak memiliki ikatan glikosida seperti pada sapogenin steroid atau triterpenoid
yang sebelum diidentifikasi harus diputus terlebih dahulu ikatannya.
Langkah selanjutnya, fase organik ditotolkan 4 l pada lempeng KLT, dalam
praktikum kali ini digunakan Kiesel Gel GF 254 sebagai fase diamnya.
Kemudian lempeng KLT diproses dalam chamber yang berisi eluen yaitu nheksana etil asetat ( 4 : 1 ) sebagai fase gerak. Pemilihan eluen dengan
komposisi tersebut berdasarkan kemampuannya untuk meminimumkan pengotor
dan menghasilkan noda yang terpisah dengan baik. Setelah eluen mencapai batas
elusi, lempeng KLT kemudian dikeringkan. Lempeng disemprot dengan pewarna
noda anisaldehid asam sulfat dan kemudian dipanaskan. Adanya terpenoid atau
steroid bebas ditunjukkan dengan terjadinya warna merah ungu, atau ungu. Noda
pada lempeng KLT berwarna ungu, hal tersebut menunjukkan bahwa ekstrak
simplisia mengandung terpenoid atau steroid bebas.
4 . GLIKOSIDA
Isolasi
Ekstraksi dilakukan dengan cara mengekstraksi simplisia secara refluks
dengan etanol selama 3 jam dan dilakukan 3 kali pengulangan dan diuapkan
dengan penguap berpusing Ekstrak etanol yang diperoleh kemudian dipartisi
dengan etilasetat sebanyak 3 kali, dan lapisan air kemudian dipartisi kembali
dengan n-butanol sebanyak 3 kali. Sehingga diperoleh 3 jenis ekstrak yaitu
ekstrak

etilasetat,

ekstrak n-butanol

dan

ekstrak

air.

Ekstrak n-butanol

difraksinasi dengan kromatografi kolom (SiO2, kloroform-metanol = 4 : 1 1 :


1), kemudian fraksi 3 (Fr.-3) dimurnikan kembali dengan kromatografi kolom
secara isokratik (SiO2, kloroform-metanol =5 : 1) dan diperoleh fraksi 3-3 yang
telah murni yang (UL), infra merah (IM), resonansi magnet inti RMI 1 dimensi
(RMI proton , karbon dan DEPT), RMI 2 dimensi (1H-1H COSY, 13C-1H
COSY, dan HMBC).

Metode
Senyawa isolat (20 mg) dilarutkan dalam 10 mL 9% HClMeOH, distirer
pada suhu kamar selama 2 jam sambil dimonitor dengan analisis KLT setiap
20 menit. Hasil hidrolisis dimurnikan dengan analisis kromatografi kolom
(SiO2, kloroform MeOH = 8 : 1) dan diperoleh 2 senyawa berbentuk serbuk
putih (gula) dan serbuk kuning (aglikon). Bagian gula yang termetilasi dan
senyawa metil-- glukosa standar diinjeksikan pada kromatografi gas dengan
kondisi sebagai berikut :Kolom : 2% OV-17 Suhu kolom : 160 Oc Fase
gerak : nitrogen Kecepatan alir : 50 mL/menit Suhu injeksi : 180 oC
Detektor : FID