BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Prodi Pendidikan
Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Muhammadiyah
Purwoketo dan Desa Banjarkulon, Kecamatan Banjarmangu, Kabupaten
Banjarnegara. Penelitian ini berlangsung pada bulan Maret sampai Juni 2015.
B. Alat dan Bahan
1. Alat yang Digunakan dalam Pembuatan Pakan
Alat yang digunakan dalam pembuatan pakan yaitu penggilingan tepung,
panci, baskom, autoklaf, sprayer, oven, tampah, timbangan.
2. Alat untuk Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila
Alat yang digunakan untuk isolasi dan kultur bakteri Aeromonas
hydrophilaadalah shaker, cawan petri, tabung reaksi, lampu bunsen, jarum ose,
autoklaf, LAF, pipet ukur, refigerator, erlenmeyer, timbangan analitik, inkubator.
3. Alat untuk Membuat Vaksin Sel Aeromonas hydrophila
Alat yang digunakan untuk membuat vaksin sel Aeromonas hydrophila
adalah cawan petri, jarum ose, erlenmeyer, lampu bunsen, tabung reaksi,
mikropipet dan tip, timbangan analitik, sentrifuse, drugalsky, tabung konikal,
tabung sentrifuse, tabung eppendurf, autoklaf, vortex, inkubator, refrigerator,
corong.

4. Alat untuk Pemeliharaan Lele Dumbo

Kolam terpal berbentuk persegi dengan ukuran p x l x t = 80 x 60 x 60 cm,

sebanyak 15 kolam, seser besar dan kecil, terpal, paralon, bambu, tali rafia.
5. Alat untuk Mengukur Parameter yang Diamati
Alat yang digunakan untuk mengukur titer antibodi yaitu mikrotiter plate,
garpu mikrotiter, mikropipet dan tip, tabung reaksi, refrigerator, alat pembaca titer
antibodi, lampu bunsen, suntikan, timbangan, penggaris, mikroskop, gelas objek,
gelas penutup, pH meter, termometer, DO meter.
6. Bahan Pembuatan Pakan
Bahan yang digunakan untuk pembuatan pakan adalah ampas tahu, tepung
bulu ayam, dan tepung ikan rucah. Ampas tahu diperoleh di Desa Arca, bulu ayam
diperoleh di Desa Dampit serta ikan rucah diperoleh diTPI Cilacap. Bahan perekat
pakan menggunakan tepung tapioka. Komposisi pakan yang menggunakan bahan
dasar berupa tepung bulu ayam 25%, ampas tahu 50% dan tepung ikan rucah
25%.
7. Bahan Pembuatan Vaksin
a. Isolat Bakteri
Isolat bakteri Aeromonas hydrophila dari Laboratorium Mikrobiologi,
Pendidikan Biologi, Universitas Muhammadiyah Purwokerto.
b. Media Bakteri
Media yang digunakan adalah media TSB (Tryptone Soya Broth), media
TSA (Trytone Soya Agar), media GSP (Pseudomonas Starch Phenile) sebagai
media kultur bakteri.
c. Larutan PBS (Phosphat Buffer Saline)

d. Formalin 2%
8. Ikan Uji
Hewan uji yang digunakan adalah benih ikan lele dumbo 225 ekor, yang
digunakan untuk mengaktifkan virulensi bakteri Aeromonas hydrophila (reinfeksi
dan reisolasi) dan penelitian pakan bervaksin. Benih ikan lele dumbo berukuran
panjang 11-13 cm dan berat 7,3-21,1 gram dalam kolam terpal plastik berukuran
80 x 60 x 60 cm berumur 1,5 bulan yang diperoleh dari kolam budidaya di
wilayah Banjarnegara.
C.

Rancangan penelitian
Penelitian ini menggunakan rancang acak lengkap (RAL) dengan 3

perlakuan dan 5 kali ulangan. Perlakuan tersebut terdiri atas :

A1

= Pakan bervaksin 10 hari

A2

= Pakan bervaksin 15 hari

A3

= Pakan tidak bervaksin / kontrol

Penelitian dilaksanakan di Desa Kecamatan Kabupaten Banyumas.

Berdasarkan desain penelitian tersebut, terdapat 15 unit sampel. Setiap unit

sampel dipelihara lele dumbo sebanyak 15 ekor dengan ukuran 11-13 cm dan
berat 7,3-21,1 gram dalam kolam terpal plastik berukuran 80 x 60 x 60 cm dengan
tinggi air 30 cm.
D. Prosedur Penelitian
1. Isolasi Bakteri Murni A. hydrophilla
Kultur bakteri berasal dari isolat bakteri murni yang diisolasikan pada media
GSP (Glutamat Starch Phenile) agar dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24

jam. Masing-masing satu koloni bakteri dikultur di dalam medium cair TSB 10
ml.
2. Pembuatan Vaksin Aeromonas hydrophila
Kultur bakteri pada media cair TSB dan diinkubasi selama 24 jam kemudian
bakteri diisolasi pada media TSA dan diinkubasi pada suhu ruangselama 24 jam.
Setelah diinkubasi bakteri dipanen dengan batang drugalsky. Dan dimasukkan ke
dalam erlenmeyer melalui corong steril. Sisa bakteri yang terdapat di dalam
medium TSA kemudian dibersihkan menggunakan PBS sebanyak 5 ml. Pencucian
media dilakukan sebanyak 3 kali. Bakteri hasil kultur yang terdapat pada
erlenmeyer di tambah formalin 2 % kemudian dishaker selama 24 jam. Lalu di
sentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit untuk menghilangkan
formalin, lalu cairan yang berada di bagian atas tabung reaksi dibuang kemudian
dicuci dengan PBS dan disentrifugasi dilakukan sebanyak 3 kali. Setelah itu
dilakukan uji viabilitas pada bakteriAeromonas hydrophila. Uji viabilitas
bertujuan untuk memastikan bahwa Aeromonas hydrophila telah mati dan dapat
digunakan sebagai vaksin untuk ikan. Pengujianviabilitasmenggunakan medium
GSP dengancaramengkulturbakteripada medium tersebutdengancara streak zigzag.BakteriAeromonashydrophiladikatakantelahmenjadivaksinapabilatidaktumbuh
dalam medium GSP.

3. Pembuatan Tepung Bulu Ayam

Bulu ayam dijemur hingga kering, kemudian dihidrolisis menggunakan

0,4% NAOH. Setelah itu dimasukkan ke dalam autoklaf selama 2,5 jam, lalu bulu
ayam direndam dalam larutan HCl 12% selama 3 hari. Bulu ayam dikeringkan di
dalam oven pada suhu 600C. Bulu ayam yang sudah kering dihaluskan dengan
menggunakan mesin penggiling.
4. Pembuatan Tepung Ikan Rucah
Ikanrucah

yang

masihbasahdijemurhinggakering.Setelahkeringkemudiandigilingdenganmengguna
kanmesinpenggiling.
5. Pembuatan Pakan Bervaksin
Pembuatanpakanmenggunakanbahandasarlimbahtepungbuluayam,
tepugikanrucah,
danampastahu.Pembuatanpakanmenggunakankombinasitepungbuluayam

25%,

ampastahu

yang

50%,

dantepungikanrucah

25%.Kombinasipakan

telahhomogendicampur dengan vaksin yang telah disuspensikan dengan larutan

PBS steril dengan dosis 108 ml, kemudian dicampur sampai merata. Lalu dicetak
dalam bentuk pelet kemudian dioven sampai kering, setelah kering dikemas
dengan kantong plastik.
6. Uji Lapang
Uji lapang dilakukan dengan menggunakan pakan bervaksin. Cara vaksinasi
yang dilakukan dengan mencampurkan ke dalam pakan merupakan cara yang
mudah diterapkan, lebih praktis, dan dapat dilakukan oleh siapa saja tanpa modal
keterampilan, seperti halnya menyuntik. Uji lapang dilakukan di wilayah

Banjarnegara. Tempat penelitian menggunakan lahan milik masyarakat dengan

terlebih dahulu membuat bak terpal plastik yang didesain sehingga cocok untuk
pemeliharaan lele dumbo.
E. Parameter yang diamati
Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah
1. Parameter Utama
a. Produksi Titer Antibodi
Efektivitas suatu vaksin salah satunya dilihat dari kemampuannya dalam
merangsang tubuh untuk memproduksi antibodi. Efektivitas vaksin produk
ekstraseluler dan intraseluler sel A. hydrophiladapat dinilai dari seberapa besar
antibodi yang diproduksi oleh lele dumbo (Mulia, 2009)
b. Pertambahan Berat Ikan
Pertambahan berat ikan menurut Zonneveld et al. (1991) dihitung dengan rumus :
G = Wt - Wo
Keterangan :
Wo : Berat rata-rata lele dumbo pada awal penelitian (g)
Wt : Berat rata-rata lele dumbo pada akhir penelitian (g)
G

: Pertambahan berat ikan

Pertambahan panjang ikan menurut Zonneveld et al. (1991) dihitung dengan

rumus :
L = Lt - Lo
Keterangan :
Lo : Panjang rata-rata lele dumbo pada awal penelitian (cm)
Lt : Panjang rata-rata lele dumbo pada akhir penelitian (cm)
L : Pertambahan panjang ikan

c. Sintasan
Pengamatan sintasan dilakukan secara visual dengan melihat dan
menghitung ikan yang hidup pada setiap unit perlakuan dan diamati setiap hari.
Menurut Zonneveld et al.(1991), nilai sintasan dapat dihitung menggunakan
rumus :
S = Nt x 100 %
No
Keterangan :
S : Sintasan
Nt : jumlah ikan yang hidup pada waktu terahir penelitian
No : jumlah ikan yang hidup pada awal penelitian (ekor)
2. Parameter Pendukung
Pengamatan kualitas air meliputi suhu air dan pH dilakukan setipa hari,
sedangkan pengamtan O2 terlarut (DO) diamati setiap minggu menggunakan
metode Winkler.
F. Analisis Data
Pengamatan titer antibodi dilakukan dengan metode deskriptif. Data yang
terkumpul dari uji titer antibodi ditransformasikan ke dalam bentuk logaritma
(data log 2). Selanjutnya, data titer antibodi, sintasan, pertumbuhan berat,
pertumbuhan panjang dianalisis dengan menggunakan analisis sidik ragam
(Analysis of Variance/ANOVA) untuk mengetahui pengaruh masing-masing
perlakuan. Apabila data yang telah dianalisis sidik ragam terdapat perbedaan yang

nyata, maka dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada
taraf uji 5% (Mulia,2012).
G. Jadwal Penelitian
No

Tahapkegiatan

Bulanke
1

1.
2.

Persiapanbahan
Pembuatanpakanbervaksi

3.
4.

n
Ujilapang
Analisis data