PENTINGNYA TENASCIN DAN UBIQUITIN SEBAGAI ESTIMASI UMUR LUKA.

ABSTRAK: Menentukan umur luka sangat penting dalam ilmu forensic. Ubiquitin
adalah protein kecil yang diperlukan untuk ATP-Dependent, degradasi proteim
nonlisosomal intraseluler, yang dapat menghilangkan sebagian besar protein
intraselular yang rusak.tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan
pentingnya ubiquitin dan tenascin pada umur luka. Ubiquitin dan tenascin
merupakan imunohistokimia yang diterpakan pada jaringan yang telah terfiksasi
oleh paraffin dari 170 biopsi yang diambil dari 89 kasus otopsi yang diketahui
umur lukanya. Analisis menggunakan pearson correlation ditemukan, umur
pertengahan adalah 39,44 tahun. Tenascin negatif pada 123 kasus (72.4%) pada
seluruh kasus, dan negatif pada 98.3% pada kasus dengan umur luka kurang dari
24 jam. Hasil positif 91,8% pada kasus dengan umur luka lebih dari 24 jam. Rerata
jumlah sel yang mengekspresikan ubiquitin adalah 10.56%, dimana 4.25% kasus
dengan umur luka kurang dari 24 jam, dan 26.14% pada kasus dengan umur luka
diatas 24 jam. Analisis hubungan menunjukkan bahwa keduanya yakni tenascin
dan ubiquitin berhubungan positif dengan umur luka. Tetapi kasus dengan umur
luka lebih dari 40 hari, tenascin ditemukan negatif dan ubiquitin tetap terlihat di
fibroblast. dapat disimpulkan bahwa tenascin dan ubiquitin seluruhnya dapat
bermanfaat untuk menentukan umur luka secara semikuantitatif.
Kata kunci : Umur luka, ubiquitin, tenascin
Penentuan umur luka meliputi pemahaman tentang kompleks penyembuhan
luka pada kulit. Ini menyebabkan penggunaan zat yang besarnya dan lokasinya
berubah selama penyembuhan. Penentuan umur luka sangat penting pada ilmu
forensik. Perbedaan reaksi jaringan terhadap sifat luka membutuhkan metode
diagnostik modern untuk menentukan umur luka. Metode yang dapat digunakan
adalah metode histokimia yang mendefinisikan usia luka berdasarkan perubahan

aktivitas enzim pada daerah luka, metode biokimiawi untuk menentukan nilai dari
histamin dan serotonin, metode histologis yang dapat menentukan umur dari luka
berdasarkan

penampilan

kronologis

dari

elemen

seluler.

Penggunaan

imunohistokimia dalam memperkitakan umur luka telah digunakan dalam

beberapa tahun terakhir. Hanya satu penanda yang tidak dilaporkan dapat menjadi
penentu umur luka. Fibronectin efektif untuk menentukan vitalitas setelah adanya
trauma berat dengan adanya ekspresi dari stadium awal penyembuhan luka.
Efisiensi teknik imunohistokimia untuk diagnosis dari vitalitas luka berkurang
pada luka pada orang yang mendekati kematian dan setelah 10 hari kematian.
Ubiquitin merupaka protein kecil yang diperlukan untuk ATP-dependent,
degradasi protein nonlisosomal intraseluler, yang dapat menghilangkan sebagian
besar protein intraseluler yang rusak dengan onset cepat. Ini telah dikemukakan
untuk memerankan kunci penting dalam fungsi intraseluler, seperti respon pada
syok termal, kerusakan protein dan regulasi dari respon imun. Ini adalah syok
protein dan marker imunohistokimia secara umum. Ini disebabkan oleh berbagai
macam stress traumatis yang sangat cepat, dan ini sebabnya mengapa diperlukan
perhatian besar dalam patologi forensik terutama kondisi neurodegeneratif. Hal ini
dinyatakan baik keadaan intraseluler dan ekstraseluler. Ubiquitin ekstraseluluer
berperan sebagai protein sitokin dengan antiinflamasi, tampak pada inti sel dari
leukosit netrofil, makrofag, dan fibrobals pada area luka.
Tenascin merupakan glikoprotein pada matriks ekstraseluler. Dapat terlihat
pada jaringan dewasa, walaupun tersebar secara luas di jaringan embrionil.
Meskipun Mackie et al menyebutkan bahwa tenascin penting dan memiliki
keunikan pada proses penyembuhan luka, tapi tidak dapat menentukan umur luka
lebih dari 9 hari. Namun berbeda dengan isoform yang mungkin nampak sebagai

alternatif premRNA splicing, namun isoforms terdistribusi di jaringan. Pada

stadium awal luka (3 menit - 8 jam), tenascin ditemukan negative pada 58 kasus.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan pentingnya ubiquitin
dan tenascin dalam estimasi umur luka dan memperlihatkan skala semikuantitatif
berdasarkan interval umur luka.
METODE DAN BAHAN
Penelitian ini disetujui komite etik dari Ege University Faculty of Medicine.
Sampel
Penelitian ini melibatkan 170 biopsi luka secara prospektif dikumpulkan dari
89 otopsi forensic yang diketaui umur lukanya. Kasus yang diotopsi 24 jam setelah
kematian tidak dimasukan dalam penelitian ini. Nilai tengah dari waktu
postmortem adalah 18 jam (4-24 jam). Umur, jenis kelamin, dan penyebab
kematian, dan lokasi luka, diameter, tipe, dan deskripsi morfologis dari luka juga
dicatat. Luka diperiksa secara morfologis, dengan menggunakan foto, histologist,
dan imunohistokimiawi. Setelah otopsi eksternal terpenuhi, dilakukan sampling
biopsy dengan panjang 1 hingga 3 cm dan kedalaman 7 mm dari luka. Jaringan
dimasukan dalam formalin selama 12 jam. Setelah pengolahan jaringan, ditanam
kedalam paraffin. Apusan dicat dengan hematoksilin eosin dan 4 mm diberi
polilisin untuk pemeriksaan imunohistokimia.

Gambar 1. Contoh luka tembak (A-F)

Imunohistokimia
Imunohistokimia dilakukan secara manual. Ubiquitin dan tenacin secara
imunohistokimia dapat diterapkan pada jaringan formalin-fixed paraffinembedded. Protocol ini dapat dilakukan berdasar rekomendasi dari pabrik dan pada
suhu ruang. Apusan diberi lilin dengan xylene selama 15 menit; dan diuapkan
dengan penurunan konstentrasi alcohol (99%, 95%, 80%, 70%, tiap 5 menit).
Bagian ini dibenamkan di H2O2 3% di aquades selama 10 menit pada suhu ruang

untuk menghambat peroksidase endogen. Setelah dicuci dengan aquabides, di

panaskan menggunakan antigen pemulihan yang digunakan yakni larutan buffer
sitrat (pH 5.5) pada 400 watt selama 20 menit. Setelah didinginkan dengan suhu
ruang, apusan dibilas dengan akuabides setelah itu PBS (pH 7.4). PBS digunakan
pada seluruh pencucian. Setelah pengikatan nonspesifik dicegah dengan reagen
penghambat selama 5 menit, antibody primer dapat dilakukan dilusi 1:100 pada
suhu ruangan selama 60 menit (antibody monoclonal untuk ubiquitin Novocastra
NCL-Ubi-1 mouemonoclonal 137705 dan tenascin Novocastra mouse monoclonal
1104606). Peralatan umum yang digunakan untuk kelinci/tikus adalah teknik
streptavidinbiotin, (Novostain Universal Detection Kit NCL-RTU-D). visualisasi
dari antibody primer yang dilakukan menggunakan diaminobenzidine solution
(Liquid DAB-Plus substrate Kit 12 mL Zymed) seperti kromogen dan dicat
menggunakan Mayers Hematoxylin. Salahsatu dari apusan diinkubasi dengan PBS
tanpa antibody primer sebagai kontrol negative. Kontrol positif dievaluasi pada
kulit normal.
Evaluasi
Intensitas yang Nampak, mirip dengan area positif. intensitas tidak diambil
dalam pertimbangan. Pada persentase pengecatan, lokalisasi, dan pola dievaluasi.
Untuk ekspresi ubiquitin, tampak positif pada sel inflamatori dan/atau fibroblast
dinilai secara persentase. Untuk evaluasi ubiquitin, bekas luka dari berbagai kasus
dikelompokkan berdasar umur luka; 0 hingga 12 jam; kelompok 1; 24 hingga 120
jam (1-5 hari); kelompok 2; 168 hingga 336 jam (7 14 hari); kelompok 3; dan
408 504 jam (17-21 hari); kelompok 4. Untuk evaluasi ubiquitin, luka pada kasus
ini dikelompokkan berdasar umur luka ; kelompok 0 tidak ada luka (kolompok
kontrol); kelompok 1 ; 0 hingga 12 jam; kelompok 2; 24 120 jam (1 5 hari);
kelompok 3 ; 168 -336 jam (7 14 hari); dan kelompok 4 ; 408 504 jam (17 21

hari) (gambar 5). Positif pada kulit dapat dipertimbangkan sebagai kontrol postiif.
Untuk ubiquitin kelompok 0 mengindikasikan tidak ada ekspresi; kelompok 1;
<10% positif pada sel inflamasi dan fibroblast (0-12 jam); D; kelompok 2 ; 11% 20% positif (1-5 hari); E; kelompok 3; 21% - 50% positif (7-14 hari(; F; kelompok
4; 15% - 25% positif (17-21 hari).
Untuk ekspresi tenascin; pola 0 : tanpa ekspresi, pola 1 dermoepidermal
junction (+), pola 2 dermoepidermal junction (+). Dan sekelilingnya (+), pola 3
granulasi jaringan (+), pola 4 jaringan granulasi disekelilingnya dan kulit retikuler
dalam, dan pola 5 lapisan kulit terdalam namun tidak ada jaringan granulasi.

Gambar 2. Contoh luka senjata tajam (A-F)

Analisis Statistik
Digunakan person correlation di SPSS 9.05. P values kurang dari 0.05
dibertimbangkan sebagai signifikan secara statistik.
HASIL
Dari 74 kasus (83.15%) adalah pria dan 15 kasus (16.85%) adalah wanita. Rerata
umur adalah 39.44 tahun (range; 15-85 tahun). Diantara 170 sampel luka, 74
(43.5%) merupakan luka tembak, 20 (11.8%) trauma tumpul, dan 76 (44.7%) luka
akibat senjata tajam atau eksisi bedah, penelitian ini memasukkan semua kasus
diantara periode penelitian sehingga memiliki range jenis luka yang besar.
Tenascin negatif pada 123 kasus (72.4%), negative pada 98.3% pada kasus dengan
umur luka kurang dari 24 jam. Positif pada 91.8% kasus dengan umur luka lebih
dari 24 jam. Pola 0 mengindikasikan umur luka pada hari ke-0 ; pola 1 adalah hari
1; pola 2 adalah hari 3; pola 3 adalah hari ke 6; pola 4 adalah hari ke 1- dan pola 5
adalah hari ke 22. (gambar 6)
Rerata jumlah sel yang tampak pada ubiquitin adalah 10.56%, dengan 4.35%
pada kasus dengan umur luka kurang dari 24 jam, dan 26.14% pada kasus dengan
umur luka lebih dari 24 jam,. Pada analisis korelasi, baik tenascin (P = 0.0001) dan
ubiquitin (P= 0.0001) memiliki korelasi postif dengan umur luka. Namun pada
kasus dengan umur luka lebih dari 40 hari, tenascin ditemukan negatif, walaupun
ubiquitin menunjukkan ekspresi fibroblast. umur luka yang cocok dengan
parameter studi tidak berubah dengan tipe luka. (P>0.05).
Perbandingan umur luka berdasarkan bulan untuk tenascin dan ubiquitin
dapat dilihat pada gambar 7. Perbandingan dari ekspresi tenascin dan ubiquitin
menurut waktu luka diperlihatkan pada tabel 1 dan 2.

PEMBAHASAN
Untuk mendiagnosis secara pasti penyebab dan cara kematian, ini penting
untuk mendeskripsikan penemuan luka secara benar dan objektif. Untuk
menentukan umur luka seperti penyebab sebelumnya, pada sesaat atau setelah
kematian merupakan pertanyaan terpenting pada pemeriksaan luka forensik
disamping pertanyaan seperti bagaimana terjadinya, apa yang menyebabkan,
berapa jumlah serangan yang menjadikan luka tersebut, derajat luka yang
dihasilkan dan apakah terkait dengan kematian atau menyebabkan disabilitas. Jika
ada luka multiple, harus diklarifikasi apakah sama atau tidak. Penyembuhan luka
merupakan proses interaktif yang melibatkan mediator, komponen matriks
ekstraseluler, keratinosit, fibroblast, sel endothelial, sel saraf, dan leukosit
(walaupun luka itu seteril atau tidak). Beberapa literatur menunjukkan bahwa telah
di lakukan penelitian tentang penentuan umur luka dengan tenascin dan ubiquitin.
Ini merupaka penelitian pertama yang mana 2 protein di eksplorasi bersamaan dan
penggunaan skala untuk membedakan umur luka.

Gambar 3. Contoh bedah insisi (A-I)

Gambar 4. Contoh luka tumpul (A-D)

Gambar 5. Evaluasi ubiquitin (A) Positif pada kulit dapat dipertimbangkan sebagai
kontrol postiif; (B) kelompok 0 : tidak ada ekspresi; (C) Kelompok 1: <10%
positif pada sel inflamasi dan fibroblast (0-12 jam); (D) kelompok 2 : 11% - 20%
positif (1-5 hari); (E) kelompok 3: 21% - 50% positif (7-14 hari); (F) kelompok 4:
15% - 25% positif (17-21 hari).

ICAM-1, VCAM-1, dan selectin dapat ditemukan sebagai indikator dari vitalitas
luka, namun tidak menentukan waktu terbentuknya luka dalam hitungan hari. Pselectin menunjukkan untuk tejadinya ekspresi dari luka pada stadium awal (antara
3 menit dan 7 jam setelah cidera). Pengecatan kuat untuk ICAM-1 telah
diobservasi 1,5 jam setelah waktu cidera. Awal dan paling lambat adalah 3,5 jam
setelah cidera.
Oshima menunjukkan penggunaan analisis mRNA untuk pemeriksaan luka
forensic pada penelitiannya tentang interluikin 10, karena mRNA dapat dideteksi
dengan RT-PCR dalam waktu yang sangat lama setelah postmortem. Diantara
chemokines, rasio >50% dari IL-8 mengindikasikan umur luka paling tidak 1 hari,
jumlah sel apoptosis dideteksi secara labeling in-situ dari DNA terfragmentasi
yang ditemukan sebagai indikasi waktu setelah serangan dengan interval mencapai
3 minggu atau lebih dengan nilai melebihi 3 sel/0,0001 cm2.
Tenascin diketahui diproduksi oleh fibroblast dan sel mesenkim. Lokasi perubahan
ekspresi berdasarkan umur luka. Pada kulit normal tenascin dapat dideteksi pada
lamina basalis pada kapiler kulit dan folikel rambut. Pada literatur disebutkan ada 3
tipe penelitian tentang evaluasi luka. Yakni studi kultur sel, model hewan, dan
pembedahan atau kasus otopsi. Pada penelitian ini memiliki jumlah adekuat dari
kasus yang dikumpulkan dari otopsi yang diketahui umur lukanya. Kasus ini
dengan umur luka yang meragukan akan di ekslusi. Semua kasus memiliki data
klinis yang detail dan foto digital. Pemeriksaan karoskopik sangat berguna jika
direncanakan penlilaian clinicopathologic. Penelitian ini tidak termasuk evaluasi
makroskopik, karena semua kasus diketahui umur luka, dan secara makroskopis
merupakan konkordansi dari berbagai tipe luka.

Tipe luka yang temasuk dalam penelitian ini adalah luka tembak, luka tumpul, luka
tajam (senjata atau eksisi bedah). Tipe luka tidak memiliki efek terhadap penentuan
umur luka oleh ubiquitin dan tenascin. Pada penemuan ini terdapat dukungan kuat
oleh kemungkinan penggunaan marker terhadap estimasi umur luka.

Gambar

6.

Evaluasi tenascin (A) Positif pada kulit dapat dipertimbangkan sebagai kontrol
postiif; (B) Pola 0: tidak ada ekspresi ( hari ke-0) ; (C) pola 1: dermoepidermal
junction (+) (hari ke-1) ; (D) pola 2:

dermoepidermal junction (+) Dan

sekelilingnya (+) (hari ke-3); (E) pola 3 : granulasi jaringan (+) (hari ke-6); (F)
pola 4 : jaringan granulasi disekelilingnya dan kulit retiikuler dalam (hari ke-10)

Gambar 7. Perbandingan dari ekspresi tenascin dan ubiquitin menurut waktu luka

Alasan mengapa tenascin dan ubiquitin dipilih pada penelitian ini adalah
perbedaan tipe dan aktivitas. Ubiquitin termasuk area inflamasi, yang mana
tenascin merupakan komponen matriks ekstraseluler. Ini merupakan 2 bahan yang
umum untuk cidera dan perubahan penyembuhan luka berdasarkan waktu.
Kesimpulannya, tenascin dan ubiquitin bersamaan sangat berguna untuk
menentukan umur luka secara semi kuantitatif,untuk kepentingan aplikasi patologi
forensic. Penentuan ini tidak merubah tipe luka. Tenascin dan ubiquitin bersamaan
dapat memberikan keuntungan dalam menentukan umur luka lebih dari 40 hari.
Penentuan analisis mRNA dari beberapa parameter termasuk matriks ekstraseluler,
inflamasi dan ubiquitin terkait protein dapat dilakukan menggunakan RT-PCT
kuantitatif atau analisis microarray dapat memberikan informasi lebih dalam
penentuan waktu luka pada ilmu forensik.