Anda di halaman 1dari 5

ISOLASI DNA GENOM

Dr. Septelia Inawati Wanandi, DR rer. physiol dan Dr. MM. Vita Kumiati, MS

DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu DNA genom dapat
diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang,
liur dan lain-lain. Bahan yang paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan
rambut, karen a kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh.
DNA genom yang diisolasi dapat digunakan untuk identifikasi DNA suatu organisme, baik
dengan metode peR (polymerase chain reaction) atau menggunakan enzim endonuklease restriksi
("DNA fingerprinting"). Hasil pemeriksaan dengan kedua teknik tersebut kemudian dapat digunakan
untuk diagnosis penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus atau bakteri, mendeteksi adanya mutasi
gen yang menimbulkan penyakit keganasan, penyakit herediter, menentukan jenis kelamin prenatal
serta sebagai alat bantu dalam bidang kedokteran kehakiman.
Darah (whole blood) dan sumsum tulang mamalia mengandung baik selsel berinti (sel darah
putih) maupun sel-sel tidak berinti (sel darah merah). Untuk mengisolasi DNA dari darah dan sumsum
tulang, sel darah merah yang tidak mengandung DNA genom harus dilisiskan dahulu agar dapat
dipisahkan dari sel darah putih. Sel-sel darah putih yang sudah dipisahkan kemudian dilisiskan dengan
bantuan bahan perigawet DNA, yaitu deterjen anionik yang dapat melarutkan komponen seluler. Bahan
pengawet DNA juga dapat mengurangi aktivitas DNase yang terdapat di dalam sel. Bila perlu, dapat
ditambahkan RNase untuk menyingkirkan kontaminasi RNA.
Selanjutnya dengan presipitasi garam, DNA genom dipisahkan dari protein plasma dan inti.
Akhirnya, DNA genom diisolasi dengan presipitasi dengan alkohol dan pelarutarr kembali endapan
yang terbentuk dengan larutan dapar yang mengandung suatu bahan pengawet DNA. Hasil isolasi
DNA dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang murni dan utuh.
Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya > 35 Ilg DNA per mL darah. Dari 150 ilL
sediaan, hasil DNA yang diharapkan berkisar antara 2,5 sampai 7,5 mg. DNA yang diperoleh sangat
tergantung pada jumlah sel darah putih dalam sampel darah atau sum sum tulang. Jumlah sel darah
putih dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata terdapat 7 X 1Q6/mL darah. Tiap sel rata-rata
mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin lebih rendah bila sampel darah
dikumpulkan tanpa EDTA atau penyimpanannya tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5
hari sebelum digunakan dalam prosedur isolasi DNA ini.

Tujuan
Mempelajari cara mengisolasi DNA dari darah dan rambut.
Dasar
Prinsip isolasi DNA adalah melisiskan sel, memisahkan DNA dari protein, mengendapkan DNA,
melarutkan kembali DNA, menghitung jumlah DNA yang diperoleh dan menilai kemumian DNA.
Alat dan Bahan Alat
1. Tabung mikro
2. Pipet Eppendorf + tip
3. Pipet Pasteur
4. Alat sentrifugasi rnikro
5. Vorteks
6.Rak tabung mikro 7,. Inkubator
7. Alat pengering rambut
8. Spektrofotometer + kuvet
Bahan
1. Darah.
Sampel dapat berupa sampel segar atau dibekukan. Kumpulkan darah dengan EDTA untuk
mencegah pembekuan darah dan untuk mengurangi degradasi DNA. Untuk hasil yang optimum,
simpan sampel segar pada suhu 2 sampai 8 C tidak lebih dari 5 hari.
2. Bahan Isolasi DNA:
a. Larutan pelisis sel darah merah
b. Larutan pelisis sel
c. Larutan RNase A
d. Larutan pengendap protein
e. Larutan penghidrasi DNA
f. Isopropanol 100%
g. Etanol 70%
h. EDTA
3. Rambut.
Cabut 6 helai rambut beserta akarnya. Yang diperlukan untuk isolasi DNA hanya 5 mm
potongan 6 helai rambut dari ujung akarnya.

4. Larutan yang diperlukan untuk isolasi DNA rambut:


Bufer rambut 10 x, 5,0,uL
KCI 0,5 M 2,5,uL
Tris 0,1 MpH 9,0 Triton X-100 0,1 % 1,0,uL
MgCh 15mM - Tween-20 10 % ad 50,0,uL
Proteinase K 10 mg/mL
Akuabides steril
Cara Kerja:
ISOLASI DNA DARI RAMBUT
1. Masukkan 6 helai rambut yang sarna asalnya dengan panjang masingmasing kira-kira 5 mm dari ujung akar ke dalam tabung mikro 1,5 mL.
2. Tambahkan 50 mL larutan untuk isolasi DNA rambut yang telah disiapkan (akar rambut harus
terendam dalam larutan).
3. Inkubasi dalam penangas air 55 C selama 1 jam.
4. Inkubasi dalam penangas air 95 C selama 10 menit.
Larutan ini siap untuk dianalisis lebih lanjut dengan PCR atau e1ektroforesis.

ISOLASI DNA DAR! DARAH Lisis sel


1. Tambahkan 150,uL darah ke dalam tabung 1,5 mL yang berisi 450,uL
larutan pelisis SDM. Balik-balikkan tabung untuk mencampur sampel dengan larutan dalam
tabung, lalu inkubasikan 10 menit pada suhu ruang; balik-balikkan tabung sekali saat inkubasi.
2. Sentrifugasi pada 13.000 sampai 16.000 x g selama 20 detik. Buang supernatan dengan pipet
hingga tersisa butiran endapan sel darah putih yang dapat terlihat dan 10 sampai 20,uL sisa
cairan.
3. Vorteks kuat untuk mengapungkan kembali sel darah putih dalam sisa supernatan; tahap ini
sangat membantu lisis sel pada langkah berikutnya (langkah 4).
4. Tambahkan 150,uL larutan pelisis sel ke dalam tabung yang berisis sel darah putih tersebut lalu
pipetkan turun naik untuk melisiskan sel. Biasanya, tidak perlu diinkubasi; namun apabila
gumpalan sel masih terlihat setelah proses pencampuran, inkubasi pada suhu 37 C atau pada
suhu ruang hingga larutan homo gen. Sampel yang disimpan dalam larutan pelisis sel pada suhu
ruang, dapat tetap stabil selama sekurangkurangnya 18 bulan.

Perlakuan dengan RNase


1. Tambahkan 0,75,uL larutan RNase A ke dalam lisat sel.
2. Campurkan sample dengan membalik-balikkan tabung 25 kali dan diinkubasi pada 37 C selama
15 menit.
Pengendapan protein
1. Dinginkan sampel pada suhu ruang.
2. Tambahkan 50 ,uL larutan pengendap protein ke dalam lisat sel.
3. Vorteks kuat selama 20 detik untuk mencampurkan larutan pengendap protein dengan lisat sel
secara menyeluruh.
4. Sentrifugasi pada 13.000 - 16.000 x g selama 3 menit. Endapan protein akan membentuk butiran
coklat tua yang padat.
Pengendapan DNA
1. Tuangkan dengan hati-hati supernatan yang mengandung DNA ke dalam tabung 1,5 mL bersih
yang berisi 150,uL isopropanol 100%. Buang tabung yang mengandung butiran endapan protein.
2. Campur sampel dengan membalik-balikkan tabung 50 kali secara perlahan-lahan hingga benangbenang putih DNA membentuk gumpalan yang dapat terlihat.
3. Sentrifugasi pada 13.000 - 16.000 x g selama 3 menit; DNA akan tampak sebagai butiran putih
keeil.
4. Buang supernatan dan keringkan tabung dengan alat pengering rambut.
Tambahkan 150 mL etanol 70%. Balik-balikkan beberapa kali untuk
mencuci butiran DNA.

5. Sentrifugasi pada 13.000 - 16.000 x g selama 3 menit. Tuangkan etanol dengan hati-hati tanpa
mengeluarkan butiran DNA.
6. Keringkan tabung dengan alat pengering rambut lalu biarkan sampel mengering pada udara
kering selama 15 menit.
Hidrasi DNA
1. Tambahkan 50 ,uL larutan penghidrasi DNA kepada butiran DNA.
2. Biarkan DNA mengalami rehidrasi semalam pada suhu ruang. Sebagai pilihan lain, panaskan
pada suhu 65 C selama 1 jam. Ketuk-ketuk tabung secara periodik untuk menyebarkan DNA
dalam larutan.
3. Simpan pada suhu 2 - 8 C

Penghitungan ;umlah DNA yang diperoleh


1. lsi kuvet dengan 1 mL akuades.
2. Masukkan 1 - 5 ,uL DNA yang akan dihitung ke dalam kuvet. Kocok perlahan-lahan.
3. Ukur serapan DNA pada panjang gelombang 260 nm (A260)
Pada A260 = 1, konsentrasi DNA adalah 50 mg/mL
Konsentrasi DNA (mg/mL) = (A260 x 50,ug/mL) : pengenceran.
Jumlah DNA yang diisolasi (ug) = konsentrasi DNA (ug/mL) x Vol. larutan penghidrasi (uL)

Menentukan kemurnian DNA


1. Ukur serapan protein pada panjang gelombang 280 nm (A280)
2. Kemumian DNA ditentukan dengan indeks kemurnian.
Indeks kemurnian = A260/A280
DNA murni bila indeks kemurnian > 1,75
Pertanyaan:
1. Apakah artinya bila indeks kemurnian < 1,75? Perlu dilakukan apa?
2. Mengapa pada isolasi DNA darah, sel darah merah harus dilisiskan?