BAB I

PENDAHULUAN
Antimikroba peptida (AMP) adalah polipeptida endogen yang dihasilkan oleh
organisme multisel untuk melindungi host dari mikroba patogen. Antimikroba
peptida (AMP) didefinisikan sebagai pertahanan peptida host karena memiliki
peranan penting dalam sistem kekebalan tubuh. AMP umumnya terdiri kurang dari
50 asam amino dan ditandai dengan kationik amphipathic (Seo et al, 2012).
Antimikroba peptida terdiri dari 10-50 asam amino dan bekerja melawan organisme
patogen dengan mekanisme yang berbeda dengan berinterasi dan mengganggu
dinding sel bakteri pada dinding sel, membran sel dan bagian intraselular secara
langsung atau tidak langsung (Kotra et al, 2014).
Antimikroba peptida dianggap sebagai potensi sumber terapeutik dari
antibiotik masa depan karena memilik aktivitas spektrum yang luas dan mekanisme
yang berbeda dalam melawan infeksi dibandingkan dengan antibiotik konvensional.
Antimikroba peptida AMP memberikan manfaat yang besar seperti generasi baru
antibiotik, namun secara klinis dan komersial masih memiliki beberapa keterbatasan,
seperti toksisitas potensial, kerentanan terhadap protease, dan tingginya biaya
produksi antimikroba peptida (Seo et al, 2012). Maka dilakukan produksi dengan
menggunakan rekombinan hosts. Umumnya hosts yang digunakan adalah
Escherichia coli karena mudah dipahami sistem genetik dan produksi yang efektif.
Tetapi terdapat kendala yaitu dapat terjadi proteolisis, absorpsi yang rendah, biaya
produksi yang mahal dan sifak toksik. Untuk menghindari hambatan pada produksi
peptida, dirancang dan di kloning ke dalam hosts eukariotik yang memproduksi
peptida yang tidak memiliki efek samping. Hosts eukariotik seperti Pichia pastoris
merupakan hosts yang tepat untuk memproduksi terapi rekombinan. Saat ini telah
dilakukan desain untuk menghasilkan antimikrobial peptida kationik menggunakan
peralatan in silico kemudian dilakukan cloning dan ekspresi dengan menggunakan
Pichia pastoris. Pemurnian dilakukan dengan menggunakan 6X histidine dan analisis
peptida menggunakan mikroorganisme patogen pada bakteri gram positif dan gram
negatif (Kotra et al, 2014).

Pichia

pastoris

sering

digunakan

sebagai

platform

industri

untuk

memproduksi protein. Host Pichia pastoris dalam kombinasi dengan vektor dapat
dengan mudah terjadi sehingga mengekspersi gen dan menghasilkan protein. Garam
mineral sederhana dan lingkungan bioreaktor yang dikontrol membuat

Pichia

pastoris dapat dengan mudah tumbuh hingga kepadatan sel yang tinggi. Efisiensi dan
promoter

yang

diatur

(AOX1)

memungkinkan

untuk

memisahkan

antara

pertumbuhan bakteri dengan hasil produksi. Pichia pastoris hanya mengeluarkan

beberapa endogen, protein dan sekresi protein rekombinan sangat efisien. Pemisahan
protein rekombinan dari garam sederhana merupakan metode yang sederhana dan
mudah dilakukan. Penggunana host Pichia pastoris memiliki keuntungan yaitu
mudah dalam promoter gen dengan menggunakan alkohol oksidasi I, kemampuan
untuk stabil dalam ekspresi plasmid pada sisi spesifik, kemampuan untuk tumbuh
saat densitas tinggi dan mudah dalam proses pemurnian (Craveiro et al, 2006).

BAB II
METODE
2.1.

Media dan Strain

Host yang digunakan sebagai dasar yaitu E. coli DH5 yang diperoleh dari

MTCC, Chandigarh. Transforman rekombinan dipilih dalam bentuk padat Plate

Luria-Bertani dengan tambahan 25 g antibiotik (zeocin) per mL. P. pastoris GS115
digunakan sebagai host penerjemah yang diperoleh dari Invitrogen dan diperbanyak
pada benih ekstrak pepton dekstrosa (YEPD) plat agar mengandung ektrak benih
sebanyak 10 g/L, peptone sebanyak 20 g/L dan agar sebesar 20 g/L.
Strain rekombinan P. pastoris dipilih dari regenerasi medium dekstrosa
(RDB) plat agar mengandung benih basa nitrogen sebesar 13,4 g/L, dekstrosa sebesar
20 g/L, 1M sorbitol, campuran asam amino (L-glutamic acid, L-methionine, Llysine, L-leucine and L-isolucine) yaitu sebesar 50 mg/L, biotin sebesar 400 g/L
dan agar sebanyak 20 g/L. Untuk penumbuhan dan induksi digunakan media
penyangga metanol kompleks (BMMY) atau media penyangga gliserol kompleks
(BMGY) yaitu campuran media ekstrak benih sebesar 10 g/L, peptone sebanyak 20
g/L, basa nitrogen sebesar 13.4 g/L, 100 mM potassium fosfat (pH 6.0), biotin 400
g/L, gliserol 10 mL atau metanol 5 mL.
2.2.

Perangkat Komputasi
Sintesis antimikroba kationik peptida dirancang menggunakan perangkat

komputer/komputasi yaitu in-silico seperti misalnya Hierarchical Neural Network

(HNN),

Antimicrobial

Peptide

Database

(AMPD B)

dan Protparam (PP).

Pendekatan in silico mempelajari interaksi yang terbentuk antara protein dengan

substrat atau inhibitornya. Protein docking merupakan salah satu jenis pendekatan in
silico yang telah banyak digunakan untuk mempelajari interaksi yang terjadi antara
protein dengan ligan. Metode docking in silico yang digunakan pada penelitian ini
memberikan pendekatan sebagai alat bantu untuk mempelajari kompleks ligan
protein pada tingkat molekular namun perlu dilakukan verifikasi dengan hasil
laboratorium.

2.3.

Amplifikasi PCR
Gen antimikroba kationik peptida dirancang menggunakan overlapping PCR

dengan komponen primer yang diperoleh dari pusat studi di India. Komponen
sequence

primer

(72

mer)

dimulai

dari

CCGGAATTCATGGACGATGACGATAAGATGTGCCTTAAAGTCCGT'ATTTGG
TTTAAAATGGAGGCGGAGGAC

3 dan

kebalikan

primer

(77

mer)

TGCTCTAGAGCCGTTCATCTTGAAGCAGATGCGCACCTTCAGGCACATGTC
CTCCGCCTCCATTTTAAACCAAATAC 3). Tempat pembelahan Enterokinasi
(EK) tergabung dari akhir 5 primer dengan sisi perlekatan hidroksilamin
hidroklorida (Asn-Gly) di akhir 5 kebalikan primer. Reaksi PCR diatur dengan
denaturasi mula-mula pada suhu 95C selama 5 menit, diikuti dengan 25 siklus pada
95C selama 30 menit, 60C selama 45 detik dan 72C selama 45 detik dan terakhir
perpanjangan pada 72C selama 10 menit. Kemudian produk dibaca dan dipurifikasi
oleh PCR menggunakan Gen Elute PCR clean-up kit (Qiagen).
2.4.

Pembentukan Rekombinan Vector

Semua

langkah

kloning

molekular

dilakukan

sebagaimana

yang

dideksripsikan dalam Sambrook et al., 1989 (14). Produk PCR murni kemudian
secara ganda digunakan oleh EcoRI dan XbaI. Kemudian produk dihubungkan
dengan vektor pPICZ-B pada rasio 1:3. Kemudian campuran ligasi dikenalkan ke
dalam sel-sel E. coli DH5 dan konsentrasi paling tinggi dari resisten antibiotik
(zeocin) yang dilihat untuk keberadaan gen kationik sintetik antimikroba peptida. Di
lain pihak, koloni PCR telah digunakan gen spesifik primer dan rekombinan vektor
diambil untuk mengkonfirmasi keberadaan ligan, diikuti dengan sequencing DNA.
2.5.

Transformasi ke dalam P. pastoris

Plasmid rekombinan escAMP/pPICZ-B diukur menggunakan SacI dan

ditranformasi ke dalam P. pastoris oleh elektroporasi pada 2000 V dengan kuvet 0,2
cm. Setelah elektroporasi secara langsung 1 mL bekuan 1M sorbitol ditambahkan ke
dalam kuvet dan dibolehkan untuk diinkubasi selama 1 jam pada 30 C. kemudian
sel-sel ditanam dalam media agar RDB dengan konsentrasi berbeda (konsentrasi
menaik) dari Zeocin dan diinkubasi pada 30C selama 2-3 hari sampai terbentuk
koloni. Genomik DNA diisolasi dari bentukan menggunakan Qiagen Genomic DNA
Isolation Kit dan penerjemahan gen dikonfirmasi menggunakan gen primer pesifik.

2.6.

Terjemahan escAMP
Koloni resisten tertinggi Zeocin dipilih dan diinokulasi ke dalam baffled

shake flask mengandung 25 mL BMGY dan ditumbuhkan pada 30C selama 18-24
jam sampai kultur OD mencapai 600 antara 26. Kemudian, sel-sel dipanen dengan
sentrifugasi pada 2,000 X g selama 5 menit dan disuspensikan ke dalam BMMY
dengan metanol sebagai suatu inducer. 100% metanol ditambahkan ke konsentrasi
akhir 0.5% tiap 12 jam untuk memelihara induksi. Untuk mencegahglikosilasi dari
escAMP, eksprasikan di chamber terpisah dengan 20 g tunicamycin/mL dalam
medium induksi seperti yang dijelaskan dalam Sebban-Kreuzer et al., 2006 [15].
Hasil dianalisis pada 18% TricineSDSPAGE. Setelah sonikasi, konsentrasi
escAMP dihitung menggunakan metode Lowry.
2.7.

Pemurnian escAMP
Peptida yang dihasilkan mengandung suatu Cterminal 6X kemudian

dimurnikan menggunakan afinitas kromatografi dengan resin Ni 2+. Dalam hal

memurnikan peptida, 800 mg dari sel yang basah diperoleh dari kultur segar. Sel-sel
kemudian dipanen dan disentrifugasi pada 13,800 rpm selama 10 min pada
temperature ruangan. Kemudian pellet disuspensikan

dalam

12

mL

penyangga/buffer guanidinium lysis mengandung 7 M guanidine HCl, 22 mM

sodium fosfat, 510 mM NaCl dengan pH 7.8 pada 4C selam 1 jam. Sel yang lisis
kemudaian disentrifugasi kembali pada 13,800 rpm selama 10 sampai 15 menit pada
temperatur ruang. Volume 10 mL sel lisis dimurnikan dalam kolom mengandung 2
mL resin sama dengan denaturasi ikatan penyangga, diinkubasi selama 45 menit pada
temperatur ruang dengan pengocokan ringan selama beberapa saat. Kolom kemudian
dicuci dengan 6mL denaturing wash buffer dan dengan 6 mL native wash buffer.
Gumpalan peptida dielusi dengan 5 mL native elution buffer dan dianalisis pada
18% TricineSDSPAGE melawan protein penanda standar.
Setelah purifikasi, escAMP

diinkubasi dalam hydroxylamine

cleavage

buffer (2M hydroxylamine hydrochloride, 0.2 M Tris HCl, pH 9.0) selama 4

jam pada 45C diikuti pembelahan enterokinase. Reaksi dilakukan dalam keadaan
sampel dingin dan ditentukan pH kedalam bentuk asam. Setelah proses enzimatik
sampel peptida dialisa dengan 10 mM Tri Hcl, pH 8.0 selama 16 jam pada 4C
menggunakan 2.5 kDa (mula-mula) dan 3.5 kDa (terakhir) pemotongan membran

dan kemudian dialisa sampel pada Q Sepharose column matrix sama dengan larutan
penyangga. Ikatan peptida dielusi dengan gradien linear dari NaCl (01 M) pada
buffer yang sama. Elusi mengandung escAMP yang dialisa melawan 100 volume
20mM sodium acetate buffer, pH 4.5 dan melewati SP-Sepharose column matrix.
Ikatan escAMP dielusi menggunakan gradien linier NaCl (01 M) pada buffer yang
sama. Peptida yang murni dianalisis menggunakan 18 % Tricine SDS PAGE.
2.8.

Penentuan Aktivitas Antimicrobial

Aktivitas antibacterial dari sintetik rekombinan kationik peptida diuji

menggunakan difusi agar dengan bakteri E. coli. Di lain pihak minimal konsentrasi
penghambatan (MIC) dari pemurnian dan yang tidak dimurnikan escAMP ditentukan
melawan mikroba Gram negatif dan Gram positif yaitu Klebsiella pneumoniae,
Haemophilus influenza, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus dan Bacillus
subtilis dari penentuan penghambatan pertumbuhan.

BAB III
HASIL
3. 1.

Sintesis of escAMP
Panjang DNA yang disintesis sepanjang 102 bp dengan menggunakan PCR

overlapping. Hasil metode PCR dianalisis dan dikonfirmasi dengan produk dalam
2% gel agarose terhadap 100 bp DNA ladder. Gen digunakan sebagai tempat untuk
memperkuat escAMP dengan sisi pemotongan yang berbeda pada 5 akhir dan
produk yang diinginkan berukuran 120 bp DNA yang dikonfirmasi pada 2 %
agarose.

Gambar 1. Analisis PCR diperkuat pada Gen Rekayasa Sintesis Kationik

Antimikroba Peptida (esmAMP) dibandingkan 100 bp DNA Ladder
3. 2.

Konstruksi dari p PICZ-B-escAMP Ekspresi Vektor

Produk PCR dikloning pada p PICZ-B vektor antara sisi EcoRI dan Xba1

menggunakan T4 DNA ligase. Seelah dikonfirmasi PCR rekombinan plasmid

(pPICZ-B-escAMP), elektroporation kemudian dibawa ke P. pastoris untuk
diproduksi lebih dari 30 koloni dalam konsentrasi tertinggi zeocin 100 g/mL, tdiak
dalam konsentrasi normal yaitu 25 g/mL.

Gambar 2. Skematis Representasi Ekspresi Rekombinan Vektor pPICZ-B-escAMP

Klon rekombinan diisolasi dan dilinearisasi dengan SacI dan dimunculkan
pada P. pastoris menggunakan electroporation. Hasil bentuk rekombinan Pichia
pastoris berukuran 202 bp dari produk PCR menggunakan gen spesifik reverse
primer dan vektor spesifik forward primer dengan urutan

Gambar 3. Urutan DNA Rekombinan Sintesis Kationik Antimikroba Peptida

Diperkuat Menggunakan 5 AOX1 Pengurut Primer dan Gen Spesifik Reverse Primer
3. 3.

Ekspresi escAMP
Studi ekspresi genetik, menggunakan metanol sebagi penginduksi Pichia

pastoris GS115. Sistem ekspresi ini dipilih karena dirasa sederhana (simple). Semua
ekespresi peptida dianalisis dengan menggunakan 18% Tricine-SDS-PAGE terhadap
standar penanda protein dan hasil sangat jelas terlihat pada 6,1 kDa band yang
diidentifikasi sebagai protein dengan berat molekul rendah. Hasil diamati dengan
penyelidikan bersamaan dengan ekspersi pada E. coli.

1= Uninduced Pichia pastoris GS115

2 = Induced Pichia pastoris GS115
3 = Protein marker
4 = Uninduced recombinant Pichia pastoris GS115
5 = Induced recombinant Pichia pastoris GS115 (24 hrs)
6 = Induced recombinant Pichia pastoris GS115 (36 hrs)
7 = Induced recombinant Pichia pastoris GS115 (48 hrs)

Gambar 4. Tricine SDS PAGE Analisis Rekayasa Sintesis Kationik Antimikrobial

Peptida (esc-AMP)
3. 4.

Pemurnian Peptida
Pemurnian intraselular peptida menggunakan 6X histidina kolom dengan

melewatkan supernatan setelah disonikasi dan pembelahan secara enzimatik, TricineSDS-PAGE analisis kemurnian sampel ditunjukan dengan single band tipis pada 3
kDA yang konsisten sebagai berat molekul escAMP dan juga dikonfirmasi oleh
analisis western blot. Pada kuantifikasi, 580 mg / L peptida murni yang didapat.
3. 5.

Pengujian Aktivitas Antimikrobial

Pengujian antimikrobial dilakukan dengan menentukan aktivitas escAMP

yang murni dan tidak murni. Gambar 5 menunjukan zona bening disekitar daerah
pemberian konsentrasi escAMP yang dimurnikan dan tidak dimurnikan.

(A). Ve (PBS), (B) 25 l of unpurified escAMP, (C) 4 l of purified escAMP

Gambar 5. Aktivitas Antimikrobial escAMP pada E. coli

MIC dari escAMP terhadap mikroorganisme dapat dilihat pada tabel dibawah
ini:
Mikroorganiseme

Peptida Tidak Murni

Peptida Murni

Klebsiella pneumoniae
Haemophilus influenzae
Bacillus subtilis
Micrococcus luteus
Streptococcus aureus

(g/mL)
25
20
40
30
35

(g/mL)
4
3
5
4
3

Efek dari aktivitas antimikrobial yang berbeda konsentrasi dari escAMP pada
pertumbuhan bakteri patogen seperti Staphylococcus aureus dan Pseudomonas
aeruginosa dapat terlihat pada grafik, dimana 25 g/mL escAMP yang tidak
dimurnikan dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus dan 20 g/mL
escAMP yang tidak dimurnikan dapat menghambat pertumbuhan Pseudomonas
aeruginosa. Hasil murni rekayasa sintesis kationik AMP tidak menunjukan adanya
aktivitas hemolitik pada konsentrasi tertinggi (50 g/mL) pada malam hari
menunjukan kationik antimikrobial peptida tidak toksik pada RBC.

Gambar 6. Grafik Hubungan Konsentrasi terhadap Perambatan (A) Staphylococcus

aureus dan (B) Pseudomonas aeruginosa

BAB IV
PENUTUP
4. 1.

Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat diambil dari isi makalah ini adalah:

1. Antimikroba peptida terdiri dari 10-50 asam amino dan bekerja melawan
organisme patogen dengan mekanisme yang berbeda dengan berinterasi dan
mengganggu dinding sel bakteri pada dinding sel, membran sel dan bagian
intraselular secara langsung atau tidak langsung.
2. Antimikrobial peptida dapat digunakan untuk mengobati beberapa penyakit
infeksi yang ditimbulkan oleh bakteri Klebsiella pneumoniae, Haemophilus
influenzae Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Streptococcus aureus,
Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa.
3. Antimikrobial peptida dapat diproduksi menggunakan teknologi rekombinan
DNA untuk memperbaiki sifat hipersensitifitas dan penyerapan yang rendah.
4. Rekayasa sintesis dan sistem rekombinan dapat digunakan untuk meningkatkan
produksi dari escAMP dengan menggunakan ekspresi vektor pPICZ-B dan
menggunakan hosts bakteri Pichia pastoris.
4. 2.

Saran
Diharapkan pembaca dapat memberikan saran dan kritik dalam makalah ini

sehingga dapat diperbaiki dan memberikan manfaat yang lebih besar.

DAFTAR PUSTAKA

Craveiro, R.B., J. D Ramalho, J. R. Chagas, P. H. M. Wang, D. E. Casarini, J. L.

Pesquero, R. C. Arujo, J. B. Pesquero. 2006. High Expression of Human
Carboxypeptidase

in

Pichia

pastoris

Purification

and

Partial

Characterization. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 39:

211-217
Kotra, S. M., K. Sobha, V. Viharika, A. Pavan Kumar, P. Vengala Rao, M. M. V.
Kumari, K. Prasad, G. R. Teja, K. V. Rajesh, J. B. Peravali. 2014. Cloning and
High Level Production of Engineered Synthetic Cationic Antimicrobial Peptide
using Methanol Inducible Pichia pastoris GS115. International Journal of BioScience and Bio Technology. 6 (1): 21-30.
Seo M. D., H. S. Won, J. H. Kim, T. M. Ochir, B. J. Lee. 2012. Antimicrobial
Peptides for Therapeutic Applications: A Review. Molecules ISSN 1420-3049.
17: 12276-12286.