Pada pewarnaan sederhana bakteri Bacillus subtilis zat pewarna yang digunakan adalah kristal

violet. Biakan murni diambil dari tabung reaksi secara aseptik dan diletakkan langsung pada
objek glass kemudian difiksasi agar protein bakteri terkoagulasi serta dapat menempel pada objek
glass dan tidak ikut tercuci sewaktu dibilas dengan akuades. Hal yang dilakukan selanjutnya
adalah mengamati dalam mikroskop. Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis
diantara cover glass dan objek glass masih bisa menampung beberapa bakteri bacillus yang
ditumpuk vertikal, artinya tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke
bawah. Jangan menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar. Kontrol
sangatlah penting, meskipun kita sulit untuk mendapatkannya. Akan tetapi lebih baik jika bakteri
yang dilihat dapat dibandingkan dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti.
Dari pengamatan mikroskopis diperoleh bentuk morfologi dari bakteri Bacillus subtilis yaitu
strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), dan susunan bakterinya adalah berantai.
3. Pewarnaan sederhana pada Staphylococcus aureus
Kaca preparat diberi setetes air dan diberi bakteri Stapylococcus aureus, kemudian
dipaskan di atas api bunsen, dari sini akan nampak lapisan putih yang tipis,
semitransparan, dan rata yang menunjukkan adanya bakteri. Setelah smear
difiksasi, smear kemudian diberi pewarna basa yaitu metilen blue. Dalam
pemberian metilen blue ini, diusahakan agar menutupi semua lapisan tipis smear.
Pewarnaan dengan menggunakan metilen biru dibutuhkan waktu 2-60 detik, setelah
itu dicuci dengan aquades. Dari sini akan nampak lapisan yang sebelumnya
berwarna putih tipis dan semitransparan, akan berubah warna menjadi biru
transparan. Selanjutnya adalah milangkan sisa aquades dengan menggunakan
kertas tissue. Setelah itu dilihat dalam mikroskop dengan perbesaran 1000 X. dalam
mikroskop akan nampak bakteri Stapylococcus aereus berwarna biru matang dan
bentuk bulat berantai.
B. Pewarnaan Gram
1. Pewarnaan gram pada Bacillus subtilis
Pada pewarnaan ini digunakan empat pewarna, yaitu Kristal violet sebagai pewarna
utama, iodine sebagai pengikat warna utama (mordant), alcohol sebagai
dekolorisasi, dan safranin sebagai pewarna tandingan. Pada pengamatan dengan
menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil
(batang) dan merupakan bakteri gram positif. Ini bisa diketahui saat tahap
dekolorisasi. Pada tahap tersebut warna yang dihasilkan sama dengan warna
utama, yaitu warna ungu. Ini menunjukkan bahwa pada Bacillus subtilis memiliki
dinding yang tebal sehinnga saat bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut
yang akhirnya menyebabkan warna utama tidak bisa keluar. Pada Bacillus subtilis,
koloninya bergerombol sedikit terpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang.
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara
alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis juga telah berevolusi
sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat

mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam),

bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol.
2. Pewarnaan Gram pada Pseudomonas putida
Pada pengamatan genus Pseudomonas dengan menggunakan pewarnaan gram,
kami menggunakan bakteri Pseudomonas putida sebagai contoh yang mewakili.
Sebelum mewarnai perlu difiksasi di atas api bunsen, pertama kali, koloni bakteri
disuspensikan secara tipis di atas akuades. Smear yang tipis memberikan hasil
pada gelas objek dan dihomogenkan .Selanjutnya dilanjutkan dengan tehnik
pewarnaan. Pertama, menggunakan Gram A yaitu kristal violet, bakteri tampak
terwarnai ungu. Fungsi dari gram A adalah sebagai pewarna utama yaitu pewarna
yang pertama kali digunakan. Baik bakteri gram positif maupun gram negatif
memberikan warna yang sama pada pewarnaan dengan Gram A. Setelah itu,
diberikan perlakuan dengan Gram B yaitu iodin. Fungsi dari iodin adalah sebagai
mordant atau penguat warna. Kompleks UK-Y dapat terbentuk di dalam sel. Dengan
begitu, warna dari kristal violet tetap terjaga. Kemudian dilanjutkan dengan
pemberian Gram C yaitu alkohol, yaitu berfungsi sebagai peluntur warna
(dekolorisasi) dan dehidrasi sel. Pada saat itu, di dalam dinding sel bakteri
Pseudomonas yang tersusun atas selapis sel yang tersusun atas lipid. Lipid
tereksitasi dari dinding sel,pori-pori dinding sel bakteri mengembang. Kompleks UKY keluar dari sel sehingga sel menjadi tidak berwarna. Terakhir diberi pewarna
tandingan yaitu safranin. Pewarna tandingan dapat masuk apabila pewarna
utamanya telah keluar dari sel bakteri. Bakteri pseudomonas dapat terwarnai
merah. Dari uraian di atas, dapat dilihat bahwa Pseudomonas putida memiliki
karateristik mikroskopik sebagai berikut yang diamati di bawah mikroskop cahaya
yaitu :

Gram-negatif;

Berbentuk kokoid (batang pendek);

Tidak membentuk spora.

3. Pewarnaan gram pada Staphylococcus aureus

Pewarnaan gram bertujuan untuk mengelompokkan bakteri kedalam bakteri
negatif dan bakteri positif. Staphylococcus aureus adalah bakteri gram positif,
karena bakteri tersebut tetap mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu
proses pewarnaan gram, sehingga koloni bakteri tampak berwarna ungu atau biru.
Pemberian alkohol berfungsi untuk dekolorisasi bakteri, sehingga menyebabkan zat
utama dalam sel muncul, namun pada bakteri Staphylococcus aureus yang
termasuk gram positif jadi tidak terdekolorisasi, karena bakteri tersebut memiliki
membran plasma tunggal yang di kelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan
sisanya berupa molekul lain berupa molekul lain bernama asam teikhuat. Pada
proses pewarnaan terakhir adalah dengan pemberian safranin. Proses pewarnaan

ini akan menghasilkan bakteri dengan sel yang berwarna ungu tua atau biru, dan
kapsul yang berwarna biru terang. Staphylococcus aureus merupakan bakteri
gram positif yang tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh
berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter tiap sel 0,8 1,0 m. Bakteri
tersebut tumbuh optimum pada suhu 37 dengan waktu pembelahan 0,47/jam.
Bakteri tersebut merupakan bakteri virulensi karena menghasilkan kapsul yang
tebal untuk melindungi diri dari fagositosis host, selain itu bakteri tersebut
merupakan bakteri patogen.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut:
http://ratihkuspriyadani.blogspot.com/2010/11/laporan-praktikum-mikrobiologiumum.html
http://alexschemistry.blogspot.com/2013/10/laporan-pewarnaan-bakteripewarnaan.html
http://puputirasembiring.blogspot.com/