KROMATOGRAFI

AFINITAS

KROMATOGRAFI
AFINITAS
Kromatografi Afinitas
merupakan salah satu metode
isolasi.Pertama kali digunakan
pada proses adsorpsi selektif
enzim amilase oleh pati yang
tidak larut.

PRINSIP
Terjadinya interaksi secara biologis
antara molekul target (seperti pasangan
enzim-substrat) dengan ligan yang
diikatkan secara kovalen kepada suatu
matrks. Molkul yang terikat pada
padatan ini akan mengadsorpsi secara
spesifik analit yang berada dalam
campuran, semantara itu molekulmolekul pengotor tidak diadsorpsi

MATRIKS
syarat Matriks:
1. inert
2. interaksi non-spesifik kecil
3. longgar dan berpori
4. kaku
5. stabil pH
6. suhu dan kekuatan ion
7. mempunyai gugus yang dapat
dimodifikasi
untuk memudahkan
subsitusi lengan pada
matriks

Contoh Matriks
Agarosa
Sellulosa
Dextran
Sepharosa
Silika

4B

berpori

Poliakrilamida
Kombinasi

polimer

AKTIVASI MATRIKS
Matriks

perlu diaktivasi karena

gugus fungsionalnya tidak cukup
aktif
Metoda CNBr untuk aktivasi gugus
hidroksil
amida diubah menjadi karboksilat
Sianol diubah menjadi
aminopropilsilil

GUGUS FUNGSIONAL PADA MATRIKS

Hidroksil

(agarosa, dextran, selulosa)

Karboksil(

karboksimetilselulosa )

silanol

(silika )

Amida

( poliakrilamida )

LENGAN
Agar terjadi interaksi antara ligan yang terikat
kepada matriks dengan pusat aktif enzim
diperlukan lengan pengatur jarak yang
menghubumgkan ligan dengan pusat aktif enzim.
Panjang lengan merupakan faktor yang kritis.

LIGAN
Ligan

yang digunakan dalam kromatografi

afinitas harus memiliki afinitas yang spesifik
terhada makromolekul yang akan dipisahkan
dan reversibel.
Rintangan ruang dari matriks dikurangi
dengan menyisipkan rantai alkil pendek
(etilendiamin,pripendiamin)
Ligan spesifik mengikat hanya satu solut
Ligan spesifik terhadap gugus: mengikat
gugus-gugus tertentu

PENGARUH KONSENTRASI
LIGAN
Interaksi

molekul target dengan

ligan dipengaruhi oleh konsentrasi
ligan.
Konsentrasi ligan yang tinggi
melibatkan : Efisiensi pengikatan
berkurang, interaksi ligan dan
molekul target akan lebih kuat,
kemungkinan terjadinya interaksi
yang non-spesifik

PROSES ADSORPSI
Suhu efektif untuk kromatografi afinitas
umumnya 0-10C. Secara umum besarnya
adsorpsi menurun dengan naiknya suhu.
Pengikatan molekul target kepada permukaan
tergantung kepada kemungkinan tumbukan
antara biomolekul dengan ligan, terutama pada
pusat aktif.

PROSES DESORPSI
Proses desorpsi dapat dilakukan melalui
beberapa cara antara lain menggunakan buffer
denaturasi, ligan saingan atau senyawa saingan.
Bila interaksi antara molekul target (enzim)
dengan ligan lemah maka elusi bisa dilakukan
dengan menggunakan larutan buffer yang sama
dengan yang digunakan untuk proses adsorpsi.
Bila interaksi antara ligan dengan molekul
target (enzim) kuat untuk dilepaskan, maka elusi
harus dilakukan dengan cara mendenaturasikan
enzim.