Anda di halaman 1dari 19

JURNAL:

An Alternative Approach for Quantitative Bioanalysis using


Diluted Blood to Profile Oral Exposure of Small Molecule
Anticancer Drugs in Mice

NAMA KELOMPOK:
1. Dies Natalis Sihombing
(I21112007)
2. Ade Putri Yulianti
(I21112015)

TUJUAN
METODE :
1. Pengambilan sampel
2. Preparasi sampel
3. Metode analisis
. KESIMPULAN

TUJUAN
Untuk menunjukkan sebuah metode
bioanalitis kuantitatif untuk studi PK
menggunakan seluruh darah diencerkan
dari tikus serial berdarah yang
dievaluasi pada lima model senyawa
antikanker yaitu: dacarbazine, gefitinib,
gemcitabine, imatinib, dantopotecan,
secara diskrit atau kaset (-lima dalam
satu) dengan dosis oral.

BAHAN:

PELARUT

Amonium asetat
Air grade hplc
asasetonitril grade
hplc
dimethyl sulfoxide
( DMSO )
asam format.

Gemcitabine hydrocholoride
gemcitabine - 13C
15N2 hidroklorida ( IS )
hidroklorida topotecan
topotecan - D6 ( IS )
imatinib methanesulfonate
gefitinib
dacarbazine
Dacarbazine - D6 ( IS )
Imatinib - D8 ( IS )
Gefitinib - D8 ( IS

SAMPEL
Darah tikus - CD 1 menggenang dan
plasma diperoleh dari Bioreclamation
, Inc.( Hicksville , New York

1. Pengambilan sampel
Dalam Vivo Perempuan CD-1 Tikus
Studi PK
Plasma PK berikut Discrete Dosis
PK darah secaraDiscrete dan Kaset
Persiapan larutan Kerja untuk
Kalibrasi Curves
Kalibrasi Persiapan Curve

Dalam Vivo Perempuan CD-1 Tikus


Studi PK
Formulasi Dosis disiapkan dalam 0,5% berair
metilselulosa dengan 0,2% polisorbat 80 (MCT)
(v / w).
Hewan diberi dosis oral tunggal dari
senyawa tunggal (10 mg / kg masing-masing senyawa, diskrit
dosis) atau campuran dari lima senyawa (10
mg / kg masing-masing senyawa, lima dalam satu kaset
dosis)
pada volume dosis dari 5 mL / kg secara oral.
Formulasi gemcitabine adalah larutan, sedangkan
yang dacarbazine, gefitinib, dan formulasi imatinib
adalah suspensi. Topotecan adalah suspensi yang sangat
halus.
Hewan eutanasia menggunakan CO2 inhalasi.

Plasma PK berikut Discrete Dosis


Tikus secara acak ke dalam kelompok (n = 9 atau 12 tikus /
kelompok untuk mendapatkan tiga atau empat sampel darah / waktu
titik) dan senyawa yang diberikan secara individual.
Dua sampel darah diambil dari masing-masing
hewan berikut anestesi isoflurane.
satu darah Sampel ditarik melalui berdarah retroorbital (sekitar
0,1 mL) dan satu sampel darah melalui terminal
tusuk jantung (sekitar 0,2 mL) di 0,25 dan 2 jam, 0,5 dan 4 jam, atau 1
dan 6 jam postdose.
Sampel darah dikumpulkan dalam tabung microtainer
dengan ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) sebagai antikoagulan
dan berputar panen plasma.
plasmadikumpulkan, dipindahkan ke Polypropylene Costar klaster
tabung (format 96-baik) dan disimpan di sekitar -80C Sampai dicairkan
untuk analisis.

PK darah secaraDiscrete dan Kaset


DosisTikus secara acak ke dalam kelompok (n = 3 atau 4 tikus /kelompok)
dan senyawa yang diberikan secara individualatau sebagai kaset (limain-one) yang berisi semua lima senyawa. Enam sampel darah diambil
darisetiap hewan berikut anestesi isoflurane melalauikoleksi nick darah
pada 0,25, 0,5, 1, 2 (kecuali untuk gemcitabinesetelah dosis diskrit), 4,
dan 6 jam postdose.Sebelum tikus pengumpulan sampel ditempatkan di
bawahlampu panas (sekitar 3 menit) sampai lateralvena ekor yang
melebar. Sebuah jarum 27G digunakan untuk nickvena ekor lateral.
Tepat 10 atau 15: L darah yangdikumpulkan. Sebuah perpindahan pipet
positif digunakanuntuk meningkatkan pengumpulan sampel dan akurasi
perpindahandibandingkan dengan pipet udara perpindahan. Perawatan
adalahdiambil untuk menghapus semua darah berlebih dari luarujung
dengan kain kasa sebelum menambahkan sampel darah (10atau 15: L)
air (40 atau 60: L) untuk pengenceran lima kali lipat.Sampel disimpan
dalam polypropylene Costar klastertabung (format 96-baik) sekitar
-80C sampaidicairkan untuk analisis.

Persiapan larutan Kerja untuk


Kalibrasi Curves
Dacarbazine, gemcitabine, gefitinib, imatinib, dan
topotecan dan ISS dibuat pada 1 mg / mL dalam 100%
DMSO. Karena lima senyawa tersebut tertutup kaset,
larutan standar spiking komposit kerja
0,1 mg / mL dalam 100% DMSO disiapkan mengandung
semua lima senyawa. Selain itu, komposit IS
Solusi spiking (dengan semua lima ISS) disiapkan di
1000 ng / mL dalam 50% DMSO / 50% air. serial
diencerkan
kurva kalibrasi spiking solusi dibuat
100% DMSO

Kalibrasi Persiapan Curve


Jumlah yang tepat dari solusi kerja standar(5: L) dibubuhi ke 25: L
matriks(Baik plasma atau darah diencerkan) untuk
menghasilkankurva kalibrasi untuk dacarbazine (0.0165-110: M),
gefitinib (0,00671-44,7: M), gemcitabine(,0114-76,0: M), imatinib
(0,00607-40,5: M), dantopotecan (0,00713-47,5: M). Sepuluh mililiter
ISspiking solusi (1000 ng / mL) ditambahkan ke masing-masing
sampel.Kurva kalibrasi diekstraksi dengan proteinpresipitasi
kecelakaan dari 200: L asetonitril. Sampelkemudian vortexed selama
5 menit dan disentrifugasi pada6019g selama 15 menit pada 25C.
Setelah sentrifugasi, yangsupernatan dibagi menjadi pelat injeksi
yang berbeda.Tujuh puluh lima mikroliter supernatan
dipindahkanmasing-masing untuk dua 350L sumur dangkal piring
injeksi(Satu piring digunakan untuk quantitate dacarbazine
dangemcitabine; piring lain digunakan untuk quantitategefitinib,
imatinib, dan topotecan). Sepuluh mikrolitersupernatan dari setiap
piring langsung disuntikkanke sistem LC-MS / MS untuk analisis

2. Preparasi Sampel
Dua puluh lima mikroliter sampel (diencerkan
darah atau plasma) yang dipipet ke tabung
klaster individu
10: L IS spiking solusi (1000 ng / mL), 5: L dari
100% DMSO, dan 200: L asetonitril
ditambahkan ke masing-masing sampel.
Sampel kemudian divortex bersama dengan
sampel kurva kalibrasi dan diperlakukan sama
cara sebagai sampel kurva kalibrasi seperti
dijelaskan di atas

3. Metode analisis
Kondisi kromatografi
Kondisi spektrometri massa
Stabilitas darah dan Ekstraksi
Pemulihan
Analisis data PK

Kondisi kromatografi
sistem Nexera UPLC (Shimadzu, Kyoto, Jepang)termasuk Shimadzu SIL30AD sistem pengiriman pelarut,autosampler SIL-30AC, dan kolom CTO30ACoven digunakan untuk menganalisis semua lima senyawadan ISS
masing-masing. Untuk gefitinib, imatinib, dantopotecan, pemisahan
kromatografi dicapaidengan menggunakan kolom Phenomenex Kinetex
XB-C18 (50 2,1 mm2, 2,6: m) dengan gradien elusi menggunakan 5
mMamonium asetat dalam air dengan 0,1% asam format(Mobile fase A)
dan 0,1% asam format dalam asetonitril(Mobile phase B). Kromatografi
cair (LC)laju alir adalah 0,8 mL / menit dan injeksi sampelVolume adalah
10: L. Total waktu berjalan adalah 2,3 menit.Untuk dacarbazine dan
gemcitabine, sebuah SIELC Obelisc NKolom (50 2.1mm2, 5: m,
campur-mode HILIC, danpertukaran anion fase stasioner) dan mobile
yang samafase, laju aliran, dan volume injeksi yang digunakan.Total
waktu berjalan adalah 2,5 menit. Gradien rinciprogram ditunjukkan
pada Tabel 1. Waktu retensiadalah 0,85 menit untuk gemcitabine, 1.00
menit untuk topotecan,1.13 min untuk imatinib, 1,17 menit untuk
gefitinib, dan1,32 menit untuk dacarbazine.

Kondisi spektrometri massa


Sebuah QTRAP R? 5500 tandem spektrometer massa (Sciex,
Foster City, California) dengan Turbo ionspray sumber
(TIS) antarmuka dioperasikan di ionisasi positif
Modus dengan pemantauan reaksi beberapa untuk LCtandem mass spectrometry (LC-MS / MS) analisis.
Parameter instrumen dioptimalkan untuk pemantauan
lima senyawa ini adalah sebagai berikut: Suhu TIS:
500C; TIS tegangan: 5500 V; gas tirai: 20;
nebulizing gas: 50, heater gas: 50, dan gas tabrakan:
menengah. Para pendahulu untuk transisi ion produk dan
parameter rinci lainnya dirangkum dalam Tabel 2.
Spektrometer massa dioperasikan pada satuan massa
Resolusi untuk kedua Q1 dan Q3 quadrupoles

Stabilitas darah dan Ekstraksi


Pemulihan
Stabilitas gemcitabine, dacarbazine, gefitinib,imatinib, dan
topotecan dalam darah diencerkan dievaluasidengan spiking
senyawa dalam keseluruhan kosongsampel darah tikus
diencerkan dengan air (1: 4, v / v) padakonsentrasi 0,0549 dan
8.24: M untuk dacarbazine,0,0224 dan 3,36: M untuk gefitinib,
0,0380 dan 5.70: Muntuk gemcitabine, 0,0202 dan 3,04: Mfor
imatinib, dan0,0238 dan 3,56: Mfor topotecan (n = 3). kualitas
inicontrol (QC) sampleswere disimpan di sekitar-80C Selama 2
minggu sebelum analisis.Pemulihan ekstraksi gemcitabine,
dacarbazine,gefitinib, imatinib, dan topotecan di
diencerkanDarah juga dievaluasi pada dua konsentrasi yang
samasebagai stabilitas sampel QC. Pra-dan
postextractionsampel berduri (n = 3) dianalisis danpemulihan
ekstraksi dihitung dengan membandingkanrasio respon analit /
IS sampel prespikedengan sampel postspike (n = 3).

Analisis data PK
Analisis data farmakokinetik dilakukan
pada darah dan plasma konsentrasi-waktu
data menggunakan rata-rata (plasma) atau individu
(darah)
Data konsentrasi-waktu. Konsentrasi bawah
batas kuantisasi dianggap sebagai nol dalam
perhitungan nilai rata-rata untuk setiap titik waktu. PK
parameter yang ditentukan oleh noncompartmental
Metode menggunakan WinNonlin R? Enterprise, versi
5.2
(Pharsight Corporation, Mountain View, California).

KESIMPULAN
penelitian inimenunjukkan penerapan menggunakan Sampel darah
mikro diencerkan dengan tidak adanya antikoagulan untuk
bioanalysis kuantitatif molekul kecil untuk mendukung studi tikus.
Metode ini memberikan perbaikan proses signifikan dengan
meningkatkan efisiensi untuk koleksi sampel dan pengolahan dan
mengurangi sumber daya (misalnya, senyawa berkurang, biaya,
dan Kebutuhan hewan) dibandingkan dengan metode konvensional.
Metode ini bisa berlaku untuk studi efikasi untuk membangun
hubungan PK-farmakodinamik,skrining studi PK untuk profiling dan
mengidentifikasi obat antikanker secara lisan bioavailable dalam
penemuan obat,Studi toksisitas untuk membangun hubungan PKtoxicokinetic. Metode ini juga memungkinkan efisien penggunaan
hewan langka / terbatas dan berpotensi mahal untuk studi tikus
tidak rutin (misalnya, pada tikus knock-outuntuk mendapatkan
pemahaman yang lebih baik dari ADME)