I.

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Pewarnaan

pada

pemeriksaan

laboratorium

ini

dilakukan

dengan

menggunakan zat pewarna yang mempunyai kemampuan dalam mewarnai sel

organisme dan jaringan sesuai dengan sifat-sifatnya. Secara kimiawi, senyawaan
yang diberikan warna tersebut disebut chromophore yang bersifat tidak permanen.
Agar sifat memberi warna ini tetap, maka pada zat pewarna tersebut harus
mempunyai bagian yang disebut auxochrome (Suriawira, 2005).
Banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna) digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik. Telah dikembangkan prosedurprosedur pewarnaan untuk (Ermila, 2005).
Karena ukuran bakteri yang sangat kecil maka harus menggunakan alat optik
sebagai sarana untuk melihat keberadaan bakteri. Alat optik yang biasa digunakan
adalah mikroskop. Perkembangan mikroskop ini selanjutnya berupa mikroskop
electron. Dengan penggunaan alat yang jauh lebih canggih inilah bakteri tidak hanya
untuk dilihat melainkan timbulnya metode-metode baru penyiapan spesimen, telah
memungkinkan untuk mengenali bagian-bagian structural sebuah sel (Indra, 2008).
Penggunaan mikroskop ini

ternyata hanya terbatas pada mikroba tertentu,

dimana untuk mengadakan pengamatan pada mikroba yang transparan dan semi
transparan tidak dapat dilakukan karena tidak diperolehnya bagian-bagian sel dengan
teliti (Indra, 2008).
Maka untuk spesialisasi pengamatan terhadap jenis mikroba bersel transparan
dan semi transparan, diperlukan suatu metode khusus. Saat ini metode yang
digunakan adalah melalui pengecatan atau pewarnaan. Dengan pewarnaan dapat
dilihat struktur sel mikroba lebih seksama (Label, 2008).
Pengenalan bentuk (morfologis) mikroba, kecuali untuk kelompok mikroalga,
harus dilakukan melalui pewarnaan terlebih dahulu. Karena tanpa melalui
pewarnaan, maka bentuk tersebut tidak akan diamati secara jelas. Pewarnaan atau
pengecatan terhadap mikroba, banyak tilakuka secara langsung (bersama bahan yang
ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni) (Label,2008).

B. Tujuan
Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk mengenal bentuk pertumbuhan
koloni dan sifat-sifat karakteristik koloni bakteri pada berbagai bentuk media,
mengetahui cara mewarnai bakteri, mempermudah melihat bentuk jasad mikroba,
memperjelas ukuran dan bentuk mikroba.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Sistematika dan Morfologi Bakteri

Klasifikasi Listeria monocytogenes

Kingdom : Bacteria
Phyllum : Firmicutes
Class
: Bacilli
Ordo
: Bacillales
Familia : Listeriaceae
Genus : Listeria
Species : Listeria monocytogenes
Secara mikroskopis, L. monocytogenes (bakteri grampositif) nampak kecil,
tergolong bakteri Gram positif, berbentuk seperti tangkai yang kadang-kadang
membentuk rantai pendek. Sekilas memang bakteri ini nampak coccus, sehingga
kadang orang mengira bakteri ini streptococcus. Flagel akan dibentuk pada suhu
kamar tetapi bukan pada 37C. Aktivitas hemolitik pada darah digunakan sebagai
indikator yang membedakan Listeria monocytogenes dengan spesies Listeria yang
lain, tetapi ini bukan kriteria yang pasti dalam klasifikasi(Adams and Moss, 2008).
Klasifikasi Pseudomonas aeruginosa
Kingdom : Bacteria
Filum
: Proteobacteria
Kelas
: Gamma Proteobacteria
Ordo
: Pseudomonadales
Famili
: Pseudomonadaceae
Genus
: Pseudomonas
Spesies
: Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa (bakteri gram negatif) berbentuk batang, motil dan
berukuran sekitar 0.6 x 2 mm. Bakteri ini gram negative dan dapat muncul dalam
bentuk tunggal, berpasangan atau kadangkadang dalam bentuk rantai pendek.
Umumnya memiliki flagel polar, tapi kadang kadang 2 - 3 flagel. Flagelnya tidak
terletak pada kedua ujung kuman. Tidak berspora dan tidak berselubung. Struktur
dinding sama dengan family Enterobacteriaceae. Strain yang diisolasikan dari bahan
klinik sering mempunyai pili untuk perlekatan pada permukaan sel dan memegang
peranan penting dalam resistensi terhadap fagositosis. (Chen et al, 2009).

B. Habitat Bakteri
Habitat Listeria monocytogenes
Tempat hidup dari bakteri ini dapat dilihat dari sifat khas dari L.
monocytogenes dapat mempengaruhi distribusi makanan utama yang mampu melipat
gandakan pada suhu rendah. Bakteri ini dapat tumbuh dan terakumulasi pada
makanan yang terkontaminasi yang disimpan di lemari pendingin. Jadi tidak
mengejutkan listeriosis umumnya terdapat pada susu, daging atau produk sayuran
yang telah didimpan di lemari pendingin dalam waktu yang lama. L. monocytogenes
dapat menyerang epithelium (permukaan dinding) saluran pencernaan. Sekali bakteri
ini memasuki sel darah putih (tipe monocyte , macrophage , atau polymorphonuclear
dalam tubuh korbannya, bakteri ini masuk ke aliran darah (septicemia) dan dapat
berkembang biak. Keberadaannya di dalam sel fagosit memungkinkannya memasuki
otak, dan pada wanita hamil, mungkin masuk ke janin melalui plasenta. Sifat
patogenik L. monocytogenes berpusat pada kemampuannya untuk bertahan dan
berkembang biak di dalam sel fagosit korbannya (Chen et al, 2009).
C. Pewarnaan Gram Positif dan Gram Negatif
secara garis besar perbedaan antara bakteri gram positif dan sedangkan gram
negative adalah daya permebilitas gram positif, kompleks kristal violet yodium
terperangkap dalam dinding sel setelah perlakukan dengan etanol.

Hal ini

disebabkan pori-pori pada lapisan peptidoglikan yang mengecil. Pori-pori lapisan

gram negative setelah tetap kompleks melakukan kristal violet yodium. Dinding sel
bakteri gram negative mengandung lipid yang tinggi, Pencucian-pencucian
menyebabkan kompleks zat warna pertama terlepas. Struktur dinding sel positif
mengandung lipid yang rendah sehingga waktu penambahan alcohol terjadi dehidrasi
yang menyebabkan zat warna tetap tinggal dan bakteri berwarna ungu
(Pleczar,2000).
D. Jenis-jenis Pewarnaan Gram

Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada
dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian
alcohol, maka pori-pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini
menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan
mengalami denaturasi selama pemberian alkohol. Hal ini akan mengecilkan pori-pori
sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki
dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga
permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif
hanya memiliki 1-2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding
sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet,
Aalkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide,
Aquades), Gram C(Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades)
(Madigan, 2003).
E. Tenik pewarnaan Gram
Pada tahapan pewarnaan gram dilakukan proses fiksasi. Proses fiksasi ini
bertujuan untuk melekatkan sel bakteri pada kaca objek, untuk membunuh

sel

bakteri tanpa merusak sel bakteri gram pasitifataupun negative. Bakteri garam
positif berwarna ungu yaitu bakteri yang dapat mengikat kuat violet kristal dan tidak
luntur karena aseton alkohol. Sehingga tidak terpengaruh cairan safranin. Bakteri
garm negatif berwarna merah muda yang merupakan bakteri yang dinding selnya
tidak dapat menyerap kuat cairan utama violet kristal sehingga mudah luntur oleh
alkohol dan akhirnya tertutup pewarna safranin (Fuad, 2002).
Menurut jenis pewarnaanya, pewarnaan sederhana menggunakan satu jenis zat,
digunakan untuk melihat bentuk, ukuran dan pengaturan bakteri, cat dasar yang
bermuatan positif dengan metilin blue atau kristal violet. Sedangkan pada pengecatan
diferensial, menggunakan beberapa jenis zat, digunakan untuk mengelompokkan
bakteri, seperti pengecatan gram atau pengecatan acid-fast (Suryanto, 2006).
Macam-macam pewarna menurut asal diperolehnya, zat pewarna dibedakan atas
zat pewarna alamiah dan zat pewarna sinterik. Zat pewarna alamiah misalnya yang
terdapat pada tumbuhan seperti pada tanaman kunyit, tanaman suji. Dan sedangkan

zat pewarna sintetik diperoleh dari hasil industri kimia, misalnya neutral red.
Menurut sifatnya, zat pewarna dibedakan atas zat pewarna asam dan basa. Zat
pewarna asam merupakan garam dari asam-asam pembawa warna dengan radikal
basa yang tidak berwarna, misalnya eosin (akan berwarna merah). Zat pewarna basa
merupakan garam dari basa-basa pembawa warna dengan radikal asam yang tidak
berwarna, misalnya hematoxylin (akan berwarna biru). Menurut kemampuan
mewarnai jaringan, zat warna dibedakan atas zat warna substantive dan zat warna
ajektif. Zat warna substantive merupakan zat warna yang langsung dapat mewarnai
jaringan baik misalnya eosin, neural red. Zat warna ajektif adalah zat warna yang
dapat mewarnai jaringan dengan bantuan suatu moderat (Soetarto, 2002).
Kebanyakan mikrobia tumbuh dalam populasi campuran. Untuk mengidentifikasi
mikrobia tersebut, termasuk pengujian morfologi, fisiologi, dan serologi, sebelumnya
dilakukan isolasi dari habitatnya. Isolasi mikrobia ialah memindahkan mikrobia
tersebut dari lingkungannya di alam dan menumbuhkan sebagai biakan murni dalam
medium buatan. (Soetarto, 2002).
Faktorfaktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba
antara lain sifat jenis mikroba yang akan diisolasi, tempat hidup atau asal mikroba
tersebut, medium untuk pertumbuhannya yang sesuai, cara inkubasi mikrobia, cara
menanam mikroba tersebut, cara menguji bahwa mikrobia yang diisolasi telah berupa
biakan murni dan sesuai dengan yang dimaksud, cara memelihara agar mikrobia
yang telah diisolasi tetap merupakan biakan murni Caracara untuk mengisolasi
khamir yaitu dengan cara Hansen dengan menggunakan ruangan lembab (moist
chamber method of Hansen), cara pengenceran (dilution method), cara Linder (the
Linder method), dan dengan metode micromanipulator (Indra, 2008).
Cara pengecatan bakteri umumnya menggunakan lebih dari satu tingkat
pengecatan dimana hasil pengecatan sangat dipengaruhi oleh beberapa paktor seperti
fiksasi, substrat, dan cat peluntur. Sebelum bakteri dicat harus dilakukan fiksasi
terlebih dahulu, cara yang paling banyak dilakukan ialah cara fisik (Label, 2008).

III. PELAKSANAAN PRAKTIKUM

A. Tempat dan Waktu
Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium bersama Teknologi Hasil
Praktikum Perikanan dan Budidaya Perairan Fakultas Pertanian, Universitas
Sriwijaya, Indralaya. Praktikum ini dilaksanakan pada hari Kamis, 06 maret 2014,
dimulai pada pukul 14.30 WIB sampai dengan selesai.

B. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah Jarum Ose, Kaca Objek.
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah Pewarna A (Crystal violet),
pewarna B (Lugols iodine), Pewarna C (Alkohol 96%), Pewarna D (Safranin), Pipet
Tetes, dan Tabung reaksi.
C. Cara Kerja
Pewarnaan Gram :
Bakteri di fiksasi diatas kaca objektif
Setelah dingin
Pewarna Violet
Cuci dengan aquadest mengalir
Tetesi Iodine
Cuci dengan aquadest mengalir
Tetesi alkohol
Cuci dengan aquadest mengalir

Tetesi Safranin
Cuci dengan aquadest mengalir
Kaca preparat dikeringkan pada suhu 50oC

Amati dibawah mikroskop

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
Pengecatan Gram
1. Objek

: Bakteri

2. Warna yang dihasilkan

: Pink (Negatif)

Bakteri gram positif

Pseudomonas airoginosa

Alat pembesaran (mikroskop)

Untuk melihat bakteri yang terdapat pada kaca preparat tersebut, tidak bisa
dilihat menggunakan mata secara langsung. Butuh alat pembesaran yang digunakan
untuk melihat bakteri ini menggunakan mikroskop.
B. Pembahasan
Pada praktikum kali ini yaitu percobaan pewarnaan gram, adapun proses yang
perlu dilakukan yaitu proses fiksasi yang merupakan proses mematikan bakteri yang
tidak diinginkan secara cepat. Proses ini awalnya dilakukan dengan membakar kaca
objek yang akan diletakkan dengan mikroba atau bakteri. Lalu kaca objek tersebut
dilumuri dengan bakteri yang akan diamati. Setelah itu dibakar lagi agar untuk
membunuh bakteri-bakteri yang tidak diinginkan.
Langkah yang harus dilakukan yakni, bakteri yang telah difiksasi diatas kaca
objek, setelah dingin bakteri Staphylococcus aureus, Eschericia coli dan campuran
ditetesi dengan pewarna violet dan biarkan selama 1 menit 30 detik lalu dibilas
dengan menggunakan air mengalir selama 30 detik. Setelah itu tetesi lagi dengan
larutan iodine yang berfungsi untuk penguat warna dan biarkan selama 3 menit. Dan
bilas kembali dengan air mengalir selama 20 detik. Lalu ditetesi lagi dengan larutan
alcohol yaitu larutan etanol yang berfungsi sebagai pencuci selama 5 10 detik
jangan sampai kelamaan karena alkohol dapat menghilangkan warna. Lalu bilas lagi

dengan air mengalir selama 1 menit dan terakhir tetesi dengan larutan safranin
selama 1 menit dan bilas kembali denga air yang mengalir selama 1 menit. Lalu
amati dengan mikroskop.
Hasil pewarnaan pada bakteri gram, bila pada bakteri gram positif
(Staphylococcus aureus) akan berwarna ungu violet. Dan pada pewarnaan gram
negative (Eschericia coli) akan berwarna merah. Tetapi pada percobaan kali ini pada
pengecatan gram negative warna yang dihasilkan adalah warna ungu. Hal ini
menandakan adanya kesalahan pada saat praktikum. Kemungkinan yang terjadi
dikarenakan kesalahan pada pemberian pengecatan atau pada pembilasan bakteri.
Faktor-faktor yang mempengaruhi dalam pewarnaan mikrobia antara lain fiksasi,
peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarna untuk mempercepat pewarnaan
mikrobia sehingga zat akan terikat lebih mudah di dalam jaringan. Zat pewarna
penutup untuk memberikan warna kontras pada sel mikrobia, yang diwarnai yang
tidak menyerap warna pula.
Tujuan dari pewarnaan bakteri antara lain untuk mempermudah melihat bentuk
jasad mikroba, memperjelas ukuran dan bentuk jasad mikroba, memungkinkan untuk
pengamatan struktur luar dan dalam jasad mikroba dan melihat reaksi jasad terhadap
pewarnaan yang diberikan.

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan kali ini adalah :
1.

Bakteri Staphylococcus aureus adalah bakteri yang termasuk dalam bakteri

gram positif yang berwarna ungu.

2.

Hasil pewarnaan pada bakteri gram, bila pada bakteri gram positif
(Staphylococcus aureus) akan berwarna ungu violet

3.

Bakteri Eschericia coli adalah bakteri yang termasuk dalam bakteri gram
negative yang berwarna merah.

4.

Dan pada pewarnaan gram negative (Eschericia coli)

warna yang

dihasilkan yaitu pink.

5.

Tujuan dari pewarnaan bakteri antara lain untuk mempermudah melihat

bentuk jasad mikroba, memperjelas ukuran dan bentuk jasad mikroba.

B. Saran
Untuk mempermudah melihat bentuk jasad mikrobia, atau memperjelas
ukuran dan bentuk jasad mikrobia dilakukan pengecatan terhadap bakteri yang
diinginkan. Pada saat pewarnaan haruslah perlu kehati-hatian untuk mendapatkan
hasil yang baik. Selain itu perlu juga diperhatikan mengenai fiksasi terhadap
bakteri dan alat-alat yang akan digunakan, proses pelunturan warna, substrat,
intensifikasi pewarna untuk mempercepat pewarnaan mikrobia, karena hal ini
merupakan faktor-faktor yang mempengaruhi dalam pewarnaan mikroba.

DAFTAR PUSTAKA

Ermila, Mila.2005. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar . [skripsi]. Universitas

Jenderal Soedirman.
Indra. 2008. Media- pertumbuhan.[skripsi]. Universitas Makassar.
Label, Caray. 2008. Pembuatan media agar dan-sterilisasi. 8(2):15-17.
Soetarto. 2002. Bakteri dan jamur. Erlangga. Jakarta.
Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.
Suryanto, D. dan E. Munir. 2006. Bahan Ajar : Mikrobiologi. Medan :USU-Press.