V.

PERTUMBUHAN MIKROBA
TUJUAN
1. Memahami teknik pengukuran pertumbuhan mikroba
2. Memahami fase-fase pertumbuhan mikroba dalam medium terbatas sistim batch
3. Mengetahui korelasi antara dua macam data pengamatan (jumlah sel mikroba vs
nilai absorbansinya)

5.1 KURVA PERTUMBUHAN

PRINSIP DASAR
Dinamika pertumbuhan mikroba dapat dipahami dari kurva pertumbuhannya, yang
dibuat dengan cara mengukur biomasa selnya tiap selang waktu tertentu kemudian
mengalurkan hasil pengukurannya dalam sebuah grafik yang menunjukkan hubungan
antara biomasa pada suhu y versus periode waktu pengukuran pada sumbu x. Kurva
pertumbuhan dalam sejumlah medium terbatas akan mengalami fase-fase sebagai
berikut : fase lag (adaptasi), fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian.
Selanjutnya selain mengetahui fase pertumbuhan juga dapat dihitung waktu generasi,
yaitu waktu yang dibutuhkan untuk penggandaan jumlah sel dari jumlah awal yang
diinokulasikan.
Jumlah sel mikroba sangat banyak sehingga untuk memasukkan datanya dalam kurva
pertumbuhan, digunakan angka hasil konversi logaritmik.
Jika datanya tidak
dikonversikan ke nilai log, kurva pertumbuhan dapat dibuat pada kertas logaritma.
Penentuan atau penghitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan metode langsung
atau metode tidak langsung seperti spektrofotometri dengan mengukur nilai OD (optical
density = kepadatan bakteri yang terlihat sebagai kekeruhan medium).
Waktu generasi dapat ditentukan menggunakan metode tak langsung dengan
ekstrapolasi sederhana dari kurva pertumbuhan. Setelah kurva pertumbuhan terbentuk,
dipilih dua titik pada sumbu y (ordinat) yang merupakan nilai kelipatan dua, misalnya
0,2 dan 0,4. Kemudian ditarik garis lurus horizontal dari kedua titik ke arah kurva, lalu
dari titik potong pada kurva ini ditarik garis tegak lurus vertikal ke arah sumbu x (absis).
Kedua titik potong pada absis menunjukkan interval waktu yang dibutuhkan oleh
populasi sel untuk menggandakan populasinya yang disebut dengan waktu generasi
atau `generation time`.

22

GT = t (4) - t (2) jam

GT : generation time
t : waktu

Cara lain dapat diperoleh dari hasil penghitungan langsung hasil metode Total Plate
Counting (TPC) plus pengenceran menggunakan rumur sbb:
GT

tLog2
Logb LogB

GT : waktu generasi
B : jumlah sel pada awal penghitungan
b : jumlah sel pada akhir penghitungan
t : interval waktu antara B dan b

Pembuatan kurva pertumbuhan sangat penting terutama dalam

kultur yang kita miliki mesti dipanen. Hal ini tergantung tujuan
mendapatkan inokulum yang aktif pemanenan dilakukan pada
Sedangkan untuk mendapatkan produk metabolit sekunder,
dilakukan pada fase stasioner.

menentukan kapan
pemanenan. Untuk
fase eksponensial.
maka pemanenan

Dalam praktikum ini praktikan akan melakukan latihan pengambilan data untuk
pembuatan kurva pertumbuhan dalam selang waktu yang terbatas untuk mendapatkan
beberapa fase dari pertumbuhan mikroba. Karena pertumbuhan secara keseluruhan
sangat dipengaruhi oleh keberadaan nutrien, untuk itu jumlah medium yang dipakai
adalah terbatas.

BAHAN DAN PERALATAN

23

Kultur E. coli umur 12 jam dalam medium kaldu nutrisi cair. Fase pertumbuhan ini
dapat dipertahankan dengan menyimpannya dalam lemari es
ml medium kaldu cair steril dalam labu Erlenmeyer 250 ml
`Waterbath shaker incubator` suhu 37C, spektrofotometer, pipet steril ukuran 1 ml
dan 10 ml, lampu spiritus atau Bunsen.

PROSEDUR KERJA
1. Masukkan (inokulasikan) 5 ml kultur E. coli menggunakan pipet ke dalam kaldu
nutrisi cair steril
2. Ukur OD dari hasil inokulasi tersebut sesegera mungkin pada = 600 m
menggunakan spektrofotometer (OD awal biasanya berkisar sekitar 0,1)
3. Letakkan kultur pada waterbath shaker inkubator 37C
4. Ulangi pemeriksaan OD setiap 30 menit sekali. Nilai OD pada setiap kali
pengukuran harus pada nilai 0,05 0,5. Jika terlalu pekat, cuplikan kultur harus
diencerkan dengan medium cair steril sesuai keperluan.
5. Hasil pengukuran OD diplot pada kurva dengan OD sebagai ordinat dan waktu
sebagai absis.
6. Hitung waktu generasinya

5.2 KURVA BAKU

PRINSIP DASAR
Kurva baku (standar) sering dibutuhkan untuk memudahkan pekerjaan yang berulang
dalam penghitungan sel mikroba. Dengan membuat kurva baku sekali saja, selanjutnya
persamaan kurva baku tersebut dapat dipergunakan seterusnya dalam penghitungan
sel yang sama yang sifatnya berulang. Pembuatan kurva baku melibatkan
penghitungan langsung (direct count) dengan teknik TPC atau dengan alat
haemocytometer dan pengukuran nilai OD. Angka penghitungan langsung akan
berkorelasi langsung dengan nilai OD yang didapat yang selanjutnya dapat dinyatakan
dalam persamaan garis lurus.
BAHAN DAN PERALATAN :

Kultur Saccharomyces cereviciae dalam medium NB.

Akuades steril dalam 4 buah labu Erlenmeyer 250 ml steril @ 99 ml
Akuades steril dalam 4 tabung steril @ 9 ml
Mikropipet
Alat haemocytometer

PROSEDUR KERJA
1. Beri label Erlenmeyer yang berisi 99ml NaCl 0,85% steril dengan 10-2, 10-4, 10-6, dan
10-8.
2. Beri label tabung yang berisi 9ml air steril dengan 10-3, 10-5, 10-7, dan 10-9
3. Encerkan kultur inokulum hingga tingkat pengenceran 10-9 dengan memipet
sebanyak 1 ml secara bertahap dari pengenceran rendah ke yang lebih tinggi.
4. Periksalah OD kultur hasil pengenceran inokulum pada = 600 m menggunakan
spektrofotometer.
24

5. Secara paralel lakukan penghitungan jumlah sel untuk tiap sampel pada tingkat
pengenceran secara langsung dengan alat haemocytometer
6. Buatlah kurva dengan memplot hasil pengukuran OD terhadap jumlah sel ragi
dengan program Excel. Jumlah sel dinyatakan sebagai ordinat, sementara OD
sebagai absis.
7. Dengan regresi linier cari persamaan garis hubungan antara absorbansi dengan
jumlah sel.

25