PENGARUH PENAMBAHAN ZAT-ZAT ADITIF PADA AKTIVITAS

PROTEASE OLEH Bacillus megaterium DSM 319

Sumaryanto 1,2), Deden RW 3), Mahyudin AR 3)
1) PPKIT BPPT 2) FFUP 3)P3TB,TAB BPPT

sumary13@hotmail.com
Abstract
Bacillus megaterium DSM 319 is a microbial neutral protease producer, which is usually used for food and
non food (especially for dehairing and bating processes) industries. It was shown in this experiment, that
the addition of some additif substances such as sodium benzoat, ammonium quarterner, calcium chloride
and zeolite tested as a stabilizer of the ability for protease enzyme activities maintain comparing with
control, the application for the leather process was sign the difference performance
By using Anova and Duncan methode analysis at the 4 additif substances above from 0%, 0,5% 1% and 2%
can be seen that the highest activity of protease reached at 0,862 U with sodium benzoat and the lowest
activity at 0,636 U with zeolite.
Kata kunci: Bacillus megaterium, protease, zat aditif, anova.

I.

PENDAHULUAN

Akhir-akhir ini banyak industri pangan dan

non-pangan menggunakan enzim-enzim seperti
protease, lipase, amilase, silanase glukosa
isomerase, dll.
Nilai ekonomis perdagangan
mencapai 18 triliun rupiah di Indonesia,
pengguna utama enzim adalah industri pangan
(45 %), deterjen dan kulit (34 %), tekstil (11 %),
diagnostik dan biomedis (5,5%), pulp dan kertas
(1,5 %) (Suhartono, 1992). Penggunaan di
industri kulit sudah mulai berkembang dan bisa
menggantikan fungsi bahan kimia misal: Na2S,
Krom heksavalen dll dan aplikasinyapun dapat
digunakan untuk proses pencabutan bulu
(dehairing) dan pengkikisan lemak (bating)
Protein merupakan komponen utama dalam
semua sel hidup, sedangkan enzim adalah
kelompok protein majemuk (holoenzim yang
terdiri dari protein (apoenzim)) dan suatu gugus
bukan protein (kofaktor) yang merupakan bagian
enzim yang aktif (active site) (Poedjadi, 1994).
Protein yang berfungsi secara biologis, sangat
penting memiliki struktur khusus yang dapat
didefinisikan dengan baik, adanya gangguan
pada struktur ini mungkin menghasilkan
denaturasi yang dapat mengurangi aktivitasnya
(Baas, 1990).
Enzim adalah protein yang terdapat di dalam
sel hidup, berfungsi sebagai katalisator dalam sel
dan memiliki sifat sangat khas. Proteolitik enzim
berperan sebagai biokatalisator untuk reaksi
pemecahan protein menjadi molekul lebih
sederhana (Wirahadikusuma, 1989).
Enzim
protease dihasilkan oleh hewan, tumbuhan dan

mikroba.
Dibanding dengan hewan dan
tumbuhan, mikroba lebih cepat tumbuh sehingga
diharapkan produksi enzim berlangsung dalam
waktu yang singkat dan dikembangkan dengan
pengembangan dan eksplorasi galur.
Enzim membutuhkan kofaktor, yaitu
senyawa non protein yang dengan protein inaktif
(apoenzim) secara kombinasi untuk membentuk
kompleks katalitik yang aktif. Bailey dan Ollis
(1988), menyatakan bahwa salah satu
karakteristik pembeda enzim dengan katalis
sintetik adalah seringnya enzim memerlukan
kofaktor. Kofaktor bisa berupa molekul organik,
seperti ion Fe2+, Mn2+, Zn2+, Na+, Mg2+, Cu2+,
Ca2+ atau juga suatu molekul organik komplek
yang disebut koenzim seperti tiamin pirofosfat,
FAD, serta koenzim A.
Beberapa enzim
membutuhkan koenzim maupun satu atau lebih
ion logam bagi aktivitasnya (Lehninger, 1993).
Jenis kation yang telah diketahui dapat
mengaktifkan enzim adalah Na+, K+, Rb+, Cs+,
Mg2+, Ca2+, Cd2+, Cr3+, Cu3+, Mn2+, Fe2+, Co2+,
Ni2+, Al3+, dan H+ (Richardson dan Hyslop,
1985). Ion Mg2+ dan Ca2+ sedikit meningkatkan
aktivitas
enzim
protease
dari
B.
stearothermopillus. Ion logam seperti Ca2+,
Co2+, Mg2+, Sr2+, dan Zn2+, dapat melindungi
protease asam dari Paecilomyces terhadap
inaktivasi oleh panas. Amino peptidase dari E.
coli memerlukan Mg2+ dan Mn2+ untuk
memperoleh aktivitas maksimumnya, sedangkan
aminopeptidase dari B. subtillis di stimulasi oleh
ion Co2+ (Suhartono, 1989).
Obrien dan
Cambell (1975), menyatakan bahwa penambahan

ion Ca2+ dan Mn2+ akan meningkatkan aktivitas

protease B. stearothermopillus yang telah di
dialisis.
Ion logam melakukan peranan yang penting
dalam menjaga kestabilan enzim dan berperan
sebagai pengatur aktivitas enzim (Harper et al,
1979), sedangkan (Sukarno et al., 1995),
menyatakan bahwa pengaruh ion logam terhadap
enzim protease sangat bervariasi tergantung dari
jenis logam yang bersangkutan. Pengaruh ion
logam terhadap aktivitas enzim protease dapat
diurutkan dari yang kecil ke yang besar sebagai
berikut: Hg+< Ag+< Fe2+< Li+< Ca2+< Mg2+<
Zn2=< NH4+< Na+< K+< Ba2+.
Penentuan daya tahan enzim dilakukan pada
waktu
penyimpanan.
Semakin
lama
penyimpanan dilakukan, aktivitas enzim akan
berkurang, karena adanya denaturasi protein dan
perubahan substrat (Suhartono, 1989), oleh
sebab itu penambahan senyawa kimia
dibutuhkan untuk mempertahankan aktivitas
enzim
semaksimal
mungkin
dengan
bertambahnya waktu penyimpanan.
Menurut Peraturan Menteri Kesehatan R. I
No. 329/MenKes/PER/XII/76, zat aditif adalah
suatu bahan yang ditambahkan dan untuk
mempertahankan mutu suatu produk sebelum
dilempar ke konsumen. Hal ini yang sering
menjadi permasalahan timbulnya bau busuk
apalagi proses pemisahan sel-sel dengan
ekstraselular enzim pada proses filtrasi, sehingga
umur waktu penyimpanan menjadi lebih pendek.
Penentuan jenis zat aditif yang tepat bagi enzim
didasarkan pada pendekatan empiris total, karena
belum ada hipotesis yang mendukung
mekanisme stabilisasi enzim oleh zat aditif.
Stabilisasi enzim diduga terjadi jika interaksi zat
aditif lebih kuat dengan molekul air daripada
dengan enzim (Monsan et. al. 1984), sehingga
terbentuk klaster yang mencegah unfolding.
Sebaliknya jika interaksi zat aditif lebih kuat
dengan enzim maka terbentuk ikatan molekul
aditif enzim yang dapat menyebabkan
terjadinya denaturasi enzim.
Bertitik tolak dari permasalahan di atas pada
penelitian ini dikaji zat aditif yang lebih efektif,
konsentrasi optimal dan efek penambahan zat
aditif terhadap aktivitas protease.
II. BAHAN DAN METODE
II.1 Bahan dan Alat
Mikroba yang digunakan adalah Bacillus
megaterium DSM 319 yang berasal dari
Laboratorium Bioindustri, Badan Pengkajian dan
Penerapan Teknologi.
Untuk pertumbuhan

bakteri ini digunakan media cair. Sedangkan

media pertumbuhan adalah molases 3 % dan urea
0,6 %, suplemen dan penunjang analisis adalah
Natrium hidroksida, Asam borat, Di-natrium
tetra botrat, Asam klorida, Kasein, L-Tirosin,
Kalsium klorida, Asam Tri Kloroasetat, Minyak
Ikan, Pepton, Folin Ciocalteau, Yeast ekstrak,
Natrium benzoat, Amonium Kuartener, Zeolit,
dll..
Alat yang digunakan dalam penelitian ini
adalah lengas penggoyang fermentor, sentrifuga,
Spektrofotometer.
II.2. Metode Penelitian
Rancangan percobaan yang digunakan
dalam penelitian ini adalah rancangan percobaan
faktorial 5 x 3 (Gaspersz, 1991), dengan dua kali
ulangan perlakuan, Sebagai berikut:
AO : Tanpa Zat Aditif
A1 : Zat Aditif Natrium Benzoat
A2: Zat Aditif Ammonium Kuartener
A3 : Zat Aditif Kalsium Klorida
A4 : Zat Aditif Zeolit
Faktor ke dua : Konsentrasi dalam satuan
persen di antara 0,05 % - 1%, dengan rancangan
percobaan sbb:
Yijk = U + i + j + ( )ij + ijk ,
i = 1, 2, 3, 4, 5
j = 1, 2, 3
k = 1, 2, 3, 4, 5, 6
dimana :
Yijk: Nilai respons pengamatan dari faktor zat
aditif pada taraf ke-i, faktor pemberian
konsentrasi pada taraf ke-j pada perlakuan
ke-k.
U : Nilai rata rata yang sesungguhnya
i : Pengaruh faktor zat aditif pada -i
j : Pengaruh faktor konsentrasi -j
ij : Pengaruh interaksi antara faktor zat aditif
pada taraf ke-i dan faktor pemberian
konsentrasi pada -j
ijk : Pengaruh galat percobaan
Hipotesis yang diujikan adalah dengan metoda
Anova
Ho
: Tidak ada pengaruh perlakuan
H1
: Adanya Pengaruh perlakuan
Kriteria uji yang digunakan adalah :
F hitung < F tabel, maka Ho diterima
F hitung > F tabel, maka H1 ditolak
Jika F nyata, maka dilanjutkan dengan uji
Duncan
II.3 Fermentasi Produksi Enzim Protease dan
analisis
Isolat bakteri B. megaterium DSM 319
inokulasi secara aseptik sebanyak satu ose ke

dalam medium LB cair 100 ml (terdiri dari

pepton, natrium klorida, yeast ekstrak). Inkubasi
medium secara bergoyang dengan water bath
suhu inkubasi 37oC dengan lama inkubasi 25
jam, biakan bakteri dari media LB cair 100 ml
dipindahkan ke media stater 800 ml (terdiri dari
molase 3 % dan urea 0,6). Diinkubasi lagi pada
fermentor dengan volume kerja 8 l pada suhu
yang sama selama 18 jam, agitasi 200 rpm.
Produk yang dipanen diseparasi antara sel
dengan supernatan. Sedangkan ekstra selular
berupa filtrat ditambahkan zat aditif natrium
benzoat, ammonium kuartener, kalsium klorida,
zeolit, serta secara berkala aktivitasnya diamati.
Uji aktivitas enzim dengan metode Bergmeyer
dan Grassl (1983).
III, HASIL DAN KESIMPULAN.

0,35
0,3

Tabel 1. Pengaruh penambahan natrium benzoat pada

aktifitas enzim protease B. megaterium DSM 319.
Sumber

Db

Jumh

F.

F tabel

Kuadr

hitung

14

0,3618

8,82

Zat Aditif

0,0615

0 ,41tn

Konsentrasi

0,0014

22,00**

Konsentrasi

0,2989

Galat

60

0,1028

Total

74

0,4646

Zat

0,05

0,01

1,86

2,40

**

Perlakuan

Aditif

Keterangan : tn
: Tidak Berbeda Nyata pada
taraf 0,05 ** : Sangat Berbeda Nyata Pada Taraf
0,01
Analisis sidik ragam menunjukkan zat aditif
natrium benzoat dengan konsentrasi berbeda
memberikan respons terbesar terhadap aktivitas
enzim protease dari B. megaterium DSM 319.
Perbedaan konsentrasi tidak memberikan hasil
yang nyata terhadap aktivitas enzim protease dari
B. megaterium DSM 319. Kedua perlakuan
antara zat aditif natrium benzoat dengan
konsentrasi tertentu memperlihatkan hasil sangat
nyata terhadap aktivitas enzim protease.

0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0

Waktu Pengamatan (Minggu)

Kontrol

Konsentrasi 0,1%

Konsentrasi 0,5 %

Konsentrasi 1 %

Gambar 1. Hubungan pengaruh Penambahan

Zat Aditif Natrium Benzoat dengan
berbagai Konsentrasi terhadap Aktivitas
Enzim
Sebagai kontrol tanpa penambahan zat aditif
natrium benzoat, aktivitas protease 0,264 U/ml.
Nampak efektivitas natrium benzoat setelah
penyimpanan sampai minggu keempat untuk
konsentrasi 0,1, 0,5 dan 1%, sebaliknya pada
minggu kelima akan terjadi penurunan drastis.
Berdasarkan
analisis
sidik
ragam
memperlihatkan bahwa perlakuan zat aditif

Rata-rata Aktivitas Enzim

Protease (U)

Aktivitas Enzim Protease

(U/ml.menit))

III.1. Pengaruh Zat Aditif Natrium Benzoat

Terhadap Aktivitas Enzim Protease
Pada gambar 1 tertera hubungan antara
penambahan zat aditif natrium benzoat minggu
pertama sampai minggu keempat. Setelah
penyimpanan pada suhu ruang 30 0C dan pH 8,
terlihat bahwa perlakuan dengan beberapa jenis
konsentrasi menghasilkan aktivitas enzim
protease yang berbeda.

natrium benzoat dan konsentrasi menunjukkan

pengaruh sangat nyata terhadap aktivitas enzim
protease dari B. megaterium DSM 319 (Tabel 1.).

Kontrol

0,25

Konsentrasi 0,05 %
0,2

Konsentrasi 0,5 %
Konsentrasi 1 %

0,15
0,1
0,05
0
Kontrol

Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi

0,05 %
0,5 %
1%

Perlakuan

III.2.

Pengaruh
kuarternair

penambahan

amonium

Gambar 2. Hubungan pengaruh Penambahan

Zat Aditif Natrium Benzoat dengan
berbagai
Konsentrasi
terhadap
Aktivitas Enzim

Kombinasi konsentrasi dengan zat aditif

amonium kuarterner menghasilkan rata rata
aktivitas enzim protease berbeda dengan kontrol
0,146 U/ml, pada konsentrasi 0,05 % aktivitas
enzim protease 0,239 U/ml, konsentrasi 0,5
persen aktivitas enzim protease 0,115 U dan
pada konsentrasi 1 % aktivitas enzim protease
0,041 U/ml, terjadinya perbedaan aktivitas enzim
protease disebabkan karena sifat dari zat aditif
amonium kuartener sebagai stabilisator dan
aktivator terhadap aktivitas enzim protease
sehingga
dengan
konsentrasi
berbeda
menghasilkan aktivitas enzim protease yang
berbeda. Pada konsentrasi 0,05 % terlihat bahwa
aktivitas
enzim
protease
lebih
tinggi
dibandingkan dengan konsentrasi 0,5 % dan 1 %.

Rata-rata Aktivitas Enzim (U/ml)

III.3. Pengaruh penambahan kalsium klorida

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

0
Kontrol

Konsentrasi
0,05 %

Konsentrasi
0,5 %

Konsentrasi 1
%

Perlakuan

Gambar 3. Aktivitas Enzim Protease dengan

Kombinasi Konsentrasi dari Zat
Aditif Kalsium Klorida.
Dari grafik 3, terlihat bahwa sebelum
ditambahkan zat aditif kalsium klorida enzim
aktivitas protease adalah 0,246 U/ml, tetapi
setelah ditambahkan zat aditif kalsium klorida
mengalami penurunan untuk setiap konsentrasi,
pada konsentrasi 0,05 % aktivitas enzim protease
0,142 U/ml, konsentrasi 0,5 % aktivitas enzim
protease 0,161 U/ml dan konsentrasi 1 %
aktivitas enzim protease 0,204 U/ml.
Peningkatan aktivitas enzim protease dengan
penambahan zat aditif kalsium klorida itu
disebabkan oleh ikatan yang terbentuk antara ion
kalsium dengan molekul enzim, sehingga
terbentuk molekul enzim termolisin mengandung

empat atom kalsium yang sangat penting untuk

meningkatkan aktivitas enzim protease.
Pada minggu ketiga sampai minggu keempat
aktivitas enzim protease dengan konsentrasi 0,05
% dan konsentrasi 0,5 % mengalami penurunan.
Konsentrasi 0,05 % aktivitas enzim protease
0,107 U/ml dan pada konsentrasi 0,5 % aktivitas
enzim protease 0,095 U/ml, terjadinya penurunan
disebabkan karena enzim protease sudah mulai
tidak aktif atau mungkin waktu penyimpanan
dapat mempengaruhi aktivitas enzim protease,
sehingga aktivitas dari B. megaterium DSM 319
menurun. Aktivitas enzim menjadi terhambat
oleh senyawa atau gugus senyawa yang
digunakan atau disebut efek inhibitor.
III. 4. Pengaruh Zat Zeolit Benzoat Terhadap
Aktivitas Enzim Protease
Terlihat bahwa pada penambahan zat aditif
zeolit aktivitas enzim protease dari minggu
pertama sampai dengan minggu kelima sudah di
bawah kontrol itu disebabkan karena pengaruh
sifat zeolit sebagai penukar kation yang terlalu
tinggi sehingga enzim menjadi rusak. Menurut
Harper (1979), bahwa ion logam melakukan
peranan yang penting dalam menjaga kestabilan
enzim dan berperan sebagai pengatur aktivitas
enzim. Penurunan aktivitas enzim itu mungkin
disebabkan karena kandungan zat aditif zeolit
yang terlalu komplek.
Hasil sidik ragam memperlihatkan bahwa
perlakuan zat aditif zeolit terhadap aktivitas
enzim protease pada Tabel 2 menunjukkan hasil
yang tidak nyata.
Tabel 2. Pengaruh penambahan zeolit pada aktifitas
enzim protease B. megaterium DSM 319.
Sumber

Db

Juml

F.

F tabel

Kuad

hitung

0,05

0,01

1,86

2,40

Perlakuan

14

0,0399

Zat Aditif

0,0097

1tn

Konsentrasi

0,0037

0,75tn

Konsentrasi

0,0265

1,37tn

Galat

60

0,1468

Total

74

0,1867

Zat Aditif

Keterangan : tn : Tidak Berbeda Nyata pada

Taraf 0,05

Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian di simpulkan
sebagai berikut :
1. Zat
aditif
natrium
benzoat
dapat
menstabilkan aktivitas enzim protease dan
zat
aditif
kalsium
klorida
dapat
meningkatkan aktivitas enzim protease.
2. Pada konsentrasi 0,5 persen zat aditif
natrium benzoat dapat mempertahankan
aktivitas enzim protease, serta pada
konsentrasi 0,5 persen zat aditif kalsium
klorida meningkatkan aktivitas protease.
3. Zat aditif natrium benzoat memiliki
karakteristik sebagai stabilisator serta
aktivator dan zat aditif kalsium klorida
memiliki karakteristik sebagai aktivator
dalam mempertahankan aktivitas enzim
protease.
DAFTAR PUSTAKA
1.

2.

3.

Baas,J.E. Enzyme. Their Application and

Biochemical Characterization. Surfactant
Science. Series. Library of Conggress
Cataloging in Publication Data; 1990.
Bailey,J.E dan D.F Ollis. Biochemical
Engineering Fundamental. 2nd Edition, Mc
Graw-Hill Book Company, New York;
1988.
Bergmeyer,H.V, dan M. Grassl. Methods of
Enzymatic Analysis. Vol II. Verleg chemi.
Weinhein.; 1983.

4.

Darwis, A.A dan

Sukara, E. Isolasi,
Purifikasi, dan Karakterisasi Enzim.
Depdikbib Dirjen Dikti. IPB; 1988.
5.
Forgaty,W.M dan Kelly. Development in
Microbial Extracellular Enzyme. Di dalam:
A. Wiseman (ed). Topics in Enzyme and
Fermentation. Biotechnology. Vol III. John
Willey and Sons Ltd, New York; 1979.
7.
Monsan dan Combess. Stabilization of
Enzyme Activity. The Process of Biotech:
84 Europe . Online Publication Ltd. London;
1984.
8. Obrien, R.T dan L.L.Campbell. Purification
and Properties of A Proteolytic Enzyme
From
Bacillus
Stearothermophillus.
J.Archieves of Biochemistry and Biophysic;
1975.
9. Poedjadi, A. Dasar-Dasar Biokimia .
Universitas Indonesia; 1988.
10. Suhartono, M.T. Pengantar Biokimia. PAU
Bioteknologi dan Lembaga Sumber Daya
Informasi IPB, Bogor; 1988.
11. Sukarno, K. Takahashi, M. Hatano, D.
Sakurai. Proteinase from the Liver of Neon
Flying Squid: Purification and Properties.
Bull. Fac. Hokkaido University; 1995.