Anda di halaman 1dari 10

Deteksi Asam Nukleat

Agum Gumelar Soinandi 1206201914


ABSTRAK
Asam nukleat merupakan molekul raksasa yang memiliki fungsi khusus yaitu, menyimpan
informasi genetik dan menurunkannya kepada keturunanya. Asam nukleat dalam sel ada dua jenis
yaitu DNA (deoxyribonucleic acid) atau asam deoksiribonukleat dan RNA (ribonucleic acid ) atau
asam ribonukleat. Baik DNA maupun RNA berupa anion dan pada umumnya terikat oleh protein
dan bersifat basa. Dalam deteksi asam nukleat, dapat diklasifikasikan menjadi beberapa macam.
Pertama dapat ditinjau jenis analisisnya yaitu kuantitatif dan kualitatif. Analisis kuantitatif
merupakan analisis yang didasarkan pada perhitungan dan yang bersifat numeris seperti PCR,
microarray, SAGE methode, dan spektroskopi UV-VIS. Sedangkan analisis kualitatif merupakan
analisis yang menghasilkan beberapa susunan klasifikasi genetik dan karakteristik yang ada pada
sampel uji seperti pada metode hibridisasi in situ, elektroforesis gen agrarosa, blotting, RFLP, dan
squencing. Selain berdasarkan jenis analisisnya, pendeteksian asam nukleat juga dapat
diklasifikasikan berdasarkan subjek atau jenis sampel seperti pada metode blotting yang
dikategorikan berdasarkan subjek penelitian yaitu RNA, DNA, dan protein. Pendeteksian dari asam
nukleat banyak sekali dimanfaatkan dalam bidang kedokteran dan biokimia, umumnya analisis
gen-gen sel abnormal.
Kata kunci: PCR, Microarray, Sentrifugasi, SAGE methodes, Sprekstroskopi, Hibridisasi in situ,
Elektroforesis, Blotting, RFLP, dan Pewarnaan.
Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif pada asam nukleat merupakan analisis yang didasarkan pada perolehan
data yang bersifat statistik dan angka (lebih bersifat numeris). Analisis kuantitatif dari pengujian
asam nukleat meliputi PCR, microarray, SAGE, dan spektroskopi.
PCR (polymerase Chain Reaction)
PCR merupakan suatu amplifikasi DNA enzimatik yang sangat sensitive dan spesifik
terhadap suatu organisme tertentu berdasarkan target gen primer yang dimiliki dan juga
merupakan salah satu metode analisis yang bersifat kuantitatif dengan tujuan untuk
memperbanyak rantai DNA secara eksponensial. Dengan kata lain, analisis PCR berfungsi
sebagai kloning DNA.

Gambar Polymerase Chain Reaction


Prinsip dasar dari metode PCR adalah dengan memanfaatkan kode genetik dari sebuah
DNA sampel yang akan diuji untuk diamplikasi jumlahnya. Proses pengaplikasian dari kode
genetik tersebut dimulai dari proses denaturasi DNA. Denaturasi DNA ditujukan agar DNA
dapat terpisah menjadi 2 rantai yang terpisah agar dapat terhibidrisasi. Proses denaturasi DNA
dapat dilakukan dengan cara memanaskan DNA sampel hingga suhu mencapai 92 oC. Setelah
DNA terdenaturasi, suhu didinginkan hingga 55oC agar DNA tetap terpisah. DNA yang
terdenaturasi kemudian dihibridisasi dengan potongan DNA primer pada suhu 72 oC. Potongan
DNA primer berisikan 3 basa nukleotida utama dari fragmen DNA yang hendak di perbanyak

jumlahnya. Setelah terhibridisasi, potongan DNA primer akan melengkapi fragmen DNA. Pada
akhir siklus pertama akan diperoleh 2 potongan DNA panjang. Pada siklus kedua, proses yang
sama juga dilakukan, hanya saja terdapat hasil yang berbeda. Pada akhir siklus kedua, akan
diperoleh 4 potongan DNA yang panjang. Pada siklus ketiga, akan diperoleh 8 potongan DNA
dimana 6 potongan panjang, dan 2 potongan pendek. Potongan pendek merupakan hasil yang
diperoleh dari metode PCR tersebut. Pada siklus berikutnya, jumlah potongan pendek akan
dihasilkan dengan derajat eksponensial. Pada siklus ke-4 akan dihasilkan sebanyak 8. Pada
siklus ke-5 jumlahnya menjadi 22. Pada siklus ke-10 jumlahnya menjadi 1004. Nilai tersebut
dapat dirumuskan berdasarkan persamaan eksponensial berikut,

N n=N o+(1+ E)n


dengan, Nn merupakan jumlah potongan DNA pada n-siklus, N o merupakan jumlah potongan
DNA target pada awal siklus, n merupakan jumlah siklus, dan E merupakan nilai sensitifitas
(0<E<1).
Sehingga dengan sedikit sample DNA sudah dapat dilakukan analisa untuk mendeteksi
adanya suatu kelainan. SOLVS (Self Obtained Low vaginal Swabs) merupakan salah satu
metoda untuk pengambilan specimen yang dapat dilakukan oleh penderita sendiri dengan cara
memasuka lidi kapas ke dalam vagina dan lidi kapas tersebut diputar di sekeliling liang vagina
kemudian didiamkan sampai hitungan kesepuluh, dilakukan rotasi sekali lagi sebelum lidi kapas
tersebut dikeluarkan. Metoda SOLVS biasanya dikerjakan pada daerah terpencil yang
mempunyai keterbatasan baik tenaga medis ataupun peralatan untuk pemeriksaan.
Pemeriksaan PCR dengan pengambilan specimen menggunakan metode SOLVS lebih cepat
untuk mendiagnosis penyakit menular seksual serta mempunyai sensitivitas dan spesifitas yang
tinggi dibandingkan dengan pemeriksaan kultur atau sediaan langsung , meskipun specimen
yang diambil bukan dari endoservik ataupun forniks
Microarray
Microarray merupakan salah satu metode analisis yang bersifat kuantitatif dengan tujuan
untuk mengidentifikasi DNA dari sebuah sampel. Prinsip dasar analisis dari microarray adalah
dengan cara menghibridisasi DNA sampel pada chip DNA (dikenal sebagai microarray).
Micoarray merupakan chip yang berukuran kecil yang terbuat dari lempengan kaca yang berisi
ribuan bahkan puluhan ribu macam gen dalam bentuk fragmen DNA yang berasal dari
penggandaan cDNA. Fragmen DNA yang memuat gen tersebut dapat mengenali gen dalam
suatu sampel jaringan yang dianalisis. Pola ekspresi suatu gen dalam jaringan yang berbeda
pun juga dapat diamati dengan menggunakan teknik ini.

Gambar prinsip kerja microarray


Sebenarnya prinsip kerja dari microarray adalah mengukur jumlah hibridisasi mRNA pada
cDNA dalam chip tersebut. Pada umumnya analisis dengan menggunakan microarray
menggunakan dua sampel yang berbeda, misalnya sel kulit normal dengan sel kanker kulit.
Kedua sampel tersebut diisolasi mRNA-nya dan kemudian diletakkan dalam chip microarray.
Kemudian chip tersebut diberi penanda radioaktif untuk menghasilkan warna fluorosens setelah
dilakukan scanner yang terhubung dengan komputer. Kemudian komputer akan menganalisis
kedua sampel tersebut berdasarkan pola warna yang ada.
Untuk melakukan analisis probe dengan menggunakan teknik microarray terdiri dari beberapa
tahapan, antara lain:

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Mengumpulkan sel atau jaringan yang akan dianalisis


Isolasi mRNA dengan menggunakan primer poly-T
Membuat cDNA yang diberi fluoresens
Hibridisasi
Pembacaan dengan menggunakan laser
Analisis
Metode microarray banyak diaplikasikan pada bidang biomedical. Pemanfaatan metode ini
umumnya digunakan untuk menganalisis DNA dari sel-sel orang yang berpenyakit seperti sel
tumor, gen yang termutasi, aktifitas gen pada sebuah sel atau jaringan tertentu, bahkan dapat
menentukan ekspresi gen atau profil gen dari sampel yang berbeda-beda. Pada analisis
metode ini, proses analisisnya terbatas pada jenis probe yang terdapat dalam chip DNA yang
dimilikki. Apabila sampel uji tidak memilikki kode genetik yang sesuai dengan probe yang
terdapat pada chip DNA, pembacaan tidak dapat dilakukan sehingga pada chip DNA tidak akan
terlihat titik-titik yang berfluorensi.
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)
SAGE merupakan salah satu metode analisis yang bersifat kuantitatif untuk
mengekspresikan kode genetik dari mRNA secara digital. Dalam metode ini, ditujukan untuk
mengamati bagaimana gen dari sebuah sel atau jaringan diekspresikan dalam bentuk kodekode genetik. Kode-kode genetik yang tercatat kemudian akan disimpan dalam bentuk
database secara digital untuk dapat dianalisis
Prinsip dasar dari metode SAGE adalah sequencing dimana beberapa mRNA dari sampel uji
akan diubah menjadi sebuah rantai DNA. Dalam analisisnya, ekspresi dari gen akan diuji satu
dengan yang lainnya (misalkan ekspresi DNA dari sel yang normal dengan sel tumor). Metode
SAGE diawali dengan cara mengekstrak mRNA dari sampel. Kemudian, mRNA yang sudah
terekstraksi akan dipotong-potong menjadi potongan kecil secara acak menggunakan enzim
restriksi contohnya NIaIII. Potongan-potongan pendek tersebut dirangkai menjadi satu rantai
panjang yang mengandung basa nukleat yang sudah diberi tanda. Rantai panjang yang
dihasilkan kemudian diubah menjadi bentuk vektor agar dapat dibaca oleh komputer.
Melakukan sequencing dan memproses datanya dengan komputer. Data yang dihasilkan akan
berisikan rantai-rantai DNA yang mempunyai variasi yang beragam.
Dalam metode SAGE, analisisnya dapat dilakukan terhadap gen yang tidak diketahui
sebelumnya, tidak seperti dengan metode PCR maupun microarray dimana analisis harus
dilakukan dengan DNA yang diketahui sebelumnya. Gen-gen baru yang dianalisis kemudian
dapat diberi tanda sesuai dengan basa nukleotida. Akan tetapi, metode SAGE tidak dapat
mengukur level ekspresi gen secara aktual, ukuran rata-rata tag yang diproduksi selama
analisis SAGE adalah sepuluh basis dan ini dapat membuat memasangkan tag keada transkrip
spesifikdengan tepat menjadi sulit.
Spektroskopi UV-VIS
Metode spektroskopi ditujukan untuk menentukan konsentrasi sampel. Penentuan
konsentrasi sampel dapat dilakukan dengan cara melihat kemampuan sampel untuk tidak
meneruskan berkas cahaya. Ada berbagai macam metode spektroskopi dalam metode analisis.
Akan tetapi, prinsip dasar dari setiap spektroskopi sama dimana melihat interaksi antara sampel
ketika dilewatkan sebuah berkas cahaya.

Dalam menganalisis asam nukleat, spektroskopi yang umumnya digunakan adalah


spektroskopi raman. Spektroskopi raman dimanfaatkan untuk menganalisis DNA probe yang
hendak digunakan dalam proses hibridisasi.
Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis adalah interaksi yang terjadi antara energi yang
berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang berupa molekul. Besar
energi yang diserap tertentu dan menyebabkan elektron tereksitasi dari keadaan dasar ke
keadaan tereksitasi yang memiliki energi lebih tinggi. Serapan tidak terjadi seketika pada
daerah ultraviolet-visible untuk semua struktur elektronik, tetapi hanya pada sistem-sistem
terkonjugasi, struktur elektronik dengan adanya ikatan dan non bonding elektron .Prinsip
kerja spektrofotometer berdasarkan hukum Lambert Beer, yaitu bila cahaya monokromatik (Io)
melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian
dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It).
Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dari asam nukleat ditujukan untuk mengetahui susunan genetik. Dalam
analisis kualitatif, hal yang diuji meliputi bagaimana karakteristik yang dihasilkan dari sampel uji
(DNA maupun RNA). Analisis kualitatif asam nukleat meliputi elektroforesis, blotting, hibridisasi,
RFLP dan pewarnaan.
Elektroforesis Gen Agrarosa
Elektroforesis merupakan metode analisis yang bersifat kualitatif dimana pada metode ini
bertujuan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA. Prinsip dasar dari metode ini adalah
dengan mengamati perbedaan panjang rantai dan muatan listrik dari DNA. Elektroforesis ini
juga merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat
molekul) dan struktur fisik molekulnya. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam
medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar
ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat
diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen
molekul DNA standar yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di
bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel direndam di dalam larutan etidium
bromid.
Pemisahan dari fragmen-fragmen DNA dilakukan pada media gelatin yaitu gel agarosa.
Langkah pertama yang dilakukan pada elektroforesis adalah mempersiapkan gel agarosa. Gel
agarosa dapat dibuat dengan cara menimbang 0.5 gram agarosa ke dalam labu erlenmeyer
250 mL dan mencampurnya dengan 50 mL 0.5 x TBE. Memanaskan agarosa hingga meleleh
dan didinginkan hingga suhunya mencapai 50oC. Menambahkan 1L ethidium bromida dengan
tujuan agar DNA dapat terikat dan memberikan warna fluorensi pada DNA. Gel agarosa yang
sudah dihasilkan kemudian diletakkan dalam sebuah wadah berbentuk tangki. Pada gel
agarosa kemudian diletakkan benda yang menyerupai sisir dan didiamkan selama 30 menit.
Proses tersebut bertujuan agar rongga yang dihasilkan oleh sisir dapat dianalogikan sebagai
pori-pori pada gel agarosa.
Gel agarosa yang sudah dihasilkan kemudian siap untuk dijadikan sebagai media untuk
proses elektroforesis. Pada gel terdapat rongga kecil yang kemudian akan diisikan oleh sampel
DNA yang akan diuji. Sampel DNA akan bermigrasi dari elektroda negatif menuju positif
dikarenakan DNA memilikki muatan dasar negatif. Dalam proses migrasinya, laju perpindahan
dari DNA akan dipengaruhi oleh pori-pori yang terdapat pada gel agarosa. DNA dengan
panjang rantai yang lebih pendek akan bermigrasi lebih mudah pada media agarosa
dibandingkan dengan DNA dengan rantai yang lebih panjang. Berdasarkan informasi tersebut,
dapat dilihat bahwa DNA dapat diklasifikasikan dan dipisahkan berdasarkan ciri khas
panjangnya.
Cara pembuatan gel agarose yaitu:
Tentukan konsentrasi atau presentase agarose yang dibutuhkan dan hal ini tergantung dari
ukuran fragmen DNA yang dianalisis. Presentase gel agarose yang direkomendasikan,
adalah sebagai berikut:

0,5% agarose untuk fragmen DNA berukuran 1000-30.000pb


0,7% agarose untuk fragmen DNA berukuran 800-12.000pb
1,5% agarose untuk fragmen DNA berukuran 200-3.000pb
2,0% agarose untik fragmen DNA berukuran 50-20.000pb
Pilih tipe agarose yang digunakan. Kebanyakan tipe yang digunakan adalah standart
agarose. Misalnya telah ditentukan akan dibuat 2% gel agarose dalam volume 200 ml 1x
buffer TAE, maka jumlah agarose yang akan ditimbang yaitu: 2 gram/100ml x 200ml=4
gram.
Tempatkan 4 gram agarose ke dalam labu erlenmeyer dan isi dengan larutan 1X Buffer
TAE sampai volume 200ml, kemudian kocok sampai merata.
Panaskan dalam microwave sampai mendidih sampai larutan menjadi jernih.
Didinginkan agarose kira-kira sampai 600C dan tambahkan 5l ethidium bromide
(10mg/ml) dan campur hingga merata.
Setelah itu larutan dituang ke dalam tray dan pasang well-forming combs, tunggu kurang
lebih 30 menit atau sampai gel mengeras. Lepaskan well-forming combs secara perlahanlahan dan gel agarose siap digunakan untuk elektroforesis.

Blotting
Blotting merupakan metode untuk memindahkan asam nukleat dari gel menuju carrier
(membran). Metode blotting dilakukan setelah proses elektroforesis gel sudah dilewati. Blotting
ditujukan agar analisis DNA dapat dilakukan pada media lebih stabil yang menyerupai membran
seperti nylon atau nitroselulosa. Pada metode blotting diklasifikasikan lagi menjadi 3
berdasarkan jenis asam nukleat yaitu,
1. Southern Blotting (DNA)
2. Northern Blotting (RNA)
3. Western Blotting (protein)
Asam nukleat yang sudah terpisah berdasarkan panjangnya pada gel agarosa (metode
elektroforesis) ditransfer pada carrier dengan metode kapiler dengan memanfaatkan larutan
alkali (NaOH pada umumnya). Pada metode kapiler prinsip perpindahannya berdasarkan
proses difusi dimana terjadi proses pertukaran ion dari asam nukleat yang bermuatan negatif
menuju membran yang bermuatan positif. Dalam proses terjadinya, gel agarosa akan
diletakkan di atas sebuah spons yang terendam pada larutan alkali. Kemudian, carrier
(membran) akan diletakkan diatas gel agarosa dan diberi tekanan secukupnya. Larutan alkali
kemudian akan secara perlahan berpindah dari spons hingga menuju carrier. Carrier yang
memilikki muatan lebih positif kemudian akan mengikat asam nukleat yang bermuatan lebih
negatif. Larutan alkali juga dimanfaatkan untuk mendenaturasi DNA.
Hibridisasi in situ
Hibridisasi in situ merupakan salah satu metode analisis kualitatif yang paling umum
digunakan dalam pendeteksian asam nukleat (DNA maupun RNA). Berdasarkan definisi,
hibridisasi in situ merupakan proses penggabungan rantai asam nukleat yang berasal dari
sumber yang berbeda (hibridisasi) dan di laksanakan dalam wadah tertentu (in situ).
Prinsip dasar dari pelaksanaan metode ini adalah dengan memanfaatkan probe untuk
mendeteksi nukleotida yang terdapat dalam DNA dan RNA sebuah sampel. Probe merupakan
sebuah fragmen dari DNA dengan panjang yang bervariasi (umumnya 100-1000 jenis basa).
Pembuatan probe dapat dilakukan dengan cara PCR, dimana pada metode tersebut DNA dari
sampel direaksikan dengan sejumlah DNA polimerase. Probe-probe yang dihasilkan kemudian
diberi tanda dengan cara mereaksikan dengan zat radioaktif maupun difluorensi. Zat umum
yang digunakan untuk menandakan DNA adalah 32P yang merupakan isotop radioaktif dari
Phosphor dan Dioxygenin (non radioaktif).
Proses hibridisasi diinisiasi dengan proses imobilisasi DNA sampel. Hal ini ditujukan agar
penangan sampel dapat dilakukan dengan lebih mudah (posisi DNA menjadi tetap). Proses
imobilisasi tersebut dilakukan dengan tahapan elektroforesis yang kemudian dipindahkan

menuju kertas filter (nylon atau nitroselulosa contoh yang umum). DNA yang sudah
terimobilisasi kemudian akan di denaturasi. Denaturasi ditujukan agar DNA sampel yang akan
dianalisis dapat terhibridisasi dengan probe. Denaturasi dilakukan dengan cara memanaskan
DNA dengan NaOH. DNA tersebut kemudian akan ditransfer menuju sebuah membran baru.
Proses transfer DNA pada media baru tersebut dapat dilakukan dengan metode blotting.
Kemudian proses dihibridasi antara DNA sampel dan probe dapat dilakukan.
Dalam metode ini, probe hanya akan berinteraksi dengan DNA yang bersifat homolog.
Dengan kata lain, probe hanya akan berkomplemen dengan DNA yang mempunyai pasangan
nukleotida yang sesuai. Ketika terhibridisasi, DNA dari sampel kemudian akan ikut menjadi
berfluorensi seperti dengan probe. DNA yang terfluorensi tersebut kemudian yang akan menjadi
hasil analisis dari metode hibridisasi.
Hibridisasi juga dapat diklasifikasikan lagi berdasarkan metode pembuatan probe. Hal yang
menjadi dasar pengklasifikasiannya merupakan penandaan dari probe. Hibridisasi yang paling
umum digunakan adalah Fluoresence in situ Hybridization (FISH). Hal ini disebabkan karena
pelaksanaannya bersifat relatif lebih aman karena tidak menggunakan zat yang bersifat
radioaktif. Pada metode ini, ditujukan untuk mengamati nukleotida-nukleotida yang terdapat
dalam DNA sampel. Selain itu, ada juga hibridisasi tipe lain yaitu Genomic in situ Hybridization
(GISH). Pada metode ini, ditujukan untuk membandingkan 2 DNA yang berasal dari sumber
yang berbeda.
Metode RFLP (Restricition Fragment Length Polymorphism)
Analisis Restriction fragment length polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik
analisis teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat
sekuen DNA.
Deteksi RFLP dilakukan berdasar pada adanya kemungkinan untuk
membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan dengan enzim
restriksi terhadap DNA target/dari individu yang berbeda. Berbagai mutasi yang terjadi pada
suatu organisma mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan fragmenfragmen dengan panjang yang berbeda. Perbedaan panjang fragmen ini dapat dilihat setelah
dilakukan elektroforesis pada gel, hibridisasi dan visualisasi. Aplikasi teknik RFLP biasa
digunakan untuk mendeteksi diversitas genetic, hubungan kekerabatan, sejarah domestikasi,
asal dan evolusi suatu spesies, genetic drift dan seleksi, pemetaan keseluruhan genom, tagging
gen, mengisolasi gen-gen yang berguna dari spesies liar, mengkonstruksi perpustakaan DNA.
Langkah-langkah kerja untuk mendeteksi RFLP di laboratorium meliputi :
Isolasi DNA
Pemotongan dengan enzim restriksi (digesti restriksi) dan elektroforesis gel
Transfer DNA dengan Southern blotting
Hibridisasi DNA

Sequencing
Sequencing asam nukleat menentukan susunan basa nukleotida dalam potongan DNA atau
RNA. Sequencing telah diaplikasikan dalam diagnosa molekular, rekayasa genetika, forensik,
dan biologi sistem. DNA sequencing digunakan untuk menentukan urutan genom yang sangat

menguntungkan penelitian medis dan farmasi. Contohnya penyakit genetic seperti Alzheimer,
cystic fibrosis, dan lainnya dapat diidentifikasi gennya. Kanker juga dapat dideteksi dengan
mengamati gen tertentu menggunakan metode ini.
Analisis DNA sequencing dapat menggunakan metode Sanger, yaitu pemutusan rantai, atau
metode Maxam-Gilbert, yaitu pembelahan secara kimiawi. Prinsip dari metode sanger yaitu
menambahkan dideoksinukleotida (ddNTP) kedalam nukleotida standar (NTP) yang ditemukan
di dalam DNA. Dideoksinukleotida pada dasanya sama dengan nukleotida namun memiliki
gugus hidrogen pada rantai karbon yang ke-3, bukan gugus hidroksida (OH). Nukleotida yang
telah dimodifikasi jika diintegrasikan menjadi sebuah susunan akan mencegah penambahan
nukleotida lainnya. Ini terjadi karena ikatan fosfodiester tidak dapat terbentuk diantara
dideoksinukleotida dan nukleotida yang akan datang, maka rantai DNA akan terputus.
Sebelum DNA dapat melalui proses sequencing, maka ia harus didenaturasi menjadi rantai
tunggal menggunakan panas. Lalu, primer akan ditambahkan kepada salah satu rantai. Primer
ini dibuat sedemikian rupa agar ujungnya terletak pada susunan DNA yang diinginkan. Primer
atau salah satu nukleotida harus bersifat radioaktif atau fluoresen agar produk akhir dapat
dideteksi oleh gel. Ketika primer telah menempel pada DNA, campuran dibagi menjadi empat
tabung, yaitu G, A, T, dan C. Lalu pelarut ditambahkan kepada sampel, pelarut berupa keempat
dNTP, ddGTP atau ddATP atau ddTTP atau ddCTP, dan DNA polymerase. Lalu keempat tabung
melalui proses elektroforesis. Hasil dari elektroforesis akan menunjukkan panjang gelombang
berbeda yang akan menentukan identitas dan letak tiap nukleotida pada susunannya.
Pewarnaan
Tipe-tipe pewarnaan dalam analisis karakteristik pada asam nukleat

Pewarnaan Sederhana
Tujuan
Mempelajari kegunaan pewarnaan untuk mempertinggi kontras antara sel dan sekelilingnya
dan mengamati ciri ciri bakteri.

Prinsip
Pada pewarnaan sederhana,bakteri diwarnai oleh reagen tunggal.pewarna dasar dengan
kromogen muatan positif disarankan,selama asam nukleat bakteri dan komponen dinding sel
membawa muatan negatif yang menyerap dengan kuat dan mengikat kation kromogenPerlu
diperhatikan lamanya waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarna yang
digunakan.Untuk karbol fuchsin membutuhkan 15-30 detik,Kristal violet 2-60 detik,dan
Methilen Blue 1-2 menit
Bahan
Biakan pada agar nutrient miring umur 24 jam bakteri Escherichia coli,Bacillus cereus,dan
staphylococcus aureus.

Reagensia
Methylen Blue,Kristal violet,dan Karbol Fuchsin.

Pewarnaan Gram
Tujuan
Mempelajari prosedur pewarnaan Gram,memahami pentingnya setiap langkah dalam
prosedur tsb,dan secara umum memahami reaksi reaksi kimiawi yang terlibat di dalam
proses tersebut.

Prinsip
Bakteri dengan pewrna utama (Primary stain) yaitu dengan kristal violet atau Gentian violet
akan berwarna ungu,melalui fiksasi warna dengan lugol akan menguatkan pelekatan warna
utama,penambahan alcohol akan melunturkan atau memucatkan zat warna utama sehingga
pada sel Gram negatif sel menjadi tidak berwarna tetapi pada sel Gram positif tidak
mengalami pelunturan sehingga tetap berwarna ungu.pada pemberian pewarna tandingan

(counterstain) yang berbeda dengan pewarna utama yaitu safranin menyebabkan bakteri
gram negatif akan menyerap warna tsb menjadi merah.

Bahan
Kultur bakteri Escherichia coli,Staphylococcus aureus,dan Bacillus cereus(umur 24 jam)
pada agar nutrien miring

Reagensia
Kristal violet
Lugol
Alkohol 95 %
Safranin

Bahan
Biakan berumur 24-48 jam :
Mycobacterium Sp,S.aureus dalam TSB

Reagensia
Karbol fuchsin
Asam Alkohol
Methylen Blue

Pewarnaan Tahan asam


Tujuan
Mempelajari dasar dasar kimiawi pada reaksi tahan asam dan kinerja prosedur pewarnaan
tahan asam untuk membedakan bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.
Prinsip
Pemanasan akan membantu penyerapan zat warna utama (karbol fuchsin) melalui
pemberian larutan pemucat (asam alkohol) bakteri tahan asam tetap berwarna merah
sedangkan pada bakteri tidak tahan asam zat warna utama akan luntur sehingga pada
penambahan warna kedua (Methylen blue) bakteri akan menyerap zat warna tersebut (biru).

Pewarnaan Spora
Tujuan
Mengenal dasar dasar kimiawi pada pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk
membedakan spora bakteri dan bentuk vegetatif.

Prinsip
Pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga zat warna utama dapat
masuk masuk ke dalam spora sehingga berwarna hijau.melalui pendinginan warna utama
akan terperangkap di dalam spora,dengan pencucian zat warna utama yang ada pada sel
vegetatif akan terlepas sehingga pada saat pewarnaan kedua (safranin), sel vegetatif akan
berwarna merah.

Bahan
Biakan berumur 48-72 jam
Bacillus cereus dalam agat nutrien miring
Clostridium butyricum dalam Tioglikolat

Pewarnaan Granula
Tujuan
Mempelajari dasar dasr kimiawi dan kinerja prosedur pewarnaan granula.
Bahan
Corynebacterium diphtheriae dalam agar Loeffler

Reagensia
Toluidin blue
Malachite Green
Methylen blue
Kristal violet
Krisoidin
Alkohol 95 %

Summary
Dalam deteksi asam nukleat diklasifikasikan menjadi dua kategori, yaitu analisis kuantitatif dan
kualitatif. Analisis kuantitatif terbagi menjadi empat yang memiliki tujuan di antaranya
PCR dengan tujuan untuk memperbanyak rantai DNA secara eksponensial. Dengan kata
lain, analisis PCR berfungsi sebagai kloning DNA.
Microarray merupakan salah satu metode analisis yang bersifat kuantitatif dengan tujuan
untuk mengidentifikasi DNA dari sebuah sampel.
SAGE merupakan salah satu metode analisis yang bersifat kuantitatif untuk
mengekspresikan kode genetik dari mRNA secara digital. Dalam metode ini, ditujukan
untuk mengamati bagaimana gen dari sebuah sel atau jaringan diekspresikan dalam
bentuk kode-kode genetik.
Metode spektroskopi ditujukan untuk menentukan konsentrasi sampel.

Sedangkan untuk analisis kualitatif terbagi pula menjadi beberapa bagian antara lain
Elektroforesis merupakan metode analisis yang bersifat kualitatif dimana pada metode ini
bertujuan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA.
Blotting merupakan metode untuk memindahkan asam nukleat dari gel menuju carrier
(membran).
Hibridisasi in situ merupakan salah satu metode analisis kualitatif yang paling umum
digunakan dalam pendeteksian asam nukleat (DNA maupun RNA). Berdasarkan definisi,
hibridisasi in situ merupakan proses penggabungan rantai asam nukleat yang berasal dari
sumber yang berbeda (hibridisasi) dan di laksanakan dalam wadah tertentu (in situ).
Analisis Restriction fragment length polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik
analisis teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat
sekuen DNA.
Sequencing asam nukleat menentukan susunan basa nukleotida dalam potongan DNA
atau RNA.

Daftar Pustaka
Freeman, W.H. 2000. Nucleic Acid Detection. National Center for Biotechnology
Information, U.S: National Library of Medicine.
Epplen, J.E, and T. Lubjuhn. 1999. DNA profiling and DNA fingerprinting. Birhkauser Verlag,
Berlin.
Theophilus, B.D.M. 2008. Principles and Medical Applications of a Polymerase Chain
Reaction. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley,
R. Humana Press, NJ, USA.
McPherson, M.J., Moller, S.G. 2006. PCR. Second ed. Taylor & Francis Group. Madison
Avenue, NY, US.
Triwibowo Yuwono. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta. Erlangga
Campbell, Reece, Mitchel. 2002. Biologi Terjemahan edisi kelima jilid 1. Jakarta. Erlangga
Available from : URL : http://biology-community.blogspot.com/2012/08/microarray-biologi-diera-pascagenomik.html accessed February 18 2014

Available from : URL : http://id.swewe.com/word_show.htm/?68712_5&Biotin accessed


February 18 2014
Available from : URL : http://ariputuamijaya.wordpress.com/2011/12/15/rflp-restrictionfragment-length-polymorphism/ accessed February 18 2014