ISOLASI DNA GENOM

Langkah 1
Memecahkan sel yang ingin diisolasi
DNAnya
Pada sebagian sel, pekerjaan memecahkan
sel adalah mudah, contoh pada sel hewan
yang dikultur, yaitu dengan menambahkan
detergent seperti SDS.
SDS berfungsi merusak membran sel.

 Jenis sel yang lain memiliki dinding sel yang kuat

sehingga membutuhkan perlakuan yang lebih
serius.
Sel tumbuhan keras dan membutuhkan alat
penggerus untuk memecahkannya.
Penggerusan merupakan cara yang paling efektif
untuk merusak dinding selulosa sel tumbuhan.
Sel bakteri E.coli dapat dilisis dengan memberikan
perlakuan kombinasi enzimatis dan kimia.

 Enzim yang dipakai disebut Lysozyme, yang

didapat dari putih telur.
Lysozyme berfungsi memutuskan komponenkomponen polymeric pada dinding sel bakteri.
Senyawa kimia yang dipakai adalah EDTA
(ethilenediamine tetra acetate), yang membuang
ion magnesium
Akibat keduanya terjadi penurunan integritas
dinding sel
Pemberian detergent untuk merusak dinding sel
mengakibatkan pecahnya sel secara meledak.

Langkah 2
Melakukan pemurnian DNA dengan
menerapkan 2 metoda:
Metoda 1: Mendegradasi atau membuang
semua komponen-komponen sel yang masih
bercampur dengan DNA.
Metoda pertama ini bekerja dengan sangat
baik bila sel tidak mengandung banyak lipid
dan karbohidrat.

 Pertama, ekstrak disentrifugasi dengan

kecepatan rendah untuk membuang semua
debris seperti potongan-potongan dinding
sel, yang akan membentuk pellet pada
bagian dasar tube.
Kedua, supernatan dipindahkan ke tube
yang baru dan dicampur dengan fenol, yang
menyebabkan protein menggumpal
(presipitasi) pada daerah interface antara
antara fenol dan lapisan air.

 Ketiga, lapisan air yang mengandung asam

nukleat terlarut dipindahkan ke tube yang baru
dengan pipetting.
Keempat, untuk menghancurkan RNA menjadi
nukleotida atau oligonukleotida, ke dalam larutan
ditambahkan enzim ribonuclease
Kelima, dilakukan precipitasi DNA (utuh)
menggunakan ethanol absolut, lalu disentrifugasi
untuk mengendapkan.
Keenam, DNA yang muncul kemudian dilarutkan
kembali menggunakan ddH2O, atau TE buffer.

 Metoda 2: mengambil DNA dari ekstrak.

Langkah 1: menambahkan detergent CTAB
(cetyltrimethylammonium bromida), yang akan
membentuk kompleks tidak larut dengan asam
nukleat.
Langkah 2: mengambil presipitasi (kompleks)
dengan cara sentrifugasi
Langkah 3: melarutkan kembali kompleks
dalam larutan garam tinggi yang menyebabkan
pecahnya kompleks dan melepaskan asam
nukleat.

 Langkah 5: Menghancurkan RNA dengan

enzim ribonuklease
Langkah 6: Presipitasi DNA dengan ethanol
absolut

 Metoda 3: Membuat binding (ikatan) antara

DNA dan partikel silika dengan
menambahkan bahan kimia terdenaturasi
seperti guanidium thiocyanate.
Cara 1: Partikel silika dan guanidium
thiocyanate dapat ditambahkan langsung ke
ekstrak, lalu dilakukan centrifugasi untuk
mendapatkan DNA.
Cara 2: Silika dimasukkan ke dalam kolom
kromatografi, dimana ekstrak dan
guanidium thiocyanate dapat lewat.

 DNA akan terikat ke partikel silika di dalam

kolom.
DNA diambil dengan cara mencuci
guanidium thiocyanate dengan air, sehingga
DNA lepas dari silika dan mengalir keluar
dari kolom.

 APLIKASI DI LAB BIOTEK UNP

Menggunakan kit yang berasal dari
perusahaan Promega.

Bahan-bahan yang dibutuhkan:

Larutan pelisis sel: Tris-HCL, EDTA
Larutan pelisis inti sel: NaOH, SDS
Bahan untuk penggumpal protein: sodium
perklorat
Bahan untuk penghancur RNA: RNAse
Bahan untuk presipitasi DNA: alkohol absolut
Bahan untuk pencuci: alkohol 70%
Kertas tissue

Alat-alat yang dibutuhkan

Mikrosentrifus kecepatan tinggi (13.000
rpm)
Mikropipet: 10 l, 50 l, 100 l, 1000 l.
Pipet transfer
Mikrotube
Vorteks

Isolasi DNA leukosit

300 l darah+EDTA di+kan ke dalam 900 l larutan
pelisis sel, dibolak-balik sebentar, lalu diinkubasi 10 menit
pada RT sambil sekali-sekali dibolak balik selama
inkubasi.
Campuran kemudian disentrifus dengan kecepatan 13.000
rpm 1 menit.
Supernatan dibuang, pelet dilisis kembali dengan 600 l
larutan pelisis sel, divorteks sebentar, lalu disentrifus
kembali selama 1 menit, 13.000 rpm.
Supernatan dibuang, didapatkan pelet berwarna putih yang
sudah bebas dari eritrosit.
Ke dalam mikrotube ditambahkan 300 l larutan pelisis
leukosit dan nukleus, dipipet up and down sampai
homogen.

Selanjutnya ditambahkan 1,5 l RNAse, diinkubasi pada suhu 37C,

15 menit 1 jam.
Selanjutnya ditambahkan 100 l larutan penggumpal protein,
divorteks 30 detik sampai terbentuk butiran-butiran coklat.
Campuran disentrifus selama 3 menit, 13.000 rpm, sampai terbentuk
endapan coklat di dasar mikrotube.
Supernatan dipindahkan ke mikrotube baru yang telah diisi dengan
900 l alkohol absolut.
Tabung dibolak balik beberapa kali sampai terlihat benang-benang
DNA yang melayang-layang dalam alkohol.
Tabung disentrifus 1 menit, 13.000 rpm untuk mengendapkan DNA di
dasar tabung.
Alkohol absolut dibuang, DNA dicuci dengan 900 l alkohol 70%.
Tabung disentrifus 1 menit, 13.000 rpm, alkohol dibuang.
DNA dikering anginkan dengan posisi tabung terbalik.
Setelah DNA benar-benar kering, DNA dilarutkan dalam 100 l
buffer TE atau akuabides steril.

ISOLASI DNA PLASMID

Plasmid dan kromosom bakteri keduanya berupa DNA
supercoiled.
Melisis sel bakteri akan menyebabkan terjadinya
perusakan sejumlah tertentu nukleoid, sehingga loops dari
supercoil akan rusak.
Ekstrak sel selanjutnya mengandung DNA plasmid
supercoiled dan kromosom non-supercoiled.
Selanjutnya plasmid dapat diisolasi dengan suatu metoda
yang dapat memisahkan molekul DNA dengan konformasi
yang berbeda tersebut.

 Salah satu teknik yang dapat diterapkan

adalah dengan menambahkan NaOH sampai
pH ekstrak mencapai 12 12,5.
Pembuatan lingkungan basa ini akan
menyebakan DNA untai ganda nonsupercoiled menjadi untai tunggal.
DNA untai tunggal tersebut selanjutnya
menjadi kusut dan terjerat dalam cairan
yang berisi bahan-bahan lain.
Selanjutya dilakukan dilakukan sentrifugasi.

 DNA untai tunggal yang terperangkap akan

membentuk endapan bersama dengan
bahan-bahan lain di dasar tabung,
sedangakan DNA plasmid supercoiled
terlarut dalam supernatan.

Isolasi DNA plasmid bakteri

Masukkan 1,3 ml biakan bakteri (medium cair) ke dalam
mikrotube, sentrifus 1 menit, 13.000 rpm.
Buang supernatan, pelet dilisis dengan 300 l bufer 1,
pipet up & down sampai homogen, +kan 300 l bufer 2,
pipet up & down.
Inkubasi 5 mnt pada RT, lalu +kan 300 l bufer 3, pipet up
& down, sentrifus 20 menit, 13.000 rpm.
Pindahkan supernatan ke mikrotube baru dan sentrifus 5
menit, 13.000 rpm.
Pindahkan kembali supernatan ke mikrotube baru, +kan
1000 l isopropanol dingin, bolak balik tabung sampai
terlihat benang-benang DNA.

 Sentrifus selama 30 menit, 13.000 rpm untuk

mengendapkan DNA.
Buang supernatan, cuci pelet DNA dengan 700 l
alkohol 70%.
Sentrifus 5 menit, buang alkohol.
Cuci pelet 1 x lagi, sentrifus dengan waktu dan
kecepatan yang sama.
Buang alkohol, kering anginkan DNA dengan
posisi mikrotube terbalik.
Setelah DNA kering, larutkan DNA dalam 30 l
akuabides steril.

Bufer
Bufer 1 (pH 8): 50 mM Tris-HCl pH 8, 10
mM EDTA, 100 g/ml
RNAse A.
Bufer 2:
200 mM NaOH, 1% SDS
Bufer 3 (pH 4,8): 2,55 M Kalium acetat
pH 4,8

Isolasi DNA virus

Campurkan ke dalam mikrotube: 100 l serum darah, 350
l bufer TE, 30 l SDS dan 1,5 l proteinase K.
Vorteks sebentar, lalu panaskan pada suhu 65C selama 1
2 jam.
Tambahkan 200 l fenol & 200 l chloroform: IAA (24:1)
Aduk dengan vorteks selama 3 x 1 menit
Sentrifus selama 15 menit, 10.000 rpm, 20C.
Pindahkan bagian/larutan yang bening (aquous layer) ke
mikrotube baru.
Ulangi langkah 3 6 satu kali lagi.

 Aquous layer + 30 l sodium asetat (0,1 volume) + 1 ml

alkohol absolut, mikrotube dibolak balik secara perlahan
selama 30 kali.
Disimpan dalam freezer (-20C) selama semalam.
Sentrifus selama 30 menit, 12.000 rpm, 4C.
Supernatan dibuang
Cuci pelet dengan alkohol 70%.
Sentrifus selama 15 menit, 12.000 rpm, 4C.
Kering anginkan DNA dengan posisi mikrotube terbalik.
Larutkan DNA dalam 20 l akuabides steril.

Polymerase Chain Reaction

PCR
Metoda untuk memperbanyak fragmen
DNA dari gen tertentu secara in
vitro.
1 siklus terdiri dari 3 tahap:
denaturasi, annealing, dan elongasi.
Membutuhkan enzim DNA polymerase
khusus yang tahan terhadap
temperatur tinggi (Taq polymerase).

Campuran PCR

5 l bufer
3 l MgCl2
12 l dNTP
1 l primer forward (20 pmol)
1 l primer reverse (20 pmol)
0,25 l Taq polymerase

27,75 l ddH2O

l DNA cetakan

Siklus PCR
Amplifikasi biasanya dilakukan sebanyak 35 40 siklus.
Siklus pertama: Denaturasi pada suhu 94C selama 5
menit, annealing pada suhu 55C 62C selama 40 detik,
elongasi pada suhu 72C selama 1,5 menit.
Siklus 2-35: denaturasi 94C selama 60 detik, annealing
selama 40 detik suhu 52C-62C, elongasi pada suhu 72C
selama 1,5 menit.
Pada akhir siklus (pada siklus ke-35) tahap elongasi
diperpanjang selama 7 menit untuk memberikan
kesempatan pada mesin PCR melengkapi seluruh amplikon
yang belum selesai amplifikasinya.

PCR
(Polymerase
chain reaction)

Elektroforesis produk PCR

Amplikon diperiksa dengan memisahkan fragmen DNA
pada gel agarosa 1% - 2% menggunakan apparatus
elektroforesis.
Kedalam apparatus elektroforesis ditambahkan larutan
bufer TAE 1X, lalu dimasukkan gel agarosa.
Ke dalam tiap-tiap sumur gel, dimasukkan campuran yang
terdiri dari 5 l DNA amplikon dan 3 l loading buffer
(0,25% bromofenol blue, xylene xyanole, 40% sukrosa)
Dielektroforesis pada tegangan 90 V selama 30 45 menit.
Sebagai penanda ukuran DNA digunakan DNA marker
(contoh: DNA/HindIII, X174/HaeIII)

Hasil elektroforesis produk PCR

M

310 pb
231/271

10

231 pb