KIMIA ANALISIS DASAR

KROMATROGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

DISUSUN OLEH :
AGUNG NURSYAWALY( 061440421741 )
SILVA ANGGRAINI
( 061440421759 )

DOSEN PEMBIMBING :
Dr. Ir. RUSDIANASARI, M.Si.

POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA

2014 / 2015

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami haturkan kehadirat Allah SWT, yang telah memberikan
rahmat, taufik, dan hidayah-Nya kepada kita sehingga penyusunan Makalah
Kimia Analisis Dasar tentang Kromatrografi Cair Kinerja Tinggi ini dapat
diselesaikan. Makalah ini disusun berdasarkan sumber sumber yang telah
dikembangkan sesuai dengan perkembangan zaman, sehingga dapat dipakai oleh
peserta didik dan guru.
Makalah ini disajikan berdasarkan maksud dan tujuan penulis yaitu untuk
mengetahui tentang Kromatrografi Cair Kinerja Tinggi yang mengacu peserta
didik untuk lebih aktif dan kreatif sehingga bisa menguasai keterampilan
mengenai kromatografi cair kinerja tinggi.
Akhirnya kami berharap makalah ini bermanfaat bagi kita dalam proses
belajar dan mengajar.

Palembang, November 2014

Penulis

BAB I
PENDAHULUAN

A.

Latar Belakang
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk
bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel
diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam
yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi
adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmenpigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur
(CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan
daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu
yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk
memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama
diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.
Macam kromatografi yang dapat digunakan untuk memisahkan
campuran zat-zat kimia yang terkandung dalam tumbuhan antara lain
kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom, kromatografi kertas,
kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi.
HPLC adalah metode kromatografi yang menggunakan fase gerak
cair dan fase diam padat/bahan pendukung untuk melakukan pemisahan
suatu jenis molekul. Terdapat dua variasi utama yaitu, HPLC yang terdiri
dari eluen polar dan fase diam non-polar atau eluen non-polar dan fase
diam polar. Keduanya diklasifikasikan sebagai metodereversed-phase
dannormal-phase. Metode reversed-phase yang akan dipakai dalam
eksperimen ini menggunakan kolom octadecylsilane (ODS) dan partisi
absorptif (dapat menyerap) utnuk memisahkan komponen-komponen
dalam campuran.
Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk
pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi
kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau
Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan
atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern =
moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam
keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya

sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian

membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu.
Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat
KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.

B.

Rumusan Masalah
1

1. Apa karakteristik KCKT?

2.
3.
4.
5.
6.

C.

Apa saja jenis-jenis KCKT?

Apa saja instrument dari KCKT?
Bagaimana cara kerja KCKT?
Apa saja kelebihan dan kekurangan KCKT?
Bagaimana aplikasi KCKT dalam kehidupan sehari-hari?

Tujuan
Tujuan penyusunan makalah kromatografi cair kinerja tinggi yaitu
untuk

memisahkan

dan

menentukan

komposisi

suatu

campuran

komponen-komponen senyawa organik secara kualitatif dan kuantitatif

dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi.

BAB II
2

TINJAUAN PUSTAKA

I.

Karakteristik Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut
dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan
metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif dan kuantitatif. Yang paling membedakan HPLC dengan
kromatografi lainnya adalah pada KCKT digunakan tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu
retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah.
Prinsip dasar dari KCKT, dan semua metode kromatografi adalah
memisahkan

setiap

komponen

dalam

sample

untuk

selanjutnya

diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masingmasing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal
utama yang menjadi krusial point dalam metode KCKT. Yang pertama
adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses
identifikasi. Dua hal ini menjadi faktor yang sangat penting dalam
keberhasilan proses analisa.
Kromatografi merupakan pemisahan fisiko kimiawi. Pemisahan ini
dapat terjadi kalau interaksinya berulang. Kita dapat mengetahuinya
dengan kuantitas ulangan yang dinyatakan dengan teori plate (terjadi pada
setiap lempeng, banyaknya lempeng dinyatakan dengan N).

Dasar yang digunakan dalam pemisahan adalah :

1. Pemisahan secara fisiko - kimiawi yang melibatkan interaksi antar fase
gerak, fase diam, dan sampel.

2. Fase diam dan fase gerak yang digunakan.

Sedangkan Interaksi yang terjadi pada kromatografi, yaitu :
1. Adsorbsi, dengan melihat perbedaan stereochemistry
2. Partisi, dengan melihat kelarutan
3. Afinitas, dengan melihat BM
4. Ion Exchange, berdasrkan perbedaan muatan
II.

Jenis-Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

2.1. Kromatografi padat-cair
Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben
yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis
(TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati
atau dipak dengan partikel-partikel micro or macro particulate or pellicular
(berkulit tipis 37 -44 ).Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat
untuk mencapai partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20 .
Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam
pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat untuk
pemisahan isomer-isomer.
2.2 Kromatografi partisi
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut
yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa
diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari
kromatografi cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama
seperti pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau
nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah
kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk
kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC).

Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih

tahan lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan
secara kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini

disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography).

BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari
KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila
fase diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak
lebih polar dari pada fase diam.
2.3. Kromatografi penukar ion
Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara
fase gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesinmesin berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus
fungsinya telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan
jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan
resin telah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences
dan dikenal untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai
untuk keduanya kation dan anion.
2.4. Kromatografi adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawasenyawa yang bersifat agak polar. Partikel-partikel silika atau alumina
biasanya

digunakan

sebagai

adsorben.

Jenis

kromatografi

ini

menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan disebut juga
kromatografi fasa normal.

2.5. Kromatografi fasa terikat

Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling
penting dan paling banyak digunakan saat ini. Dalam hal penerapann 5
kromatografi fasa terikat dan kromatografi partisi memiliki persamaan.
Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari partikel silika yang
dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil sebaliknya, fasa diam pada

kromatografi partisi terdiri dari partikel yang dilapisi secara fisik dengan
zat cair non polar.
Keuntungan kromatografi fasa terikat, yaitu :
1) Merupakan fasa yang stabil
2) Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan
berlangsung bila kepolaran solut-solut bervariasi
3) Kolom mempunyai umur panjang
4) Memiliki keterulangan waktu retensi yang baik
5)

Lebih ekonomis

BAB III
INSTRUMENTASI
6

I.Instrumen KCKT

Komponen-komponen penting dari KCKT dapat dilihat pada

Gambar dibawah ini :

3.1. Pompa (Pump)

Fase gerak d

1.1. Pompa (Pump)

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui
kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan
(constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement).
Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating
dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang
berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa
atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line)
detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan
utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe
memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

1.2. Injektor (injector)

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent Flowing

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,
sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan
karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi
b. Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang
digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada
kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan
semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang
terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi
volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis
(dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil
dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi
kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka
sampel akan masuK ke dalam kolom.
1. 3. Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu
analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang
sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung
pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang
yang

digunakan

adalah

50

-100

cm.

Untuk

kemasan

poros

mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar
dan panjang kolom 25 -100 cm.
Kolom

umumnya

dibuat

dari

stainlesteel

dan

biasanya

dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan 8

temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan
kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT

yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid

Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution
Chromatography, EC)

1.4. Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen
sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya
(analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi,
gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi
respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap
aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat
diperoleh.
Detektor pada KCKT dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu :
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan
detektro spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang
hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor
UV-Vis, detektor Fluoresensi dan elektrokimia.
Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :
1) Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar
dari 10-8 hingga 10-15gram zat terlarut per pembacaan.
2) Stabil dan memiliki keterulangan yang baik
3) Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi
4) Waktu respon yang singkat
5) Kemudahan pada penggunaan
6) Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran
puncak.
Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel

2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yang sangat kecil
3. Stabil dalam pengoperasiannya
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8l atau
lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya bervolume 1 l atau lebih
kecil lagi
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier)
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :
1) Detektor Absorban (UV-Vis) Pada detektor absorban, aliran akan
mengalir

melalui

detektor

dari

kolom

kromatografi.

Untuk

meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume

yang sekecil mungkin. Ukuran volume dibatasi 1 10 l dengan
panjang sel 2 10 mm. Umumnya sel detektor mampu menahan
tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan
diperlukan sebelum aliran memasuki detektor.
2) Detektor Fluorescens Detektor fluorescens yang digunakan sama
halnya dengan detektor pada spektrofluoro-fotometer. Detektor paling
sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya dan
filter untuk mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu
Xenon digunakan pada instrumen yang lebih baik dengan gratting
sebagai monokromatornya.
3) Detektor Refraktif Indeks Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur
nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel. Sel akan mengukur
indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara 10
bersamaan untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif.
4) Detektor Elektrokimia Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada
pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan dideteksi terhadap waktu

dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh penggunaan

detektor adalah pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.
5) Detektor Spektra Massa Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom
dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada kecepatan alir 10 50
l

per

menit

atau

menggunakan

termospray.

Analat

akan

diionisasikan, dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan

menghasilkan spektrum massa.

1.5. Tendon pelarut

Tendon pelarut atau fase gerak mempunyai ciri yaitu bahan tendon
harus lembam terhadap berbagai fase gerak berair dan tak berair. Sehingga baja
anti karat jangan dipakai pada pelarut yang mengandung ion halida dan jika
harus bertekanan, hindari menggunakan gelas. Daya tampung tendon harus
lebih besar dari 500 ml yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan
alir yang umumnya 1 2 ml/menit.

1.6.

Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa

gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien

adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan
kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi
Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini
menunjukkan kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi

11

cair dengan analisis gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi

sebelum dan sesudah pompa.
Tabel 3. 1 : Mode Kompatibilitas dengan Gradien
Gradien Mode
Kromatografi Cair padat (LSC)
Kromatografi ekslusi
Kromatografi Penukar Ion (IEC)
Kromatografi Cair Cair (LLC)
Kromatografi Fasa Terikat (BPC)

Solven Gradien
Ya
Tidak
Ya
Tidak
Ya

1.8. Pengolahan Data (Data Handling)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam
bentuk kromatogram pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat
pada Gambar 3. 2 berikut ini

Gambar 3.2 : kromatogram dari senyawa 5 Nukleotida

Dari Gambar 3.2. waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui
/ dihitung. Ini bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif
suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan
tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat
digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.

12

1.9. Fasa gerak

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak
adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat
variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi
ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah

II.

Fase dalam Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya)
dibedakan menjadi:
a. Kromatografi fase normal
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana terdiri atas :
Fase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gel
Fase gerak : bersifat non polar
Contohnya adalah sebuah kolom sederhana diisi dengan partikel silika
yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat 13
lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non
polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat
melewati kolom.

b. Kromatografi fase terbalik

Kromatografi fase terbalik terdiri atas :

Fase diam yang sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan

dengan klorosilan, dan

Fase gerak yang bersifat polar
Contoh kasusnya yaitu silika yang dimodifikasi menjadi
non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada
permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau
18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air
dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara
pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui
kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantairantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan
molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekulmolekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya
untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung

membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya

van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut
karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya
senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol
misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan
waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti
bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.
Keuntungan kromatografi fase terbalik :

Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya

Senyawa ionic dapat dipisahkan

Air dapat digunakan sebagi pelarut

III

14

Prinsip Kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kerja KCKT pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit

berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam)

dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan

HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan
tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor
(waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan

hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester <
golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.
KCKT dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada
proses kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah
dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama
dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain
melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal
kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga
sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat
tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT
yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar
komponen yang dianalisis di dalam sampel. Yang berperan dalam proses
separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan
untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan
untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada
juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti
kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa
karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi
sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap
selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh
dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat

15

peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam

sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan
mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar
peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam
identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk
sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar
sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.
Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung
komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses
pelarutan saja.

Seleksi Tipe KCKT

Analisis (pengguna KCKT) sebelum mengoperasikan KCKT, harus
membuat keputusan tipe yang mana yan gharus dipilih yang dapat memberikan
informasi yang diinginkan.
Skema I : Seleksi tipe KCKT adalah suatu petunjuk umum untuk seleksi
tipe KCKT . Informasi ini akan memudahkan para analis untuk memutuskan
pemelihan tipe KCKT yang memberikan para analis untuk memutuskan
pemilihan tipe KCKT yang memberikan kemungkinan terbaik pada pemisahaan
yang diinginkan. Namun, sampel yang tidak dikenal (unknown) akan
menyulitkan pemilihannya tipe KCKT.
Informasi seperti kelarutan, gugus fungsi yang ada, besarnya Berat
Molekul dapat diperoleh dari pembuat informasi, pemberi sampel, atau data
spektroskopik seperti nucleic magnetic resonance Spectrosphotometer, infra red
spectrophotometer, ultra violet spectrumeter, dan mass

16

Spectrophotometer. Semua data-data ini dapat digunakan sebagai

petunjuk bagi analis memilih tipe HPLC yang tepat untuk digunakan.

3. Kelebihan dan Kekurangan KCKT

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas 17
(KG). Dalam banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk
memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi
diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi
dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak
menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti
KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih
besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer
pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah
sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan

kromatografi cair klasik, antara lain:
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis
yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang
tidak rumit (uncomplicated), waktu analisis kurang dari 5 menit bisa
dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua
rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang
mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama
dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi
secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT
memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan
dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9
gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan
Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12
gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks
Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.
Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom
kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali
(reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang
sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven
dan jenis solven yang digunakan.
Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang
tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya
diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe
eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat
tersebut.
Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan
dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada
komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel

18

tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector.

Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk
kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.
Dismping kelebihan diatas, KCKT juga memiliki kekurangan, yaitu :
Mahal
Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit
Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan

BAB IV
APLIKASI DALAM INDUSTRI
19

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi biasanya digunakan dalam :

A. Penggunaan KCKT dalam Farmasi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu
metoda pemisahan canggih dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan
sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya
adalah untuk analisis senyawa - senyawa yang tidak mudah menguap dan
tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi
Gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis, dengan KCKT mulai dari
senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk
analisis dan pemisahan obat /bahan obat campuran rasemis optis aktif

dikembangkan suatu

fase pemisahan kiral (chirale Trennphasen) yang

mampu menentukan rasemis dan isomer aktif.

Pada Farmakope Indonesia Edisi III Tahun 1979 KCKT belum
digunakan sebagai suatu metoda analisis baik kualitatif maupun kuantitatif.
Padahal di Farmakope negara-negara maju sudah lama digunakan, seperti
Farmakope Amerika Edisi 21 (United State of Pharmacopoeia XXI),
Farmakope Jerrnan Edisi 10 (Deutches Arzneibuch 10).
Daftar Obat obat yang Penetapan Kadarnya dengan KCKT
diantaranya adalah :
1.

Tablet Asetazolamida

2.

Asetilsistein

3.

Larutan Asetilsistein

4.

Tablet Asetosal

5.

Asam Aminokaproat

6.

Asam Aminosalisilat

7.

Asam Folat '

8.

Tablet Asam Folat

9.

Asam Mefenarnat

10. Kapsul Asam Mefenamat

11. Asiklovir
12. Tablet Allopurinol
13. Alprozolam
14. Tablet Alprozolam
15. Amikasin Sulfat
16. Injeksi Amikasin Sulfat
17. Aminofilin
18. Amoksihn .
19. Kapsul Armoksilin
20. Amoksilin untuk Suspensi Oral

20

B. Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk memisahkan

golongan-golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol,
alkaloid, lipid dan gula.

BAB V
PENUTUP
Karakteristik dari KCKT yang membedaknnya dengan kromatografi lainnya
yaitu pada KCKT digunakan pompa yang dapa diatur pada tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak. Jenis-jenis KCKT antara lain kromatografi padatan cair,
kromatografi partisi, kromatografi penukar ion (IEC), kromatografi eksklusi,
kromatografi pasangan ion (IPC).
Instrumentasi pada KCKT terdiri atas : pompa, injector, kolom, detector,
system penyuntik, tendon pelarut. Prinsip kerja KCKT adalah pemisahan analitanalit berdasarkan kepolarannya. Campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya)
akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya
terpisah.

21

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair

klasik, antara lain: Cepat, Resolusi, Sensitivitas detector, Kolom yang dapat
digunakan kembali, Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik, Mudah
rekoveri sampel.

DAFTAR PUSTAKA
22

https://www.academia.edu/7765761/Makalah_Kromatografi_Cair_Kinerja_Tinggi
http://rafizanisa.blogspot.com/2009/12/analisis-hplc-dan-aplikasinya.html
http://ekaandrians.blogspot.com/2013/04/hplc.html
http://blogger-ulin.blogspot.com/2014/01/aplikasi-kromatografi-hplc.html
http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3616/1/farmasi-effendy2.pdf