Penilaian perbandingan metode ekstraksi dan estimasi kuantitatif luteolin dalam

daun Vitex LegundioLinn. dengan HPLC

Tujuan: Untuk mengetahui teknik pelarut dan ekstraksi organik yang ideal untuk
isolasi luteolin dari daun vitex Legundi Linn. (V. negundo) dengan estimasi
kuantitatif luteolin melalui kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Metode: Daun V.
negundo diidentifikasi oleh seorang ahli botani, dibersihkan, dikeringkan di tempat
yang teduh dan dijadikan bubuk. Maserasi, refluks, Soxhlet dan teknik ekstraksi
ultrason assited exctraction techniques yang digunakan untuk ekstraksi luteolin
dari daun dengan menggunakan empat pelarut yang berbeda dari berbagai
polaritas seperti metanol, etanol, kloroform, dan diklorometana. Sebuah metode
HPLC digunakan untuk menentukan jumlah luteolin dalam setiap ekstrak sampel.
Hasil: kalibrasi plot luteolin standar menunjukkan hubungan linear pada rentang
konsentrasi 100-500 mg / mL dengan koefisien korelasi, r 2 dari 0,998. Ekstrak
dengan pelarut metanol ditemukan mengandung jumlah tertinggi luteolin dan hasil
yang paling efisien menggunakan metode refluks . Kesimpulan: Berdasarkan hasil
HPLC, dapat disimpulkan bahwa teknik refluks menggunakan metanol lebih baik
dari teknik ekstraksi lain dan harus lebih disukai untuk ekstraksi dan isolasi luteolin
dari V. negundo ekstrak daun di laboratorium penelitian atau industri.

Genus Vitex terdiri dari sekitar 250 spesies termasuk pohon dan semak-semak, yang terutama
ditemukan di daerah tropis dan subtropis. Sekitar 14 spesies yang ditemukan di India yang telah
dilaporkan untuk memiliki obat tertentu dan properti komersial [1,2]. Tanaman Legundi L. (V.
negundo) yang dikenal sebagai nirgundi dan milik family Verbenaceae. Dalam bahasa
Sansekerta, kata "nirgundi" kata digunakan untuk pabrik atau zat-zat yang dapat melindungi
tubuh dari penyakit (s). Kegunaan dari
tanaman tersebut telah disebutkan di De Materia Medica serta dalam teks dasar Ayurveda
(pengobatan tradisional India), Charaka Samhita. Tanaman ini terutama dikenal untuk utilitas
dalam gangguan reproduksi wanita seperti sindrom pramenstruasi [3], menopause [4],
hiperprolaktinemia [3,5], dll
Kebanyakan kegiatan terapi yang dimiliki oleh V. negundo karena phytoconstituents ada di
dalamnya, yaitu friedelin, karoten, casticin, artemisin, luteolin, vitexin, nigunduside,
vitexicarpin, linalool, asam strearic, asam, negundin, agnuside, asam vanilat behenic, asam,
vitexoside, stigmasterol, sabinene, GardenDi, asam ursolat, asam p-betunilic hydrobenzoic ,
spathulenol, p-cymene, globulol, virdifloral, hentriacontane, lagundinin, vitedoamine,
nishandaside dan sebagainya [6]. V. negundo merupakan tanaman obat secara ekstensif dipelajari
dan diketahui memiliki berbagai pilihan aktivitas farmakologi seperti analgesik dan antiinflamasi [7-9], hepatoprotektif [10], antidiabetes [11], antikonvulsan [7,12], antioksidan [13,14],
dll Dalam sistem tradisional India obat (Ayurveda), V. negundo digunakan sebagai antihelmintik
dan untuk mengobati gangguan kulit. The Pharmacopoeia Cina mengatur buah V. negundo

dalam pengobatan memerah, menyakitkan, dan bengkak mata; sakit kepala dan rematik sendi
[15]. Ada daftar besar penyakit yang V. negundo digunakan sebagai obat di Ayurvedic, Unani,
Sidhha dan sistem Cina obat [16,17]. Luteolin merupakan konstituen penting dari V. negundo L.
Kimia itu adalah 3 ', 4', 5,7-tetrahydroxyflavone (Gambar 1) dan memiliki berbagai kegiatan
terapi. Meskipun banyak flavonoid yang hadir dalam tanaman obat ini tapi karena kandungan
kecil luteolin dalam obat dan kemanjuran terapi tinggi, analisis kuantitatif menjadi sangat
diperlukan. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan pelarut yang paling sesuai untuk
mengoptimalkan metode ekstraksi untuk isolasi luteolin dari daun V. negundo L. dengan
penentuan kuantitatif luteolin dalam ekstrak pelarut yang berbeda melalui kromatografi cair
kinerja tinggi (HPLC).

Gambar 1. Struktur kimia luteolin.

2. Bahan dan metode
2.1. Bahan tanaman
Daun V. negundo Linn. diperoleh dari Herbal Taman Jamia Hamdard University, New Delhi dan
disahkan oleh ahli taksonomi, Departemen Botani, Fakultas Sains, Jamia Hamdard, New Delhi.
Sebuah surat bukti disimpan di herbarium Departemen Farmakognosi dan Fitokimia, Fakultas
Farmasi, Jamia Hamdard, India untuk referensi di masa mendatang.
2.2. Kimia
Standard luteolin dibeli di Sigma, USA). HPLC kelas metanol dan air yang diperoleh dari SD
Fine Chemicals, India. Semua reagen lain yang digunakan adalah dari kelas analitis dan dibeli
dari SD Fine Chemicals, India.
2.3. Ekstraksi luteolin
Daun V. negundo yang benar dibersihkan untuk menghilangkan benda asing yang menempel dan
kemudian dicuci dengan air. Daun dikering udarakan di tempat yang teduh dan dibuat dengan
bantuan penggiling negeri (Usha Lexus 2753, India). Permukaan daun kemudian digunakan

untuk ekstraksi luteolin. Ekstraksi dilakukan dengan empat metode yaitu. maserasi, refluks,
soxhelation dan USG dibantu ekstraksi (UEA) dengan empat pelarut yang berbeda yang
memiliki kepolaran yang berbeda juga termasuk etanol, metanol, kloroform, dan diklorometana.
Hasil ekstraksi (massa ekstrak / massa bubuk kering) digunakan sebagai indikator untuk
membandingkan efektivitas teknik ekstraksi. Semua ekstrak yang telah siap menjadi sasaran uji
kimia Shinoda untuk memastikan adanya flavonoid di dalamnya. Skema ekstraksi oleh keempat
metode yang dijelaskan secara singkat di bawah ini.
2.3.1. Ekstraksi secara maserasi
Secara total, 5 g bubuk daun direndam dalam 50 mL pelarut [pelarut: rasio obat = 10: 1 (mL / g)]
selama 72 jam pada suhu kamar. Campuran tersebut kemudian disaring dan filtrat diuapkan
untuk mendapatkan residu menggunakan rotary evaporator (Hahn SHIN, HS-2005V-N) pada 40
C. Residu ditimbang dan dilakukan pengenceran yang tepat dibuat estimasi kuantitatif luteolin
dalam ekstrak.
2.3.2. Ekstraksi dengan refluks
ekstraksi pelarut panas dilakukan dengan menggunakan alat refluks selama 2 jam pada suhu 50
C dengan menggunakan pelarut: rasio obat 10: 1 (mL / g). Pengolahan lebih lanjut dari ekstrak
dilakukan dengan cara yang sama seperti yang dibahas di atas dalam kasus maserasi.
2.3.3. Ekstraksi soxhlets
ekstraksi pelarut panas soxhlet dilakukan dengan menggunakan alat soxhlet selama 2 jam pada
suhu 50 C dengan menggunakan pelarut: rasio obat 10: 1 (mL / g). Pengolahan lebih lanjut dari
ekstrak dilakukan dengan cara yang sama seperti yang dijelaskan sebelumnya.
2.3.4. Ekstraksi melalui (UEA) USG dibantu ekstraksi dilakukan selama 20 menit dengan
pelarut: rasio obat 10: 1 (mL / g) pada 50 C dalam sonikator (TOSCHON, SW7). Pengolahan
lebih lanjut dari ekstrak dilakukan dengan cara yang sama dibahas di atas.
2.4.1. Persiapan larutan standar
Larutan stok standar luteolin disiapkan di HPLC kelas metanol pada konsentrasi 1 mg / mL.
Deret standar dibuat pada konsentrasi 100, 125, 175, 200 dan 500 mg / mL dengan metanol dan
disimpan pada suhu -20 C. Sebelum digunakan lebih lanjut, larutan dibawa ke suhu kamar.
Setiap larutan standar disaring melalui 0,2 m filter membran (Axiva) dan kemudian diukur pada
analisis HPLC untuk mendapatkan ketinggian puncak pada waktu retensi statis untuk setiap I
larutan standar. Kurva kalibaras kemudian dibuat hubungan konsentrasi (mg / mL) dengan
daerah puncak. Persamaan linear dari kurva standar digunakan untuk menentukan konsentrasi
luteolin pada sampel uji.
2.4.2. Larutan sampel persiapan
Sepuluh miligram berbagai ekstrak pelarut dari daun V. negundo L. dibuat dengan metode
ekstraksi yang berbeda, ditimbang dan dilarutkan dalam HPLC kelas metanol untuk

mendapatkan konsentrasi akhir 1 mg / mL. Solusi kemudian disaring melalui 0,2 um membran
filter dan 20 uL larutan yang dan diukur analisis HPLC. Konsentrasi akhir luteolin dalam ekstrak
dihitung dengan menggunakan persamaan linear pada kurva kalibrasi.
2.4.3. Kromatografi analisis kondisi
Analisis HPLC dari ekstrak daun v dilakukan dengan HPLC Kuarter System (Shimadzu,
Jepang) yang terdiri dari LC- 10AT VP pompa (Shimadzu, Jepang), panjang gelombang tunggal
yang diprogram secara UV-detektor, dan sistem pengendali. Sampel disuntikkan dengan
menggunakan injektor Rheodyne dilengkapi dengan 20 uL lingkaran tetap. Standar dan solusi
sampel disaring melalui 0,2 m jarum suntik penyaring (Axixa) sebelum injeksi. Pemisahan
dicapai dengan menggunakan kolom dengan 25 mm x 4,6 mm, ukuran partikel 5 m, LiChrospher
C18 kolom fase terbalik (Merck, Jerman). Penentuan luteolin dilakukan dengan fase gerak yang
terdiri dari metanol dan 1% larutan asam asetat (99: 1 v / v) dengan laju alir 1,0 mL / menit.
Pemisahan optimal di HPLC dicapai pada 30 C dan absorbansi diukur pada 289 nm.
3. Hasil
3.1. Pengujian fitokimia
Beberapa survei fitokimia telah dilakukan, termasuk pendekatan sampling secara acak
yang melibatkan beberapa macam tanaman yang dikumpulkan dari seluruh penjuru dunia. Zat
kimia utama yang menarik dalam survei fitokimia ini ialah alkaloid dan steroid sapogenins
(saponin). Selain itu, terdapat juga senyawa fitokimia alami lain yang beragam seperti flavonoid,
tanin, sterol tak jenuh, triterpenoid, minyak esensial, dll juga telah dilaporkan.
(http://ijpr.sbmu.ac.ir/index.php/daru/article/view/article_16_0.html). Analisis fitokimia yang
dilakukan pada ekstrak tumbuhan digunakan untuk mengungkapkan adanya konstituen sebagai
aktifitas fisiologis obat (RNS Yadav dan Munin Agarwala 2011). [1]
Pengujian fitokima yang dilakukan menggunakan dengan pelarut metanol, etanol,
kloroform dan diklorometana pada semua ekstrak. Hasil Shinoda test menunjukkan adanya
flavonoid. Tes Shinoda merupakan uji kualitatif penentuan flavonoid yang dilakukan
dengan cara sebanyak 0,5 gram dari setiap contoh dilarutkan dalam pelarut hangat
dan kemudian disaring. Magnesium selanjutnya ditambahkan ke filtrat diikuti oleh
beberapa tetes HCl pekat. Terbentuknya warna jingga, merah muda, atau merahkeunguan menunjukkan adanya flavonoid. (http://www.bioline.org.br/request?
tc09039)

3.2. Ekstraksi luteolin oleh berbagai teknik ekstraksi

Luteolin diekstraksi dari daun oleh empat teknik ekstraksi yang berbeda seperti maserasi,
soxhlet, refluks dan UEA menggunakan etanol, metanol, kloroform dan diklorometana sebagai
pelarut. Maserasi juga disebut ekstraksi dingin. Proses maserasi digunakan untuk
memisahkan konstituen yang berbeda dan bahan-bahan tanaman dalam bentuk
ekstrak kasar (Irshad dkk 2012). [2]

Selama percobaan, waktu ekstraksi, suhu ekstraksi dan obat: rasio pelarut dijaga konstan untuk
semua pelarut. Hasil persen hasil dalam pelarut yang berbeda dengan berbagai teknik ekstraksi

telah disajikan pada Tabel 1. Seperti yang diharapkan, berbagai jumlah hasil ekstrak diperoleh
dengan pelarut yang berbeda dan teknik ekstraksi. Hasil maksimum dan minimum untuk ekstrak
etanol (14,5% dan 5,2%) diperoleh dengan soxhlet dan teknik UEA masing-masing. Namun hasil
ekstrak metanol ditemukan menjadi yang tertinggi dengan teknik UEA. Jumlah yang cukup
kloroform dan diklorometana ekstrak diperoleh dengan refluks dan teknik soxhlet masingmasing. Secara umum, hasil dari ekstrak dengan refluks dan metode ekstraksi soxhlet (sistem
pelarut panas) ditemukan lebih besar dari maserasi dan teknik UEA. Tabel 1

3.3 Estimasi kuantitatif dari luteolin dengan metode HPLC

Larutan standar luteolin dan ekstrak sampel diukur dengan teknik HPLC menggunakan metanol
dan 1% larutan asam asetat (99: 1 v / v) sebagai fase gerak, dalam mode isokratik (1 mL / menit).
Kurva kalibrasi dari luteolin dibuat dengan lima pengenceran larutan standar pada konsentrasi
berkisar 100-500 mg / mL. Persamaan regresi linier diperoleh dalam bentuk y = mx + c, di mana
y dan x sesuai dengan area di bawah kurva dan konsentrasi masing-masing (Gambar 2).
Persamaan regresi dan koefisien korelasi adalah sebagai berikut: y = 18.78x-1072; r2 = 0,998.
Jumlah relatif luteolin dalam ekstrak disiapkan kemudian dihitung dari persamaan ini dan
hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1. Waktu retensi luteolin di HPLC kromatogram diamati pada
3,883 menit (Gambar 3 dan 4).
Gambar 2. Kalibrasi plot luteolin.

Gambar 3. HPLC kromatogram luteolin standar (175 ug / mL).

Gambar 4. HPLC kromatogram ekstrak daun V. negundo metanol dengan teknik refluks.

Kuantifikasi ekstrak dengan metode yang berbeda dari V. negundo L. melalui HPLC
mengungkapkan bahwa metanol adalah pelarut terbaik untuk ekstraksi luteolin. Kandungan
luteolin dalam ekstrak metanol diperoleh melalui maserasi, soxhelation, refluks dan teknik UEA
ditemukan 1.020%, 1.075%, 6,340% dan 0,640% masing-masing (Tabel 1). Dalam etanol,
kandungan luteolin diekstraksi dengan berbagai teknik tidak setinggi dalam kasus metanol.
Seperti terlihat, dalam pelarut lain seperti, kloroform dan diklorometana mengandung kisaran yg
sgt sedikit yaitu di kisaran 0,5% -0.6%. Selain itu, ia juga mengamati bahwa di antara berbagai
teknik yang digunakan untuk ekstraksi dan isolasi luteolin, teknik refluks ditemukan untuk
menjadi yang paling efisien. Jelas, hasil penelitian kami menunjukkan bahwa metanol adalah
pelarut yang paling sesuai untuk ekstraksi luteolin.
4. Diskusi
Selama beberapa dekade banyak teknik ekstraksi baru terakhir telah dikembangkan untuk isolasi
komponen bioaktif dari tanaman obat. Namun beberapa penelitian telah melaporkan bahwa
aktivitas biologis ekstrak dipengaruhi oleh teknik ekstraksi yang digunakan. Oleh karena itu,
penting untuk memilih pelarut yang cocok serta metode ekstraksi, yang paling dipengaruhi oleh
adanya zat campur, berdasarkan sifat kimia dan fisika contoh matriks [19].
Luteolin merupakan konstituen penting dari V. negundo dan diketahui memiliki banyak manfaat
terapeutik. Oleh karena itu, kandungan dari tanaman ini perlu diketahui. Luteolin hadir dalam
jumlah yang sangat kecil sekali dalam daun tanaman ini. Oleh karena itu teknik HPLC
digunakan untuk kuantifikasi nya. HPLC adalah teknik kromatografi yang umum digunakan
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif flavonoid dalam bahan tanaman karena dianggap metode
yang paling nyaman [20]. Juga pemisahan jauh lebih cepat daripada metode klasik dan

memberikan resolusi tinggi dan sensitivitas. Hasil panen ekstrak bervariasi dengan pelarut dan /
atau teknik ekstraksi tetapi maksimum% yield diperoleh dengan teknik refluks. Perbedaan hasil
% daun ekstrak bisa disebabkan perbedaan dalam ketersediaan komponen diekstrak dengan
teknik pelarut / ekstraksi yang berbeda [21]. Hal ini dapat disimpulkan bahwa metode ekstraksi
pelarut panas adalah pilihan yang lebih baik untuk persiapan ekstrak dari leveas V. negundo
dibandingkan dengan metode non thermal seperti maserasi atau UEA. Juga, hasil analisis HPLC
menunjukkan bahwa kandungan luteolin merupakan yang tertinggi dalam ekstrak metanol
terlepas dari teknik ekstraksi yang digunakan, yang berarti bahwa metanol adalah pilihan yang
menguntungkan pelarut untuk ekstraksi luteolin. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa
prosedur ekstraksi dan pelarut tidak mempengaruhi isolasi dan hasil luteolin dari V. negundo
ekstrak daun. Hasil penelitian ini juga akan membantu para peneliti dalam memilih pelarut yang
sesuai dan teknik ekstraksi yang tepat untuk isolasi luteolin dari daun ekstrak V. negundo, yaitu
metanol dan refluks metode. Juga luteolin dapat digunakan sebagai biomarker dalam
standardisasi dan pengawasan mutu daun ekstrak obat ini dalam industri herbal sebagai metode
HPLC ini sederhana, selektif, sensitif dan cepat. Konflik pernyataan bunga Kami menyatakan
bahwa kita tidak memiliki konflik kepentingan.
Ucapan Terima Kasih Penulis berterima kasih kepada Kepala, Departemen
Farmakognosi dan Fitokimia, Jamia Hamdard, New Delhi, India untuk menyediakan
fasilitas penelitian yang diperlukan untuk melaksanakan proyek ini. Para penulis
juga ingin mengucapkan terima kasih AICTE, Pemerintah. India untuk mendukung
proyek penelitian hibah lebar No. AICTE / M.PHARM / SS / 2011-2013).