Srimita Kristiani Br Sembiring/ B94134353

TATA LAKSANA PENGUJIAN DALAM LABORATORIUM VIROLOGI

Pengumpulan Dan Pengolahan Spesimen
1. Material otopsi atau biopsi
Dalam pengambilan materi untuk isolasi virus, sebaiknya materi tidak
dicampurkan dengan bahan yang mengandung formalin atau zat virusidal. Jenis
material yang diambil tergantung dari sifat alamiah penyakit. Paru-paru dan
trakhea merupakan material untuk penyakit-penyakit respirasi (IB, ILT), otak dan
sumsum tulang belakang untuk penyakit sistem saraf (Rabies), jantung dan cairan
kantung jantung untuk radang jantung, bursa fabrisius (Marek) sedangkan hati,
limpa, ginjal untuk agen-agen yang pantropis. Spesimen disimpan dalam tabung
atau wadah steril pada suhu -70 C.
Metode :
Lelehkan spesimen yang beku terlebih dahulu pada panci enamel. Jika
spesimen dalam bentuk segar, bagi menjadi dua bagian.
Satu bagian spesimen ditripsinasi, kemudian ditanamkan pada biakan
jaringan.
sedangkan satu bagian yang kedua diambil sebanyak 2 g dari bagian
tengah spesimen dan diletakkan di cawan petri dan potong kecil-kecil.
Potongan kemudian digerus didalam mortar.
Siapkan HBSS sebanyak 10 ml, tambahkan HBSS hingga sediaan menjadi
bentuk pasta, kemudian tambahkan sisa HBSS.
Suspensi jaringan disimpan dalam refrigerator selama 1 jam, sedangkan
sisa spesimen disimpan beku.
Sentrifuse suspensi jaringan 4000 rpm selama setengah jam.
Supernatan dihisap dengan pipet pasteur, dan dibagikan ke dalam tabungtabung wasserman (13x100 ml) steril dengan volume yang sama.
Satu tabung segera diinokulasikan ke biakan jaringan, sedangkan tabung
lainnya dibekukan untuk isolasi ulangan.
2. Darah
Darah diambil secara aseptis, untuk pemeriksaan serologis diambil sebanyak
10-20 cc (5-10 cc serum). Untuk serodiagnosis diperlukan sepasang serum,
dimana satu serum diambil waktu sakit, dan yang lainnya diambil 2-3 minggu
setelah sakit.
a. Darah dengan sitrat
Darah dengan sitrat dibutuhkan untuk mengambil leukosit, adapun tata
cara metodenya adalah :
Tambahkan 0.1 ml Phitohemaglutinin M ke dalam 5 ml darah,
biarkan 1 jam pada suhu 4 C dalam tabung sentrifuse.

Sentrifuse sebanyak 3 kali, 250 rpm pada suhu 4 C selama 10

menit.
Ambil 1/3 bagian supernatan dari tiap proses sentrifuse, kemudian
buang. Pastikan tidak ada bagian leukosit yang terikut.
Sediaan kemudian di sentrifuse dengan 2500 rpm selama 10 menit,
pisahkan buffy coat, pastikan sedikit mungkin eritrosit yang terikut.
Sentrifuse buffy coat 2500 rpm selama 10 menit, buang
supernatannya, apabila ada eritrosit yang terikut, hilangkan dengan
penambahan aquades sebanyak 6 ml dan dihomogenkan, kemudian
ditambah 0.2 ml 3.5% NaCl steril dan di sentrifuse dengan 2500 rpm
selama 10 menit, buang supernatannya.
b. Darah beku
Jika spesimen darah dalam bentuk segar (baru) sentrifuse 2000 rpm
selama 5 menit dan pisahkan segera serumnya. Jika tidak dalam
benentuk segar, serum diambil tanpa proses sentrifuse.
Serum dipisahkan kemudian disimpan pada 4 C hingga siap
digunakan.
3. Swab
Swab dilakukan pada organ kloaka, oropharyng. Sampel swab ditempatkan
pada larutan yang bersifat isotonik dan memiliki ph 7.0-7.4 yang sudah
ditambah dengan antibiotik, misalnya media brain-heart infusion (BHI) atau
tris-buffer-tryptose broth (TBTB). Antibiotik yang ditambahkan bisa berupa
preparat penicillin (10000 iu/ml), streptomycin (10000 g/ml), gentamycin
(50 g/ml), dan mycoastatin (1000 u/ml). Suspensi sediaan sebaiknya
diproses secepat mungkin setelah proses inkubasi selama 1-2 jam pada suhu
ruang. Cairan supernantan dari hasi swab diperoleh melalui proses sentrifuse
pada 1000 g selama 10 menit, dengan suhu tidak melebihi 25 C. Supernatan
diambil sebanyak 0.2 ml.
Pembuatan Bahan-Bahan Pendukung Uji Laboratorium
1

Pembuatan NaCl Fisiologis (NaCl 0.85%)

Bahan : Garam NaCl, aquades
Alat : Timbangan, gelas ukur, labu Erlenmeyer
Metode
:
Timbanglah 8.5 gram NaCl untuk membuat 1 liter Na Cl fisiologis
Masukkan ke dalam labu Erlenmeyer kapasitas 1 liter, kemudian
tambahkan aquades hingga mencapai batas tera 1 liter dan aduk
hingga garam terlarut
Larutan NaCl fisiologis tersebut disterilkan sebelum digunakan.

Pembuatan Na-sitrat (Na-sitrat 3.8%)

Bahan : Garam Na-sitrat, aquades
Alat : Timbangan, gelas ukur, labu Erlenmeyer
Metode :

Timbang 0.95 gram Na-sitrat untuk membuat 25 ml Na-Sitrat

Masukkan ke dalam labu Erlenmeyer kapasitas 25 ml, kemudian
tambahkan aquades hingga mencapai batas tera 25 ml dan aduk
hingga garam terlarut
Larutan Na-sitrat tersebut disterilkan sebelum digunakan.

Pembuatan suspensi RBC

Bahan : darah dari ayam yang sehat, Na-sitrat 3.8% steril, NaCl fisiologis
steril
Alat : Tabung standart 10 ml, pipet Pasteur, sentrifuse, syringe 3 ml,
timbangan, gelas ukur, labu Erlenmeyer, kapas beralkohol, kapas
Metode
:
Darah ayam diambil melalui vena brachialis menggunakan syringe 3
ml, dengan teknik aseptis
Siapkan tabung yang telah berisi larutan Na-sitrat, dengan
perbandingan Na-sitrat dan darah adalah 1:4
Masukkan darah yang telah diambil ke dalam tabung berisi Na-sitrat
dan homogenkan
Sentrifuse darah utuh dengan kecepatan 1000-1500 G selama 10 menit
Buang supernatannya, kemudian endapan sel darah merah
dicuci/dibilas dengan menambahkan NaCl fisiologis dengan volume
sebanyak supernatant yang dibuang atau dua kali volume sel darah
merah.
Homogenkan campuran tersebut dan sentrifuse kembali selama 10
menit, ulangi langkah pencucian sebanyak dua kali
Setelah pencucian ketiga, buang supernatannya sehingga didapatkan
suspensisel darah merah 100%
Tentukan volume sel darah merah dan encerkan suspense darah
tersebut secara bertingkat menjadi 50%, 5%, dan 1%.
Pembiakan Virus

Virus dapat ditumbukan secara in ovo (pada telur berembrio), in vivo

(menggunakan hewan-hewan sebagai model), dan in vitro (menggunakan biakan
jaringan atau biakan sel di dalam cawan petri). Telur Embrio Tertunas (TET)
merupakan salah satu media yang digunakan untuk membiakkan virus. TET
terdiri atas membran khorion alantois, membran alantois, ruang amnion, sel
kantung kuning telur. Sebelum proses inokulasi sebaiknya telur diperiksa dengan
teropong telur. TET yang tidak baik adalah TET yang tidak memiliki kantung
udara, terlur yang infertil, atau memiliki embrio yang lemah, dan sebaiknya tidak
digunakan. Inokulasi dapat dilakukan pada ruang amnion (Influenza virus, mumps
virus), ruang alantois (Influenza virus, Mumps virus, Newcastle disease virus,
Avian adenovirus, Infectious bronchitis virus), membran khorioalantois (Herpes
simplex virus, Poxvirus), kantung kuning telur (Herpes simplex virus).
Metode :
1. Inokulasi ke ruang alantois

Adakan peneropongan (candling) pada telur yang akan digunakan.

Tentukan batas kantung udara dan letak kepala embrio dengan memberi 2
tanda menggunakan pensil, satu pada bagian atas kepala embrio dan
sebuah diatas kantung udara.
Bersihkan telur dengan menggunakan alkohol 70% pada area yang akan
diinokulasi.
Buat lubang pada kulit telur dengan bor telur, tetapi jangan sampai
merusak shell membrane.
Inokulasikan 0.1-0.2 suspensi virus. Inokulasi dilakukan ke dalam ruang
alantois, orientasinya adalah melewati batas kantung udara.
Tutup kembali lubang tempat penyuntikan dengan kolodion atau bahan
penutup lainnya.
Inkubasi TET pada suhu 37-38 C selama 4-7 hari. Telur yang mati 24
jam setelah inokulasi disingkirkan karena kematian bukan karena virus,
tetapi adanya kontaminasi organisme lain. Telur yang mati pada 2-4 hari
setelah inokulasi disimpan dalam refrigerator, sedangkan telur yang tidak
mati, diamati sampah hari ke-4 post inokulasi. Pada hari keempat telur
yang masih hidup dimasukkan ke dalam refrigerator selama 24 jam untuk
mematikan embrio. Pada hari ke 5, semua telur dapat diamati dan
diisolasi/dipanen.

2. Inokulasi ke membran khorio alantois

Adakan peneropongan (candling) pada telur yang akan digunakan.
Tentukan batas kantung udara dan letak kepala embrio. Beri tanda
menggunakan pensil pada bagian yang berlawanan dengan posisi embrio.
Letakkan telur pada posisi memanjang.
Bersihkan telur dengan menggunakan alkohol 70% pada area yang akan
diinokulasi.
Buat lubang di daerah kantong udara dan tempat yang sudah diberi tanda
dengan bor telur. Hisap udara pada bagian kantong udara menggunakan
bulp karet secara perlahan-lahan sampai kantong udara berpindah ke
bagian atas permukaan telur yang telah ditandai.
Inokulasikan 0.1-0.2 ml suspensi virus kedalam ruang antara membran
chorioalantois dengan shell membrane. Telur tersebut digoyang-goyangkan
perlahan-lahan agar inokulum menyebar rata dipermukaan CAM.
Tutup kembali lubang tempat penyuntikan dengan kolodion atau bahan
penutup lainnya.
Eramkan dalam inkubator 38-39 C dengan posisi kantong udara buatan
ada di atas. Eramkan sampai hari keempat dan kemudian disimpan dalam
refrigerator sampai saat akan diamati.
Pengamatan Hasil Inokulasi Virus
Uji Aglutinasi cepat
Uji aglutinasi cepat bertujuan untuk mengetahui apakah virus yang
dibiakkan paa telur tumbuh atau tidak.

Cara kerja uji aglutinasi cepat terdiri atas:

Siapkan gelas objek yang bersih dan bebas lemak, kemudian teteskan
suspense sel darah merah 5% dan tambahkan setetes cairan allantois yang
dipanen.
Aduk campuran tersebut dengan tusuk gigi, biarkan sesaat dan amati
terjadinya aglutinasi.
Sebagai kontrol negatif teteskan suspensi sel darah merah dan tambahkan
setetes NaCl fisiologis, aduk dan amati bentuk larutan yang tidak
teraglutinasi.
Uji Hemagglutinasi (HA)
Hemagglutinasi merupakan penggumpalan dari sel darah merah. Terdapat
beberapa virus yang dapat menyebabkan terjadinya penggumpalan seperti Foot
and mouth disease virus (penyakit mulut dan kuku), Pox virus (virus cacar). HA
biasanya disebabkan oleh virion sendiri, hemaggllutinin yang dihasilkan selama
pembiakan virus. HA dapat terjadi jika terdapat interaksi antara virion dan
permukaan sel darah merah, dimana bagian yang melekat dari virion disebut
sebagai bagian spesifik dan reseptor dari membran eritrosit. Kegunaan dari uji Ha
adalah kita dapat mendiagnosa virus yang dapat menggumpalkan sel darah merah
seperti golongan virus influenza, virus myxo, mumps,virus rhabdo (rabies) serta
menentukan nilai titrasi (penentuan titer) dari suatu bahan dengan ukuran
hemagglutination unit (HAU) dalam satuan volume (ml)
a. Uji HA makrotitrasi
Tempatkan tabung reaksi sebanyak 10 buah pada rak tabung dan masukkan
0.8 ml NaCl fisiologis pada tabung pertama dan 0.5 ml pada tabung
selanjutnya menggunakan pipet 5 ml.
Dengan pipet 1 ml ambil 0.2 suspensi virus dan masukkan ke dalam
tabung pertama.
Dengan pipet 1 ml yang baru, lakukan pencampuran suspensi dengan NaCl
dengan cara menghisap dan meniup cairan tersebut, sampai 5 kali
Ambil 0.5 dari tabung pertama dan pindahkan ke tabung kedua dan
lakukan pencampuran seperti sebelumnya, kemudian pindahkan 0.5 ml ke
tabung ketida, begitu seterusnya hingga tabung ke 9. Dari tabung ke 9, 0.5
ml campuran diambil dan dibuang. Tabung ke 10 sebagai control negatif
yang hanya berisi NaCl fisiologis saja.
Tambahkan 0.5 ml NaCl fisiologis, dan 0.5 ml suspensi RBC 1 % ke
seluruh tabung.
Kocok tabung dengan menggoyang-goyangkan rak kemudian
diinkubasikan pada suhu ruang selama 15-30 menit, dan diamati hasilnya.
b. Uji HA mikrotitrasi
Sumur-sumur (1-12) mikroplate U bottom diisi dengan NaCl fisiologis
masing-masing dengan 25 l dengan mikropipet 200 l.
Ambil 25 l suspensi virus dan masukkan ke dalam sumur pertama,
lakukan perncampuran suspensi virus dengan NaCl pada sumur pertama

dengan cara mengmbil dan mengeluarkan cairan tersebut dengan

mikropipet, lakukan cara ini paling tidak 5 kali.
Ambil 25 l dari sumur pertama kemudian pindahkan ke sumur kedua dan
lakukan pencampuran tersebut diatas, selanjutnya pindahkan 25 l ke
lubang ke-3, dan seterusnya hingga sumur ke-12. Dari sumur 12, ambil 25
l dan dibuang.
Tambahkan 25 l NaCl fisiologis ke dalam seluruh sumur.
Tambahkan 25 l suspensi sel darah merah 1% ke dalam seluruh sumur.
Kocok mikroplate dengan menggoyang-goyangkan kemudian diinkubasi
pada suhu ruang selama 30 menit, kemudian dibaca.

Pembacaan hasil uji :

Pembacaan hasil uji dilakukan apabila eritrosit pada tabung kontrol telah
mengendap ke dasar tabung. Hasil dikatakan positif jika terjadi aglutinasi yang
komplit dari sel darah merah dimana akan terlihat bentuk seperti pasir di bagian
pinggir dasar tabung. Batas nilai titrasi adalah pengenceran tertinggi dari antigen
yang masih menghasilkan aglutinasi yang komplit.
Perhitungan :
Titer virus yang diperiksa =

a
b

a : nilai HAU dari tabung terakhir yang mengalami aglutinasi komplit

b : volume transfer sediaan 0.5 ml
Uji Hemagglutinasi Inhibitor (HI)
Pada uji HI aglutinasi sel darah merah tidak terjadi. Kegunaan dari uji HI
adalah untuk identifikasi ataupun pengenalan jenis antigen tertentu dengan cara
mereaksikan dengan jenis antibodi (terhadap antigen) yang telah diketahui serta
mengetahui jenis antibodi (terhadap jenis antigen tertentu) dan banyaknya titer
dari antibodi yang terdapat di dalam satu contoh serum dengan cara mereaksikan
antara serum dengan antigen yang telah diketahui jenis dan jumlahnya. Hi titer
merupakan perkalian antara nilai end point (batas akhir serum yang masih dapat
menghambat secara sempurna penggumpalan sel darah merah) dikali HA unit.
a. Uji HI makrotitrasi
Tempatkan tabung reaksi sebanyak 6 buah pad rak tabung dan masukkan
0.8 ml NaCl fisiologis pada tabung pertama dan 0.5 ml pada tabung 2-5,
dan 1 ml pada tabung 6.
Dengan pipet 1 ml ambil 0.2 cairan allantois yang akan diuji dan
masukkan ke dalam tabung pertama.
Dengan pipet 1 ml yang baru, lakukan pencampuran suspense dengan
NaCl dengan cara menghisap dan meniup cairan tersebut, sampai 5 kali
Ambil 0.5 dari tabung pertama dan pindahkan ke tabung kedua dan
lakukan pencampuran seperti sebelumnya, kemudian pindahkan 0.5 ml ke
tabung ketiga, begitu seterusnya hingga tabung ke 6. Dari tabung ke 6, 0.5
ml campuran diambil dan dibuang.

Tambahkan 0.5 ml serum standar pada tabung ke 1-5, dan tabung ke 6

sebagai kontrol negatif.
Kocok tabung dengan menggoyang-goyangkan rak kemudian
diinkubasikan pada suhu ruang selama 40 menit, dan diamati hasilnya.
b. Uji HI mikrotitrasi
Sumur 1-12 dari mikroplate V bottom baris 1 dan 2 diisi dengan NaCl
fisiologis masung-masing sebanyak 25L dnegan mikropipet kapasitas 200
L. bari kedua digunakan sebagai control positif (serum ND)
Sebanyak 25 L virus ND yang akan diuji diambil dan dimasukkan ke
dalam sumur pertama. Pencampuran dilakukan dengan cara pengambilan
dan pengeluaran cairan dengan mikropipet sebanyak minimal lima kali.
Usahakan agar tidak terbentuk buih selam pencampuran.
Sebanyak 25 L campuran dari sumur pertama diambil dan dipindahkan
ke sumur kedua dan dilakukan pencampuran seperti yang dijelaskan
sebelumnya. Pencampuran dan pemindahan dilakukan hingga sumur ke
12. Dari sumur ke 12, sebanyak 25 L dibuang.
Sebanyak 25 L serum ND ditambahkan ke tiap sumur pada baris ke 1 dan
2 dan diinkubasikan selama 15 menit pada suhu ruang.
Sebanyak 25 L suspense sel darah merah 1% ditambahkan ke dalam
seluruh sumur.
Mikroplate dikocok dengan mengoyang-goyangkan mikroplate, kemudian
diinkubasikan pada suhu ruang selama kurang lebih 30 menit, lalu dibaca
hasilnya
Uji Agar Gel Precipation Test

Agar gel dibuat dengan melarutkan 0.4 g agarose dan 1.2 g PEG 6.000,
0.1% Na azide dalam 25 ml PBS pH 7.4 dan 25 ml aquadest pH 7.4.
Larutan ini dipanaskan dalam penangas air sampai larut dan warna larutan
menjadi bening.
Kemudian larutan dipipet sebanyak 3.75 ml, dicetak pada gelas objek dan
ditunggu sampai mengeras. Kemudian dibuat sumur-sumur dengan
puncher.
Pada sumur tengah dimasukkan 25 l antigen dan 25 l IgY purifikasi
pada sekelilingnya. Gelas objek diletakkan di atas kertas saring basah agar
terjaga kelembabannya.
Reaksi dibaca setelah 18 sampai 48 jam, reaksi positif ditunjukkan dengan
adanya garis presipitasi diantara sumur antigen dan serum.