Neuroprotective effects of donepezil against

cholinergic depletion
Debora Cutuli12*, Paola De Bartolo12, Paola Caporali12, Anna Maria Tartaglione12, Diego
Oddi13, Francesca Romana DAmato13, Annalisa Nobili1, Marcello DAmelio14 and Laura
Petrosini12

Abstrak
Pengantar
Suntikan intraparenchymal dari immunotoksin 192 - IgG - saporin ke medial
septum dan nukleus basalis magnocellularis menyebabkan penipisan selektif
neuron otak depan basal kolinergik . Dengan demikian , itu merupakan model
yang valid untuk meniru komponen kunci dari defisit kognitif yang terkait dengan
penuaan dan demensia . Di sini kita diberikan Donepezil , inhibitor
acetylcholinesterase ampuh dikembangkan untuk mengobati penyakit Alzheimer ,
15 hari sebelum injeksi 192 - IgG - saporin , dan dengan demikian kami menguji
efek donepezil pada neurodegeneration dan defisit kognitif .
Metode
Caspase - 3 kegiatan dan pertunjukan kognitif tikus lesi pra - diobati dengan
donepezil atau saline dianalisis dan dibandingkan dengan hasil yang diperoleh
dalam pra - diperlakukan tikus sham - lesi .
Hasil
Deplesi kolinergik meningkat hippocampal dan neokorteks caspase - 3 aktivitas
dan gangguan memori kerja , diskriminasi spasial , preferensi sosial baru , dan
vokalisasi ultrasonik , tanpa mempengaruhi tingkat kecemasan dan penyejuk
ketakutan . Pada hewan lesi , donepezil pra-perawatan berkurang hippocampal
dan neokorteks caspase - 3 aktivitas dan meningkatkan memori kerja dan
pertunjukan diskriminasi spasial dan vokalisasi ultrasonik sebagian diselamatkan ,
tanpa mencegah perubahan kebaruan sosial .
Kesimpulan
1

Data terakhir menunjukkan bahwa pra - pengobatan donepezil diberikannya efek

menguntungkan pada defisit perilaku yang disebabkan oleh penurunan
kolinergik

pelemahan

hippocampal

bersamaan

dan

neurodegeneration

neokorteks .
Pengantar
Bukti eksperimental dan klinis mendukung hipotesis bahwa hilangnya otak depan
basal ( BF ) neuron kolinergik dan pengurangan konsekuen asetilkolin ( ACh )
sintesis dan pelepasan secara signifikan berkontribusi pada penurunan kognitif
gangguan penuaan , seperti gangguan ringan kognitif ( MCI ) dan Alzheimer
penyakit ( AD ) [ 1-3 ] . Inhibitor acetylcholinesterase ( AChE -Is ) seperti
donepezil mencegah hidrolisis ACh sisa di otak dan mewakili yang terbaik alat
farmakologis untuk melemahkan gangguan kognitif pada pasien dengan ringan
sampai sedang AD [ 4,5] . AChE -Is saat ini digunakan sebagai pengobatan
simtomatik untuk meningkatkan atau setidaknya mempertahankan fungsi
kolinergik sentral [ 6,7 ] .

Sampai saat ini , selain penelitian obat baru mampu memerangi penurunan
kognitif yang berkaitan dengan usia , perlindungan neuron dari kerusakan dan
kematian terkait dengan gangguan neurodegenerative merupakan tantangan utama
dalam ilmu saraf . Konsep pelindung saraf telah menemukan peningkatan
penerimaan di bidang neurologi selama dekade terakhir dan termasuk intervensi
yang bertujuan untuk memperlambat atau bahkan menghentikan kemajuan
degenerasi saraf . Menariknya , ada bukti yang berkembang bahwa, di luar
memungkinkan pengentasan gejala kognitif , AChE -Is menghasilkan pelindung
saraf yang efektif [ 7 ] . Bahkan , telah menunjukkan bahwa AChE -Is melindungi
terhadap excitotoxicity glutamat , kerusakan saraf dan amiloid ( AA )
neurotoksisitas . Selain itu, banyak penelitian telah menunjukkan bahwa mereka
mendorong peningkatan regulasi dari reseptor nicotinic ACh ( nAChRs ) [ 8-18 ] .
Yang penting , 4 dan 7 nAChRs memainkan peran penting dalam AChE - I-

dimediasi pelindung saraf , terutama melalui keterlibatan phosphatidylinositol 3 kinase ( PI3K ) jalur [ 8,17 ] . Sayangnya , beberapa in vivo studi telah meneliti
AChE -I aksi saraf [ 7 ] . Meskipun banyak penelitian telah menunjukkan efek
gejala donepezil pada model penuaan dan demensia [ 19-25 ] , beberapa penelitian
telah dibedakan dari gejala efek saraf dengan pemberian donepezil hanya sebelum
( tidak selama ) pengujian perilaku [ 12-14 , 26,27 ] . Yakni, menyuntikkan
Donepezil sebelum penghinaan hipoksia telah ditunjukkan untuk mengurangi
hipoksia -induced neurodegeneration dan gangguan perilaku [ 12 ] , dan , sama ,
pengadministrasian Donepezil sebelum injeksi AA ditunjukkan untuk memblokir
peroksidasi lipid dan defisit belajar [ 13 ] . Dalam kedua studi, efek saraf
donepezil tampaknya dimediasi oleh aktivasi reseptor 1 , protein yang terlibat
dalam modulasi Ca2 + intraseluler mobilisasi , stres oksidatif dan respon
neurotransmitter . Selanjutnya , donepezil pra-perawatan secara signifikan
mencegah isoflurane - diinduksi degenerasi kolinergik dan gangguan memori
spasial pada tikus berusia [ 27 ] dan dilemahkan Okadaic gangguan memori asam
- diinduksi , disfungsi mitokondria dan kematian sel apoptosis [ 26 ] . Donepezil
pretreatment juga mencegah defisit streptozotocin ( STZ ) - diinduksi memori ,
stres oksidatif , disfungsi mitokondria dan caspase - 3 kegiatan melalui
keterlibatan spesifik nAChRs [ 14 ] .

Dalam terang studi ini , tampaknya menarik untuk menilai sifat saraf pra - lesi
pengobatan Donepezil jangka panjang dalam model tikus deplesi BF kolinergik
yang disebabkan oleh 192 - imunoglobulin G ( IgG ) - saporin ( Sap ) injeksi .
Mengakibatkan kerugian tergantung Sap permanen dan selektif neuron kolinergik
BF meniru fitur neuropathological dan gangguan kognitif yang terkait dengan
MCI dan AD . Bahkan , Sap selektif menyebabkan kematian sel kolinergik dengan
menghambat

sintesis

protein

ribosom

ketika

diambil

ke

dalam

sel

mengekspresikan afinitas rendah P75 reseptor neurotrophin [ 28 ] . Dalam dua

dekade terakhir , ketersediaan Sap diperbolehkan mempelajari peran sistem

kolinergik BF dalam beberapa fungsi kognitif dan implikasinya dalam penuaan

dan demensia [ 29 ] .

Dalam penelitian ini , kami fokus pada tindakan saraf Donepezil dengan
menyelidiki pengaruh pra - perlakuan donepezil pada defisit kognitif dan
gangguan saraf yang disebabkan oleh intraparenchymal suntikan Sap ke dalam
septum medial ( MS ) dan basalis inti magnocellularis ( NBM ) . Untuk mencapai
tujuan ini , kinerja kognitif dan caspase - 3 tingkat aktivitas tikus cholinergically
habis pra - diobati dengan donepezil atau salin dibandingkan dengan orang-orang
pra - diobati hewan sham - lesi . Fungsi kognitif dianalisis dengan menggunakan
baterai macam tes perilaku , termasuk tinggi ditambah labirin ( EPM ) , lapangan
terbuka dengan benda ( OF ) , lengan radial maze ( RAM ) , sosialisasi dan
preferensi untuk pengujian kebaruan sosial ( PSNT ) dan pengkondisian takut
( FC ) dengan ultrasonik vokalisasi ( USV ) rekaman . The USVs frekuensi rendah
mencerminkan keadaan afektif negatif [ 30,31 ] dan berkorelasi positif dengan
aversiveness situasi [ 32 ] . Setelah pengujian perilaku , neurodegeneration
dianalisis dengan mengukur aktivitas caspase - 3 dalam hippocampus dan
neokorteks , daerah proyeksi dari situs lesi . Bahkan , caspase - 3 adalah caspase
efektor utama , yang lokal aktivasi dapat memicu hilangnya sinaptik ,
menyebabkan defisit kognitif dan perilaku [ 33 ] , sedangkan aktivasi yang kuat
menyebabkan menyalakan kaskade apoptosis . Karena peningkatan aktivitas
caspase-3 telah diusulkan sebagai peristiwa neurodegenerative awal dalam
perkembangan AD [ 34-36 ] , kuantifikasi yang mungkin berguna dalam
mengevaluasi efektivitas pengobatan farmakologis saraf .
Metode
Studi Hewan
Laki-laki tikus Wistar ( sekitar 300 g dan 2,5 bulan usia ) disimpan dalam kondisi
laboratorium standar ( 08.00:20.00 ringan , makanan dan air ad libitum dan
kelembaban terkendali dan suhu ) yang digunakan dalam percobaan . Hewan-

hewan yang dipelihara sesuai dengan pedoman perilaku etis yang dikembangkan
oleh Uni Eropa direktif dari 22 September 2010 ( 2010/63/EU ) . Studi ini
disetujui oleh komite etika lokal IRCCS Fondazione Santa Lucia . Tikus
mengalami pengujian perilaku secara acak ditugaskan untuk kelompok
eksperimen berikut : ( 1 ) donepezil diobati sham - lesi ( Don - Sham ) tikus ( n =
7 ) , yang diobati dengan donepezil dan kemudian sham - lesi ; ( 2 ) donepezil
diobati Sap - lesi ( Don - Sap ) tikus ( n = 8 ) , yang diobati dengan donepezil dan
kemudian Sap - lesi ; ( 3 ) garam - diperlakukan Sap - lesi ( Sal - Sap ) tikus ( n =
8 ) , yang diobati dengan saline ( NaCl 0,9 % ) dan kemudian Sap - lesi ; dan ( 4 )
sham - lesi ( Sal - Sham ) tikus garam - diobati ( n = 12 ) , yang diobati dengan
garam dan kemudian sham - lesi . Kelompok ini mencakup enam tikus utuh
diperlakukan dengan garam dan enam tikus pra - diperlakukan dengan garam dan
kemudian sham - lesi . Kinerja perilaku dua kelompok secara statistik tidak
berbeda di semua parameter perilaku berikut ( analisis multivariat varians ( group
parameter ) : Kelompok : F1 , 10 = 0,01 , P = ns; parameter : F37 , 370 = 120,79
, P < 0.000001 , dan kelompok parameter : F37 , 370 = 1,25 , P = ns; file
tambahan 1 ) . Hewan ini dikumpulkan dalam kelompok Sal - Sham . Pada akhir
pengujian perilaku , semua tikus dibunuh untuk memverifikasi lesi oleh kolin
asetiltransferase ( chatting ) imunohistokimia pada situs lesi ( MS dan NBM ) .
Selain itu , tambahan tiga tikus per kelompok siap untuk memverifikasi tingkat
CHAT di wilayah sasaran proyeksi kolinergik ( hippocampus dan neokorteks ) dan
gangguan sinaptik . Pada tikus ini , chatting densitometri dan caspase - 3 aktivitas
diukur 2,5 minggu setelah Sap atau operasi palsu .

Donepezil hidroklorida , ( RS ) -2 - [ ( 1 - benzil - 4 - piperidyl ) metil ] -5,6 dimetoksi - 2 ,3 - Dihydroinden - 1 -one ( Aricept , Pfizer Inc , New York , NY ,
USA ) , adalah intraperitoneal ( ip ) diberikan setiap hari dengan dosis 0,75 mg /
kg dilarutkan dalam 0,5 ml 0,9 % larutan NaCl . Volume yang sama dari garam
tanpa obat itu diberikan setiap hari untuk hewan yang digunakan sebagai kontrol (

Sal - Sham dan Sal - Sap ) . Pra - pengobatan dimulai 15 hari sebelum Sap atau
lesi palsu diciptakan dan dihentikan setelah pembedahan ( Gambar 1 ) . The
Donepezil Dosis dipilih berdasarkan informasi dari in vivo penelitian sebelumnya
[ 12,13 ] .
Gambar 1. Desain eksperimental.
Diagram menggambarkan waktu
global desain eksperimental dari
empat

kelompok.

berasal

dari

Data

yang

pre-treatment

(donepezil atau saline), lesi (192IgG-saporin, Sap, atau pura-pura),

caspase-3

dan

asetiltransferase
pengujian

kolin

analisis,

perilaku,

serta

ditandai.

Chatting, Kolin asetiltransferase;

Don-Sap, tikus Sap-lesi donepezil
diobati; Don-Sham, tikus sham-lesi donepezil diobati; IgG, imunoglobulin G; Sal-Sap, tikus Saplesi saline diobati; Sal-Sham, tikus sham-lesi saline yang diobati.

Operasi
Semua tikus dibius dengan campuran tiletamine / zolazepam ( 50 mg / kg Zoletil
100 ip , Virbac srl , Milan , Italia ) dan xylazine ( 10 mg / kg Rompun ip , Bayer
spa , Milan , Italia ) . Pada hewan yang akan lesi , immunotoksin 192 IgG - Sap
( Chemicon International , Harrow , UK ) telah bilateral disuntikkan melalui
jarum suntik 10 ml - Hamilton di MS ( dosis : 0,5 mg / side 192 IgG - Sap ;
Koordinat : anteroposterior ( AP ) = 0,45 mm ( dari bregma tersebut ) ;
mediolateral ( ML ) = 0,6 mm ( dari garis tengah ) , dan dorsoventral ( DV ) =
-7.2 mm ( dari dura ) [ 36 ] ) dan dalam NBM ( dosis : 0,4 mg / side Koordinat :
AP = 1 mm ( dari bregma tersebut ) , ML = 2,3 mm ( dari garis tengah ) , dan
DV = -8 mm ( dari dura ) [ 37 ] dengan dosis dan koordinat dimodifikasi dari yang
digunakan oleh Frick et al . [ 38 ] ) . 192 IgG - Sap diencerkan dalam PBS ( 1

mg : 1 ml ) disuntikkan pada tingkat 0,1 ml / menit . Pada akhir administrasi ,

jarum itu tertinggal in situ selama lima menit . Pada tikus yang tersisa , satusatunya solusi PBS disuntikkan .
Pengujian perilaku
Seperti ditunjukkan dalam Gambar 1 , 2,5 minggu setelah operasi ( waktu yang
dibutuhkan untuk mencapai kerugian yang stabil dan permanen neuron kolinergik
menggunakan Sap [ 28 ] ) , semua tikus menjadi sasaran tes berikut: EPM , untuk
menilai tingkat kecemasan ; OF , untuk mengevaluasi kemampuan untuk
mengembangkan kompetensi spasial dan diskriminatif ; RAM , untuk
menganalisis memori kerja spasial ; tes kemampuan bersosialisasi, untuk
menganalisis motivasi sosial; PSNT , untuk mengevaluasi diskriminasi kebaruan
sosial; dan kontekstual dan nada FC dengan rekaman USV , untuk menganalisis
akuisisi belajar permusuhan dan kompetensi emosional . Perintah pseudo- random
administrasi test digunakan dengan FC selalu menjadi tes terakhir , mengingat
tingkat stres yang tinggi.

Peningkatan ditambah labirin

Labirin mengangkat 90 cm di atas tanah dibentuk oleh struktur kayu dalam bentuk
salib dengan empat 50 cm 10 cm lengan . Utara dan selatan tangan terbuka , dan
lengan timur dan barat yang tertutup oleh tembok tinggi 36 cm . Parameter
diperhitungkan adalah frekuensi masukan ke dalam tangan terbuka dan tertutup ,
total waktu yang dihabiskan di lengan dan jumlah buang air besar [ 20 ] terbuka
dan tertutup .

Parameter diperhitungkan adalah : frekuensi entri dalam tangan terbuka dan

tertutup ; total waktu yang dihabiskan di tangan terbuka dan tertutup ; jumlah
buang air besar [ 20 ] .

Halaman 4-5

Lapangan terbuka dengan objek

Kelengkapan terdiri dari area melingkar ( diameter 140 cm ) dipisahkan oleh
dinding setinggi 30 cm. Selama sesi 1 ( S1 ), masing-masing tikus diizinkan untuk
bergerak bebas di lapangan kosong terbuka dan tingkat aktivitas dasar teratur.
Selama S2 ke S4 ( fase pembiasaan ), empat objek ditempatkan dalam susunan
kotak di tengah anulus dari lapangan dan yang kelima ditempatkan di tengahtengah. Dalam S5 dan S6 ( perubahan spasial ), konfigurasi spasial telah diubah
dengan memindahkan benda 2 dan 5 sehingga susunan kotak awal telah diubah
menjadi konfigurasi berbentuk poligon tanpa objek sentral. Selama S7 ( novelty ),
konfigurasi telah diubah dengan mengganti satu objek dengan objek yang baru.
Sesi berlangsung selama enam menit, dan interval intersession selama tiga menit.
Semua pengujian direkam dengan kamera video yang dihubungkan ke monitor
dan sebuah analisa gambar ( EthoVision, Noldus Teknologi Informasi,
Wageningen, The Netherlands ). Parameter diperhitungkan adalah total dan jarak
perifer bepergian di S1, waktu yang dihabiskan menghubungi benda, frekuensi
pemeliharaan , waktu bergerak dan jumlah buang air besar [ 20,39 ] .

Saraf Radial Tangan

Aparat terdiri dari platform pusat (diameter 30 cm ) dari mana delapan lengan
( lebar 12,5 cm panjang 60 cm ) terpancar seperti jari-jari roda . Sumur makanan
(diameter 5 cm , kedalaman 2 cm ) terletak di ujung setiap lengan [ 20 ] . A 40 - W
lampu merah bola menyediakan satu-satunya sumber penerangan di ruang
pengujian . Pengujian dilakukan 9:00-17:00 jam . Setelah fase pembiasaan ,
semua tikus ( yang makanan dibatasi untuk mengurangi berat badan mereka
sekitar 15 % ) menjadi sasaran RAM prosedur penuh umpan di mana semua
senjata yang berumpan dengan sepotong Purina chow ( Purina Mills , Gray

Summit , MO , USA ) dengan tujuan memiliki tikus mengumpulkan delapan

penghargaan dalam maksimum 16 entri . Hewan-hewan menjadi sasaran dua uji
coba sehari selama lima hari berturut-turut . Interval intersession adalah empat
jam . Parameter diperhitungkan adalah persentase dari total kesalahan ( jumlah
senjata ditinjau dibagi dengan jumlah total kunjungan 100 ) , berarti rentang
spasial ( urutan terpanjang senjata dikunjungi benar dalam setiap sesi ) dan
perseverations ( jumlah entri berturut-turut pada kelompok yang sama atau dalam
urutan tetap senjata ) .

Sosialisasi dan preferensi untuk pengujian kebaruan sosial

Aparat terdiri dari persegi panjang tiga ruang kotak kayu putih ( 150 40 40 cm
) . Ruang tengah panjang 30 cm , dan dua kamar lateral yang sangat panjang 60
cm . Tiga ruang dibagi oleh dua kaca dinding transparan dengan pintu tengah
terbuka (tinggi 10 cm , lebar 8 cm ) , yang memungkinkan akses gratis ke setiap
ruang lateral. Setiap ruang lateral yang terkandung kandang plastik kecil (diameter
18 cm ) dengan lubang meshlike di mana tikus asing yang terbatas untuk interaksi
sosial .

Tes terdiri dari 3 sesi : Habituasi , Sosialisasi dan PSNT . Selama habituasi ,
masing-masing tikus diizinkan untuk bebas bergerak dalam alat selama 10 menit .
Selama Sosialisasi , seorang remaja asing ( 35 sampai 45 hari ) laki-laki sejenis
( Asing 1 ) ditempatkan di dalam kandang kecil di salah satu ruang lateral ( dipilih
secara acak dan diimbangi untuk setiap kelompok ) . Tikus percobaan ditempatkan
dalam alat dan itu diperbolehkan untuk bebas menjelajahi tiga ruang dan
menghubungi kandang kecil selama sepuluh menit .

Selama PSNT , tikus lain yang tidak dikenal ( orang asing 2 ) ditempatkan dalam
kandang plastik dari ruang lateral yang berlawanan yang telah kosong selama sesi

10

Sosialisasi . Tikus percobaan diizinkan untuk bergerak bebas dan menghubungi

kandang plastik perumahan orang asing selama sepuluh menit . Interval antar sesi berlangsung selama tiga menit . Perilaku tikus ' direkam oleh kamera video
yang dipasang di langit-langit . Sinyal video yang dihasilkan diteruskan ke
monitor dan sebuah analisa gambar EthoVision . Parameter yang dianalisis dalam
setiap ruang lateralis adalah frekuensi masukan , total durasi ( dalam hitungan
detik ) dan total jarak tempuh ( dalam cm ) .

Konteks dan nada pengkondisian takut

Aparat terdiri dari 21 21 49 cm pendingin ruang (Model 7532 , Ugo Basile ,
Comerio , Italia ) . Dinding ruang terbuat dari kaca abu-abu , dan langit-langit
terbuat dari kaca transparan untuk memungkinkan perekaman video . Lantai
jaringan ( potongan baja spasi 1,5 cm ) terhubung ke pengacak kejutan Generator
( conditioner 7531 , Ugo Basile ) .

The FC Tes mencakup tiga sesi : pelatihan , konteks dan nada . Selama pelatihan
sesi , setelah 120 detik dari aklimatisasi dengan aparat pendingin (baseline ) , tiga
percobaan terdiri dari 30 detik paparan tone ( 2 kHz , 90 dB ) dilakukan . 2 detik
terakhir setiap nada yang dipasangkan dengan 1 mA - kaki shock. Tone - dan 60 detik interval antar - percobaan shock- bebas digunakan .

Setelah 24 jam , tikus ditempatkan untuk 240 detik di ruang pelatihan (uji konteks
) . Setelah 4 jam , tikus diserahkan kepada tes nada dalam kotak kaca putih ( 21
18 45 cm ) dengan garis-garis hitam diaplikasikan pada dinding . Setelah 120
detik dari aklimatisasi , nada 120 detik identik dengan yang digunakan dalam sesi
pelatihan terdengar tanpa kejutan (test tone ) .

11

Selama pelatihan , konteks dan nada tes , perilaku tikus ' direkam oleh kamera
video yang dipasang di langit-langit . Sinyal video yang dihasilkan diteruskan ke
monitor dan sebuah analisa gambar EthoVision . Selain itu, USVs 22 - kHz dicatat
[ 38,40 ] .

Parameter perilaku diperhitungkan adalah frekuensi dan durasi pembekuan

( imobilitas perilaku , kecuali untuk gerakan respirasi ) dan jumlah buang air besar
.

USVs dikumpulkan melalui mikrofon USG ( UltraSoundGate CM16 , Avisoft

bioacoustics , Berlin , Jerman ) ditempatkan melalui lubang di tengah-tengah atap
kamar uji sekitar 21 cm di atas lantai shock. Mikrofon sensitif terhadap 15-180
kHz frekuensi dengan respons frekuensi rata ( 6 dB ) antara 25 dan 140 kHz .
Hal ini dihubungkan dengan USB perangkat audio UltraSoundGate ke komputer
pribadi , yang mencatat data pada 250.000 Hz dalam format 16 - bit dan disimpan
sebagai file. Wav untuk analisis selanjutnya . File suara dipindahkan ke SASLab
Pro ( versi 5.2 ; Avisoft bioacoustics ) untuk analisis sonografi dan Transformasi
Fourier cepat ( FFT ) dilakukan ( 512 FFT panjang , 100 % bingkai , Hamming
jendela dan 75 % jendela waktu tumpang tindih ) . Parameter USV diperhitungkan
adalah jumlah panggilan yang dipancarkan , puncak amplitudo dan frekuensi ,
modulasi frekuensi dan durasi panggilan .

Analisis histologis
Pada akhir pengujian perilaku , hewan-hewan itu sangat dibius dan transcardially
perfusi dengan garam , diikuti oleh 4 % dan 0,1 % paraformaldehyde
glutaraldehid di PBS ( 4 C , pH 7,5 ) . Otak telah dihapus dan cryoprotected
dalam 30 % buffer sukrosa dan memotong pada mikrotom beku . Bagian anterior

12

dari otak dipotong menjadi bagian-bagian koronal dari 40 pM dan disimpan untuk
Chat imunohistokimia .

Kolin asetiltransferase pewarnaan imunohistokimia

Bagian ( 40 pM ) immunostained untuk Chat yang dipreinkubasi di PBS pada 4
C , kemudian di 0,4 % Triton X - 100 dalam PBS dan akhirnya pada 0,1 % Triton
X - 100 ditambah 1 % bovine serum albumin ( Sigma - Aldrich , St Louis , MO ,
USA ) ditambah serum kambing normal ( NGS , Vector Laboratories , Burlingame
, CA , USA) di PBS . Bagian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 4 C dengan
0,1 % Triton X - 100 dan NGS di PBS dengan antibodi primer untuk chatting
diencerkan 1:1.000 ( Chemicon International ) . Selanjutnya , bagian diinkubasi
dengan antibodi sekunder terbiotinilasi ( kambing anti - rabbit IgG - biotin
konjugat ) dan 3 % NGS ( Kit Elite PK - 6101 , Vector Laboratories ) di PBS
selama 10 menit pada suhu kamar . Pewarnaan divisualisasikan dengan 0,05 %
diaminobenzidin dan amonium nikel ( II ) sulfat ( Sigma - Aldrich Chemie ,
Steinheim , Jerman ) setelah inkubasi dengan avidin dan peroksidase terbiotinilasi
( Kit Elite PK - 6101 ) . Bagian kemudian dibilas di PBS . Stained bagian yang
terpasang pada slide, dehidrasi dan coverslipped . Untuk mengecualikan artefak ,
dalam setiap kasus beberapa bagian acak diproses seperti yang dijelaskan
sebelumnya . Satu-satunya perbedaan adalah tidak adanya antibodi primer .

Analisis biokimia
Jumlah persiapan homogenat dari jaringan hippocampal dan neokorteks
Setelah hewan-hewan itu dipenggal , hippocampal dan jaringan neokorteks yang
dibedah dan homogen dalam buffer lisis ( 320 mM sukrosa , 50 mM NaCl , 50
mM Tris - HCl ( pH 7,5 ) , 1 % Triton X - 100 , 0,5 mM natrium orthovanadate , 5
mM - glycerophosphate , protease inhibitor ) , kemudian diinkubasi pada es
selama 30 menit dan disentrifugasi pada 13.000 g selama 10 menit . Total

13

kandungan protein supernatan yang dihasilkan ditentukan dengan metode uji

Bradford .

Analisis imunoblot dan antibodi

Protein menjadi sasaran SDS -PAGE dan electroblotted ke membran
polyvinylidene fluoride . Analisis imunoblot dilakukan dengan menggunakan kit
deteksi chemiluminescence . Tingkat relatif immunoreactivity ditentukan dengan
densitometri menggunakan software ImageQuant 5.0 . Antibodi anti - CHAT yang
dibeli dari Chemicon International ( AB143 ) , dan anti - aktin clone EP184E
kelinci antibodi monoklonal diperoleh dari Merck Millipore ( 04-1040 , Boston,
MA , USA ) .

Assay fluorometric caspase - 3 aktivitas

Jumlah hippocampal dan jaringan neokorteks dihomogenisasi dalam lisis uji
penyangga ( 100 mM 2 - [ 4 - ( 2 - hidroksietil ) piperazin - 1 -il ] ethanesulfonic
asam ( pH 7,4 ) , 0,1 % 3 - [ ( 3 - cholamidopropyl ) dimethylammonio ] - 1 propanesulfonate ( wt / vol ) , 1 mM asam ethylenediaminetetraacetic , 10 mM
dithiothreitol , 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride ) dan segaris dengan
membekukan cairan N2 dan pencairan pada 37 C tiga kali . Setelah sentrifugasi
pada 11.500 g selama 5 menit , konsentrasi protein yang dihasilkan supernatan
ditentukan dan jumlah yang sama protein diinkubasi pada suhu 37 C dalam lisis
penyangga assay yang mengandung 50 mM caspase - 3 substrat II , fluorogenic
( Ac - DEVD - AMC ; Calbiochem , San Diego , CA , USA ) . Fluoresensi diukur
dengan 380 nm panjang gelombang eksitasi dan 460 nm panjang gelombang emisi
.
Analisis statistik

14

Semua data diuji normalitas ( uji Shapiro - Wilk ) dan homoscedasticity (uji
Levene ) . Data perilaku dianalisis dengan menggunakan analisis dua arah varians
( ANOVA , F -statistic ) ( dengan obat dan lesi seperti antara hewan - faktor ) atau
model campuran dari tiga - way ANOVA ( dengan obat dan lesi seperti antara
hewan - faktor dan lengan / session / object / hari / ruang seperti dalam hewan
faktor ) . Post hoc perbandingan dilakukan dengan menggunakan uji beda jujur
signifikan Tukey . Ketika asumsi parametrik tidak terpenuhi, transformasi data
( transformasi sudut untuk persentase ) atau nonparametrik ANOVAs (uji Kruskal
- Wallis ( H - statistik ) dan Mann - Whitney U uji; Z - statistik ) yang digunakan .
Data biokimia tingkat obrolan dianalisis dengan uji t-Student , dan data mengenai
caspase- 3 aktivitas dianalisis menggunakan Bonferroni beberapa perbandingan
tes . Perbedaan dianggap signifikan pada P 0,05 .

Hasil
Lesi verifikasi oleh kolin asetiltransferase pewarnaan imunohistokimia
Kehadiran obrolan immunoreactive (chatting-IR) neuron di daerah proyeksi BF
dinilai dengan pemeriksaan (Angka 2 (a), 2 (a1), 2 (b), 2 (b1), 2 (d), 2 (d1 ), 2 (e)
dan 2 (e1)). Bagian otak divisualisasikan dengan mikroskop cahaya softwareinterface Neurolucida (MBF Bioscience, Williston, VT, USA). Menggunakan
tujuan 10 lensa, neuron chatting-IR dinilai dalam dua wilayah utama BF: MS,
dengan mempertimbangkan lima bagian 40-m antara 1,20 dan 0,20 mm anterior
untuk bregma, dan NBM, dengan mempertimbangkan delapan bagian 40-pM
antara 0,80 dan 2,30 mm posterior ke bregma [37]. Inspeksi visual tambahan
dilakukan untuk mengecualikan degenerasi akhirnya interneuron kolinergik
striatal setelah ip Suntikan getah di NBM (Angka 2 (c), 2 (c1), 2 (f) dan 2 (f1)).
Gambar 2. Kolin asetiltransferase pewarnaan imunohistokimia. Photomicrographs Perwakilan
intraparenchimal efek injeksi Sap. Gambar menunjukkan bagian otak tikus yang saline-diobati,
sham-lesi (a, b dan c); saline-diobati, Sap-lesi (a1, b1 dan c1); Donepezil-diobati, sham-lesi (d, e
dan f); dan donepezil diobati, Sap-lesi (d1, e1 dan f1). Bagian koronal pada tingkat septum medial

15

(a, a1, d dan d1), basalis inti magnocellularis (b, b1, e dan
e1) dan striatal (c, c1, f dan f1) daerah dengan kolin
asetiltransferase

neuron

immunoreactive

akan

ditampilkan. Perhatikan adanya besar neuron kolinergik

di kedua wilayah dari hewan lesi (a1, b1, d1 dan e1) dan
pelestarian besar interneuron kolinergik striatal (c1 dan
f1). Lensa obyektif: 10 . Skala bar: 50 pM.

Lesi verifikasi dengan analisis imunoblot

asetiltransferase kolin
Suntikan intraparenchymal Sap di NBM dan
MS disebabkan kerugian luas CHAT-IR di
boutons

sinaptik

dari

neokorteks

dan

hipokampus, seperti yang ditunjukkan oleh penurunan yang kuat dalam ekspresi
CHAT (Gambar 3). Penurunan sebanding ekspresi chatting terdeteksi di
hippocampi dan neokorteks dari kedua kelompok lesi (Don-Sap dan Sal-Sap).
Sebaliknya, ekspresi CHAT tidak berbeda nyata dalam kelompok sham-lesi (SalSham dan Don-Sham).

Gambar 3. Kolin asetiltransferase analisis imunoblot. Perwakilan kolin asetiltransferase (chatting)

immunoblots dari hippocampal (hp) dan neokorteks (cx) jumlah ekstrak protein dan kuantifikasi
densitometri dari perubahan nilai abu-abu dinyatakan sebagai mean SD. Perubahan kali lipat
relatif dalam tingkat protein chatting yang dinormalisasi sehubungan dengan tingkat aktin, yang

16

digunakan sebagai kontrol pemuatan. Perbedaan statistik

yang diamati antara palsu dan 192-IgG-saporin hewan
(Sap)-lesi (n = 3/group). * P <0,05 dengan t-test. DonSap, tikus Sap-lesi donepezil diobati; Don-Sham, tikus
sham-lesi donepezil diobati; Sal-Sap, tikus Sap-lesi saline
diobati; Sal-Sham, tikus sham-lesi saline-diobati.

Hippocampus

dan

neokorteks

caspase-3

aktivitas
Sebuah peningkatan yang signifikan dalam
aktivitas caspase-3 tampak jelas pada kelompok
Sal-Sap; Namun, penyelamatan parsial tetapi
signifikan ditemukan pada kelompok Don-Sap di kedua hipokampus dan ekstrak
neokorteks. Kedua kelompok sham-lesi (Don-Sham dan Sal-Sham) menunjukkan
tingkat yang sama caspase-3 kegiatan di kedua ekstrak hippocampus dan
neokorteks (Gambar 4).

Gambar 4. Hippocampal dan neokorteks caspase-3 kegiatan. Caspase-3 aktivitas diungkapkan oleh
alat tes fluorometric total homogenat hippocampal dan neokorteks dari sham dan lesi tikus (n =
3/group). Data fluorometric dinyatakan sebagai rata-rata SEM. * P <0,05, *** P 0,001
(Bonferroni beberapa perbandingan test). Don-Sap, tikus Sap-lesi donepezil diobati; Don-Sham,
tikus sham-lesi donepezil diobati; Sal-Sap, tikus Sap-lesi saline diobati; Sal-Sham, tikus sham-lesi
saline-diobati.

17

Peningkatan ditambah labirin

Hewan-hewan dari semua kelompok
lebih sering masuk (F1, 31 = 47.94, P
<0.000001) dan menghabiskan lebih
banyak waktu (F1, 31 = 200,66, P
<0.000001)

di

lengan

tertutup

daripada di tangan terbuka. Tidak ada

perbedaan yang terdeteksi dalam
jumlah buang air besar. Dengan demikian, baik obat maupun lesi mempengaruhi
perilaku-kecemasan terkait dalam EPM (file tambahan 2).
Buka lapangan dengan benda
Dua - way ANOVA pada jarak keseluruhan atau perifer bepergian di S1 tidak
ditemukan adanya pengaruh yang signifikan dari obat atau lesi . A tiga - way
ANOVA ( obat lesi sesi ) pada waktu bergerak gagal untuk mengungkapkan
pengaruh yang signifikan dari obat atau lesi . Efek Session ( F6 , 186 = 5,01 , P <
0,0001 ) yang signifikan, karena waktu bergerak meningkat di seluruh tugas pada
semua kelompok . Lesi interaksi sesi juga signifikan ( F6 , 186 = 2,42 , P =
0,03 ) . Post hoc perbandingan menunjukkan bahwa kedua kelompok lesi ( Don Sap dan Sal - Sap ) cenderung menunjukkan waktu bergerak lebih rendah dari
hewan sham ( Don - Sham dan Sal - Sham ) di sesi akhir tes ( S6 : P = 0,02 ; S7 :
P = 0,07 ) . Tidak ada interaksi yang signifikan lainnya yang ditemukan . Seperti
sesi berlalu , pemeliharaan ( F6 , 186 = 28,52 , P = 0.000001 ) dan buang air besar
( F6 , 186 = 14,88 , P = 0.000001 ) menurun tanpa perbedaan yang signifikan
antara kelompok-kelompok . Untuk kedua parameter , tidak ada efek obat dan lesi
signifikan yang diamati .

18

Dengan keberadaan benda , semua hewan menunjukkan pembiasaan , seperti

diungkapkan oleh efek sesi signifikan ( F2 , 62 = 42,26 , P < 0.000001 ) dari tiga way ANOVA ( obat lesi sesi ) pada waktu kontak . Obat dan lesi efek dan
interaksi mereka tidak signifikan .

A tiga - way ANOVA ( obat lesi objek ) pada S5 waktu kontak

mengungkapkan efek objek yang signifikan ( F1 , 31 = 23.28 , P < 0,0001 ) , serta
interaksi yang signifikan obat objek ( F1 , 31 = 14,22 , P < 0,001 ) , lesi objek
( F1 , 31 = 8.11 , P < 0,01 ) dan obat lesi objek ( F1 , 31 = 7.15 , P = 0,01 ) .
Posting perbandingan hoc dilakukan pada interaksi orde kedua menunjukkan
bahwa , di S5 , kedua kelompok sham ( Don - Sham dan Sal - Sham ) , serta
kelompok - Don Sap , mengakui perubahan spasial ( P < 0,01 ) , sedangkan tikus
Sal - Sap gagal mendeteksi konfigurasi ruang yang baru ( Gambar 5 ( a) ) . Obat
dan lesi efek dan interaksi mereka tidak signifikan .

A tiga - way ANOVA ( obat lesi objek ) pada S6 waktu kontak

mengungkapkan efek lesi yang signifikan ( F1 , 31 = 24.64 , P < 0,0001 ) , serta
interaksi yang signifikan obat objek ( F1 , 31 = 13.18 , P = 0,001 ) , lesi objek
( F1 , 31 = 14.05 , P = 0,001 ) dan obat lesi objek ( F1 , 31 = 9.26 , P = 0,005 )
. Post hoc perbandingan pada interaksi orde kedua mengungkapkan bahwa ,
meskipun Don - Sham , Sal - Sham dan kelompok Don - Sap tidak menunjukkan
preferensi terhadap benda pengungsi , tikus Sal - Sap terus mengeksplorasi objek
nondisplaced lagi ( P < 0,001 ) ( Gambar 5 ( b ) ) . Obat dan objek efek dan obat
interaksi lesi yang tidak signifikan .

Gambar 5. Lapangan terbuka dengan objek. Efek donepezil pra-pengobatan dan 192-IgG-saporin
(Sap) lesi di lapangan terbuka dengan benda waktu kontak dengan benda selama perubahan spasial

19

dalam sesi 5 (S5) (a), S6 (b) dan kebaruan (S7) (c)

. Deplesi kolinergik per se (kelompok Sal-Sap)
secara signifikan mempengaruhi kemampuan
diskriminasi spasial di S5 dan S6, dan donepezil
pra-perlakuan (kelompok Don-Sap) mencegah
defisit memori spasial. Dalam S7, semua tikus
mendeteksi keberadaan objek baru. Data perilaku
yang dinyatakan sebagai berarti SEM, dan tanda
bintang menunjukkan perbandingan post hoc
antara kelompok. DO, Pengungsi objek; Don-Sap,
tikus Sap-lesi donepezil diobati; Don-Sham, tikus
sham-lesi donepezil diobati; FO, benda asing;
NDO, benda-benda non-pengungsi; NO, objek
baru; Sal-Sap, tikus Sap-lesi saline diobati; SalSham, tikus sham-lesi saline-diobati. ** P <0,01,
*** P <0.001.

A tiga - way ANOVA ( obat lesi objek ) dari S7 waktu kontak menunjukkan
bahwa semua hewan yang diakui baru , seperti yang diungkapkan oleh efek objek
yang signifikan ( F1 , 31 = 25.31 , P < 0,0001 ) ( Gambar 5 ( c ) ) . Obat dan objek
efek dan interaksi mereka tidak signifikan .

A tiga - way ANOVA ( obat lesi objek ) dari S7 waktu kontak menunjukkan
bahwa semua hewan yang diakui baru , seperti yang diungkapkan oleh efek objek
yang signifikan ( F1 , 31 = 25.31 , p < 0,0001 ) ( Gambar 5c ) . Obat dan efek
objek , dan interaksi mereka tidak signifikan .

Lengan radial labirin

Sebagai tugas berlalu , semua hewan tetapi tikus Sal - Sap belajar untuk benar
mengunjungi lengan berumpan . A tiga - way ANOVA ( obat lesi hari ) total

20

kesalahan menunjukkan efek yang signifikan dari lesi ( F1 , 31 = 16.92 , P < 0,001
) dan hari ( F4 , 124 = 11.26 , P < 0.000001 ) , serta signifikan interaksi orde
kedua ( F4 , 124 = 2,75 , P < 0,05 ) . Post hoc perbandingan interaksi
mengungkapkan bahwa Sal - Sham , Don - Sham dan Don - Sap kinerja tidak
berbeda secara signifikan. Sebaliknya, tikus Sal - Sap dibuat secara signifikan
lebih banyak kesalahan daripada Sal - Sham dan Don - Sap hewan , seperti yang
dilaporkan dalam Gambar 6 ( a) . Tidak ada efek obat yang signifikan atau orde
pertama interaksi ditemukan .
Gambar 6. Lengan Radial labirin. Efek donepezil pra-pengobatan dan 192-IgG-saporin (Sap) lesi
di lengan maze jumlah kesalahan radial (a), rentang spasial (b) dan perseverations (c). Praperawatan Donepezil mengurangi jumlah kesalahan dan
meningkatkan rentang spasial pada tikus cholinergically
habis. Sal-Sham vs Sal-Sap: # p <0,05; # # p <0,01; # # #
p <0,001; Don-Sap vs Sal-Sap: * p = 0,05, ** p = 0,01.
Don-Sap, tikus Sap-lesi donepezil diobati; Don-Sham,
tikus sham-lesi donepezil diobati; Sal-Sap, tikus Sap-lesi
saline diobati; Sal-Sham, tikus sham-lesi saline-diobati.

A tiga - way ANOVA ( obat lesi hari ) dari

rentang spasial mengungkapkan pengaruh signifikan hari ( F4 , 124 = 12.19 , P <
0.000001 ) dan interaksi orde kedua ( F4 , 124 = 3.01 , P < 0,05 ) . Post hoc
perbandingan menunjukkan bahwa tikus Sal - Sap dipamerkan rentang spasial
lebih pendek dari hewan di Sal - Sham dan Don - Sap kelompok ( Gambar 6 ( b ) )
. Tidak ada obat dan lesi efek signifikan atau orde pertama interaksi ditemukan .

21

The Kruskal - Wallis tes menunjukkan perbedaan yang signifikan antara empat
kelompok eksperimen ( H = 9.45 , P = 0,02 ) . Bahkan , kehadiran ditandai
perseverations tampak jelas pada hewan Sal - Sap bila dibandingkan dengan Sal
-Sham tikus ( Z = -2,75 , P = 0,007 oleh Mann- Whitney U test ) . Sebaliknya,
tidak ada perbedaan dalam perseverations ditemukan antara Sal - Sham , Don Sham dan kelompok Don - Sap . Selain itu , kelompok - Don Sap cenderung
perseverate kurang dari hewan Sal - Sap ( P = 0,08 ) ( Gambar 6 ( c ) ) ,
menunjukkan kecenderungan mengurangi perilaku perseverative di hadapan lesi
dengan donepezil pra-perawatan .

Sosialisasi dan preferensi untuk pengujian kebaruan sosial

Pembiasaan
Tiga - way ANOVA ( obat lesi chamber ) pada semua parameter selama sesi
habituasi memungkinkan kita untuk mengecualikan preferensi samping, yang bisa
merupakan bias untuk sesi tes berikut ( Tabel 1 ) .

Tabel 1 . Statistik perbandingan respon perilaku dalam pembiasaan , sosialisasi

dan preferensi untuk kebaruan sosial testa
keramahan
Selama sesi sosialisasi , semua tikus menunjukkan preferensi yang ditandai untuk
orang asing 1 ruang ( Gambar 7 ( a) ) tentang durasi dan jarak ( P < 0.000001 ) ,
tapi tidak frekuensi masukan ( Tabel 1 ) .
Gambar 7. Sosialisasi dan preferensi untuk pengujian kebaruan sosial. Efek donepezil prapengobatan dan 192-IgG-saporin (Sap) lesi pada sosialisasi (a) dan preferensi untuk pengujian
kebaruan sosial (PSNT) (b). Meskipun tidak ada perbedaan di antara empat kelompok yang
ditemukan dalam tes kemampuan bersosialisasi, kedua kelompok hewan cholinergically habis
(Don-Sap dan Sal-Sap) gagal untuk menunjukkan suatu kebaruan sosial terbuka selama PSNT.
Tanda bintang menunjukkan perbandingan antara orang asing dan 1 kosong / asing 2 perilaku

22

ruang dalam empat kelompok. ** P

<0,01, **** P <0,0001. Simbol Pound
menunjukkan

perbandingan

antara

orang asing dan orang asing 1 ruang 2

perilaku ruang dalam kelompok palsu
(Don-Sham dan Sal-Sham). # P <0,05,
# # P = 0,01. Don-Sap, tikus Sap-lesi
donepezil diobati; Don-Sham, tikus
sham-lesi donepezil diobati; Sal-Sap,
tikus Sap-lesi saline diobati; Sal-Sham,
tikus sham-lesi saline yang diobati.

Preferensi untuk pengujian kebaruan sosial

Don- Sham dan Sal - Sham tikus menunjukkan preferensi diperkirakan untuk
orang asing 2 chamber ( durasi : P = 0,04 ; jarak : P = 0,01 ) ( Gambar 7 ( b ) dan
Tabel 1 ) . Sebaliknya, Don - Sap dan Sal - Sap tikus , meskipun mereka
memasuki asing 2 ruang lebih sering ( P < 0,01 ) , tidak menunjukkan pengakuan
sosial baru yang jelas , seperti yang ditunjukkan oleh waktu yang dihabiskan dan
jarak tempuh dalam asing 2 chamber ( Gambar 7 ( b ) dan Tabel 1 ) .

Konteks dan nada pengkondisian takut

Latihan
Dalam semua hewan , postshock pembekuan meningkat secara signifikan dalam
durasi ( F5 , 155 = 51.90 , P < 0.000001 ) dan frekuensi ( F5 , 155 = 22,77 , P <
0.000001 ) dibandingkan untuk baseline selama shock presentasi . Baik obat
maupun lesi yang terkena durasi atau frekuensi pembekuan ( Gambar 8 ( a) ) .
Juga, tidak ada perbedaan yang terdeteksi mengenai jumlah buang air besar .
Adapun USVs , uji Kruskal - Wallis menunjukkan perbedaan yang signifikan
antara kelompok-kelompok ( H = 8.21 , P = 0,04 ) . Bahkan , tikus Sal - Sap

23

disuarakan secara signifikan lebih sering daripada tikus Sal - Sham ( Z = 2,53 , P
= 0,02 oleh Mann- Whitney U test ) , sedangkan tidak ada perbedaan signifikan
yang ditemukan antara kelompok yang tersisa ( Gambar 8 ( a) ) . Selain itu , tikus
- Don Sap cenderung memancarkan jumlah yang lebih tinggi daripada hewan
USVs Sal - Sap ( Z = 1,85 , P = 0,06 oleh Mann- Whitney U test ) . Temuan ini
menunjukkan kecenderungan donepezil penyelamatan produksi USV di hadapan
lesi kolinergik . Parameter USV lainnya dilaporkan dalam file tambahan 3.

Gambar 8. Penyejuk Takut. Efek donepezil

pra-pengobatan dan 192-IgG-saporin (Sap)
lesi pada persentase pembekuan dan jumlah
total 22-kHz ketakutan terkait vokalisasi
ultrasonik (USVs) selama pengkondisian
takut (FC) pelatihan (a), konteks (CN) test
(b) dan nada (TN) test (c). Semua hewan
memperoleh respon pembekuan yang jelas
selama pelatihan FC dan menunjukkan
retensi

mnesic

respon

pembekuan

dikondisikan selama CN dan tes TN. USVs

yang hampir benar-benar ditekan pada tikus
Sap-lesi saline yang diobati, dan donepezil
pra-perlakuan cenderung meningkat USV
produksi pada tikus Sap-lesi donepezil diobati selama pelatihan FC. BS, Baseline; Don-Sham,
tikus sham-lesi donepezil diobati; ITI, Interval Inter-sidang; Sal-Sham, tikus sham-lesi Salinediobati. Semua kelompok: **** P <0,00001; Sal-Sham vs Sal-Sap: # P <0,05.

Tes konteks
Selama pengujian konteks, semua hewan dipamerkan pembekuan meningkat
secara signifikan dalam durasi (F1, 31 = 350,98, P <0.000001) dan frekuensi (F1,
31 = 87,43, P <0.000001) dibandingkan dengan nilai-nilai dasar, menunjukkan
retensi yang efektif dari respon rasa takut AC . Baik obat maupun lesi yang
terkena durasi atau frekuensi pembekuan (Gambar 8 (b)). Tidak ada perbedaan
yang diamati antara kelompok-kelompok dalam jumlah buang air besar. Adapun

24

USVs, kelompok eksperimen hanya cenderung berbeda (H = 6.71, P = 0,08

dengan uji Kruskal-Wallis), dengan Don-Sap dan Sal-Sap tikus lesi memancarkan
USVs kurang dari tikus palsu. Parameter USV lanjut dilaporkan dalam file
tambahan 4.

Tes Tone
Semua tikus menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam durasi (F1, 31 =
113,44, P <0.000001) dan frekuensi (F1, 31 = 52.61, P <0.000001) pembekuan
selama nada reexposure dibandingkan dengan nilai-nilai dasar, menunjukkan
sekali lagi merupakan retensi efektif respon ketakutan AC. Baik obat maupun lesi
yang terkena durasi atau frekuensi pembekuan (Gambar 8 (c)). Tidak ada
perbedaan yang diamati antara kelompok-kelompok dalam jumlah buang air
besar. USVs yang hampir dipancarkan oleh semua tikus, terlepas dari kondisi obat
dan lesi (H = 2,53, P = 0,47 dengan uji Kruskal-Wallis) (Gambar 8 (c)). Parameter
USV lanjut dilaporkan dalam file tambahan 5.

Diskusi
Seperti pengurangan ACh merupakan ciri morfofungsi dalam AD , AChE -Is ,
seperti donepezil , digunakan untuk meningkatkan penurunan kognitif yang
berhubungan dengan AD [ 7 ] . Selain efek gejala , banyak dalam studi in vitro
telah menunjukkan bahwa AChE -Is bisa menimbulkan aksi saraf terhadap agen
neurotoksik , seperti glutamat dan AA plak [ 8-11,15-18 ] . Sayangnya , hanya
sedikit dalam percobaan in vivo telah mengkonfirmasi AChE -I pra - lesi aksi
saraf [ 12-14,26,27 ] . Menariknya , penelitian ini menunjukkan efek saraf
ditandai Donepezil terhadap neurodegeneration dan gangguan kognitif yang
disebabkan oleh deplesi kolinergik pada tikus . Donepezil pretreatment tidak
menginduksi modifikasi biokimia atau perilaku pada tikus sham - lesi , yang
sesuai dengan temuan Saxena et al . [ 14 ] dan Su et al . [ 27 ] . Kami sebelumnya

25

menunjukkan bahwa tikus yang sehat diobati dengan donepezil selama pengujian
perilaku menunjukkan peningkatan memori dan eksploratif fungsi dalam RAM
dan OF , serta mengurangi tingkat kecemasan di EPM , tetapi mereka tidak
menunjukkan perbaikan dalam rentang spasial , tingkat motivasi dan asosiatif
belajar [ 41 ] . Dengan demikian , walaupun pengobatan Donepezil selama
pengujian dapat meningkatkan kinerja kognitif bahkan pada hewan unlesioned ,
pengobatan Donepezil sebelum pengujian ( pre-treatment ) diberikannya tindakan
saraf hanya di hadapan lesi atau penghinaan .

Deplesi kolinergik per se ( kelompok Sal - Sap ) meningkat hippocampal dan

neokorteks caspase - 3 aktivitas dan gangguan kinerja memori kerja dalam RAM
dan deteksi perubahan spasial dalam OF , diubah kinerja diskriminasi sosial di
PSNT dan mengurangi USV produksi selama FC , tapi itu tidak mempengaruhi
tingkat kecemasan di EPM dan FC akuisisi . Hasil perilaku dalam penelitian kami
sejalan dengan yang dilaporkan dalam studi sebelumnya defisit memori
[ 20,29,42,43 ] dan gangguan produksi USVs [ 38,40,43 ] dan tidak ada efek pada
tingkat kecemasan berikut 192 IgG - Sap lesi [ 20,44 ] . Saat ini kami adalah yang
pertama yang menjelaskan caspase- 3 kegiatan di wilayah sasaran proyeksi
kolinergik . Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa donepezil pretreatment
( kelompok Don - Sap ) mampu melawan neurodegeneration terkait dengan
penurunan kolinergik . Bahkan , hippocampal dan neokorteks caspase - 3 tingkat
yang diamati pada tikus Don - Sap menurun secara bermakna dibandingkan
dengan Sal - Sap . Hasil ini sejalan dengan penelitian sebelumnya menggunakan
donepezil pre-treatment dalam paradigma percobaan yang berbeda . Dalam
sebuah penelitian glutamat excitotoxicity , donepezil pra-perawatan secara
signifikan mencegah aktivasi caspase-3 , berkontribusi terhadap internalisasi dan
downregulation dari N - methyl - D - aspartate ( NMDA ) reseptor melalui 7
nAChR stimulasi [ 15 ] . Selain itu, berikut STZ lesioning , donepezil pra pengobatan secara signifikan dicegah hippocampal dan neokorteks caspase - 3
aktivitas [ 14 ] . Pengurangan hippocampal dan neokorteks caspase - 3 kegiatan

26

dengan pra - pengobatan donepezil berikut deplesi kolinergik menambah bukti

lebih lanjut untuk Donepezil tindakan saraf . Efek ini dapat dianggap berasal dari
up-

regulasi

nAChRs

dan

aktivasi

akibat

dari

anti

-apoptosis

nAChR/PI3K/Akt/Bcl2 jalur , seperti hipotesis sebelumnya [ 8,17 ] . Yaitu ,

beberapa studi telah menunjukkan keterlibatan nAChRs di donepezil diinduksi
pelindung saraf . Bahkan , berbeda dengan AChE - Apakah galantamine dan
tacrine , administrasi donepezil berkepanjangan menginduksi bukan hanya upregulasi fungsional tetapi juga peningkatan ekspresi nAChRs [ 9,17 ] . Yang
penting , nAChR up - regulasi oleh donepezil mampu mengaktifkan sistem
intraseluler anti - apoptosis sekunder messenger, seperti jalur nAChR/PI3K , yang
melindungi neuron terhadap neuron mati [ 17 ] . Selain itu , efek saraf Donepezil
tampaknya dimediasi oleh aktivasi reseptor 1 yang menghasilkan modulasi
intraselular Ca2 + mobilisasi dan aktivasi fosfolipase C ( PLC ) / protein kinase C
( PKC ) jalur transduksi , menghaluskan efek disfungsi retikulum mitokondria
atau endoplasma [ 12,13 ] .

Tindakan saraf pra - pengobatan donepezil pada hippocampus dan neokorteks

neurodegeneration dapat menjelaskan RAM ditingkatkan dan OF kinerja spasial
hewan lesi pra - diobati . Yaitu , dalam RAM , tikus Don - Sap dipamerkan angka
yang lebih rendah dari kesalahan dan rentang spasial yang lebih tinggi daripada
tikus Sal - Sap , mencapai tingkat kinerja mnesic tikus sham - lesi .

Efek menguntungkan dari pengobatan donepezil pada memori kerja spasial telah
dibuktikan dalam banyak model eksperimental . Bahkan , administrasi donepezil
mengurangi kesalahan RAM di usia atau skopolamin yang diobati hewan [ 45,46 ]
. Peningkatan memori kerja telah dilaporkan pada tikus berusia diobati dengan
donepezil atau agonis 7 nikotinat ( mulai satu minggu sebelum pelatihan perilaku
) [ 23 ] . Selain itu, dalam model tikus dari deplesi kolinergik , administrasi
donepezil (mulai 1 minggu sebelum dan berlangsung 9 minggu setelah lesioning )

27

dikurangi defisit memori prosedural dan bekerja di RAM [ 20 ] . Dalam hipoksia

dan toksisitas AA model , donepezil pra - pengobatan dicegah spasial defisit
memori kerja [ 12,13 ] .

Bahkan di OF , meskipun penurunan kolinergik per se ( kelompok Sal - Sap )

secara signifikan mempengaruhi kemampuan diskriminasi spasial , pra perlakuan ( kelompok Don - Sap ) donepezil mencegah defisit memori spasial .
Konsisten dengan sebelumnya dijelaskan gangguan perubahan spasial dan
diawetkan pengakuan baru berikut Sap lesi [ 20,42,43,47 ] , semua tikus lesi
mendeteksi keberadaan objek baru , seperti tikus sham- lesi lakukan. Bahkan ,
meskipun deteksi perubahan spasial menyiratkan pemetaan spasial efisien ,
deteksi kebaruan menyiratkan pengakuan dari objek yang menonjol , sehingga
meminimalkan efek dari faktor spasial dan kontekstual [ 38,48,49 ] . Menariknya ,
kemampuan diawetkan dalam mendeteksi perubahan spasial tikus Don - Sap
mengungkapkan efek saraf tertentu donepezil pada defisit spasial halus yang
disebabkan oleh lesi kolinergik dan berada dalam perjanjian dengan sifat saraf
donepezil pada pertunjukan mnesic spasial kerusakan otak yang berbeda model
[ 12 -14,26,27 ] .

Dalam semua hewan , shock paparan memicu respon pembekuan yang jelas
selama pelatihan FC , dan respon pembekuan AC dipertahankan selama konteks
dan nada tes . Meskipun lesi tidak mengubah respon pembekuan , itu mengalami
penurunan seiring produksi USVs 22 - kHz . Menariknya , donepezil pretreatment selama pelatihan FC hanya cenderung untuk menyelamatkan cacat
USVs ketakutan terkait , yang hampir benar-benar ditekan pada tikus Sal - Sap .
The USVs 22 - kHz adalah bagian dari tikus repertoar defensif dan dipancarkan
dalam menanggapi pengalaman negatif , seperti kaki -shock , kehadiran predator
atau kebisingan paparan mengejutkan [ 30-32 ] . USVs ini terkait erat dengan
respon pembekuan ancaman aktual atau potensial dan bisa berfungsi sebagai "

28

panggilan alarm " untuk conspecificity . Ada bukti bahwa konvergen lesi Sap
selektif mengganggu fungsi sistem saraf yang mengatur USVs [ 38,40,43 ] .
Secara keseluruhan , data kami berada dalam perjanjian dengan pemisahan
dijelaskan sebelumnya antara respon beku utuh dan gangguan produksi USV pada
tikus cholinergically habis [ 38 ] . Menariknya , pra - perlakuan ( kelompok Don Sap ) donepezil muncul untuk mengurangi USV penindasan tikus lesi selama
pelatihan FC . Dengan demikian , data kami menguatkan nilai tambah pengukuran
USV , yang menyediakan informasi tambahan tentang keadaan emosional hewan
dalam situasi menghadapi rangsangan permusuhan tak terhindarkan .

Juga , interaksi sosial dan pengakuan conspecificity merupakan komponen

fundamental dan adaptif dari repertoar perilaku banyak spesies . Demikian pula
untuk transmisi sosial dari preferensi makanan , memori pengakuan sosial , yang
bergantung pada aktivasi fungsional hippocampal dan prelimbic sirkuit korteks
[ 50 ] , terganggu pada fase awal AD . Uji klinis telah menunjukkan bahwa
donepezil meningkatkan interaksi sosial AD pasien , keterlibatan dan bunga
[ 51 ] . Pada dasar tersebut , dalam penelitian ini, kami meneliti untuk pertama
kalinya Donepezil efek pre-treatment pada keterampilan sosial menggunakan uji
tiga ruang . Selama tes sosialisasi, semua hewan menunjukkan motivasi sosial
yang jelas . Bahkan , semua dari mereka lebih memilih orang asing sejenis ,
karena mereka menghabiskan lebih banyak waktu dan melakukan perjalanan jarak
yang lebih jauh dalam ruang yang berisi stimulus sosial . Hasil ini sesuai dengan
yang diperoleh dalam tes sosialisasi dijelaskan oleh Riedel et al . [ 50 ] , tetapi
mereka tampaknya berada dalam perselisihan dengan yang diperoleh oleh Savage
et al . [ 47 ] . Atas dasar penggunaan tes interaksi sosial , para penulis ini
melaporkan penurunan yang signifikan dalam interaksi aktif mengikuti penurunan
kolinergik selektif neokorteks pada tikus . Khususnya , berbeda dengan tes
interaksi sosial , sosialisasi tidak memungkinkan kontak langsung dengan orang
asing sosial . Dengan demikian , dalam penelitian ini , interaksi sosial tidak

29

langsung dan arti-penting langka dari kompartemen kosong menampilkan

sosialisasi tampaknya telah memfasilitasi eksplorasi asing dengan tikus lesi .

Selama PSNT , meskipun tikus sham menunjukkan preferensi yang jelas untuk
orang asing baru , hewan cholinergically habis tidak menunjukkan kebaruan sosial
terbuka . Hasil ini harus ditafsirkan sebagai defisit memori pengakuan sosial
tertentu ( seperti yang dijelaskan oleh Riedel et al . [ 50 ] ) , karena OF tikus lesi
tidak mengenali objek baru , yang sejalan dengan temuan yang dilaporkan oleh
Savage et al . [ 47 ] . Meskipun Riedel et al . [ 50 ] melaporkan bahwa pemberian
donepezil berhasil menyelamatkan memori sosial defisit skopolamin diinduksi ,
pra-perawatan donepezil gagal mencegah defisit PSNT pada tikus lesi dalam
penelitian kami ini . Hasil yang berbeda dapat dijelaskan oleh perbedaan
metodologis , seperti waktu perawatan ( akut vs pre - treatment) , protokol
perilaku ( jangka pendek vs memori jangka panjang ) dan manipulasi kolinergik
( skopolamin vs Sap ) . Khususnya , hippocampal dan neokorteks deafferentation
kolinergik oleh Sap menyebabkan disregulasi besar sistem neurotransmitter lain,
seperti dopaminergik dan glutamatergic yang , yang dikenal untuk berkontribusi
terhadap diskriminasi sosial [ 46,52,53 ] .

Penelitian kami saat ini menunjukkan bahwa pra - pengobatan donepezil mampu
mengurangi hippocampal dan neokorteks caspase - 3 kegiatan , sehingga
mencegah degenerasi neuron , dan untuk memberi efek menguntungkan pada
defisit perilaku spesifik yang disebabkan oleh deplesi kolinergik . Seperti yang
ditunjukkan dalam studi sebelumnya , efek saraf donepezil mungkin dimediasi
oleh banyak mekanisme perlindungan , seperti nAChR upregulation dan aktivasi
dari jalur nAChR/PI3K [ 8,15,17 ] dan reseptor 1 / PLC / PKC jalur [ 12,13 ] .
Efek seperti berakibat pada pengurangan neurotoksisitas terkait dengan NMDA
Ca2 reseptor - dimediasi + masuknya , stres oksidatif dan caspase - 3 aktivitas
[ 14,15 ] . Selanjutnya , donepezil memberikan sebuah tindakan protektif terhadap

30

toksisitas AA [ 7 ] . Bahkan , pada pasien AD , AA plak colocalize dengan

nAChRs dan 4 dan ekspresi nAChR 7 berkurang . Di CA1 , aktivasi 4 nAChR menyebabkan asam - aminobutyric ( GABA ) rilis dari interneuron yang
menghambat neuron piramidal , sedangkan aktivasi nAChRs 7 di piramida hasil
neuron di Ca2 + masuknya , pelepasan neurotransmitter presynaptic dan
postsynaptic depolarisasi [ 7 ] . Dengan demikian , AA mengganggu aktivitas
nAChR , dan akibat peningkatan glutamat dan penurunan GABA menginduksi
excitotoxicity glutamat dan eksitasi - inhibisi ketidakseimbangan , mengubah finetuning dari hippocampal menembak [ 6 ] . Pada pasien AD , peningkatan aktivitas
caspase-3 telah dilaporkan dalam hippocampus dan kepadatan postsynaptic
neokorteks fraksi [ 54 ] . Juga , dalam model tikus AD Tg2576 , peningkatan
caspase - 3 di kompartemen postsynaptic hippocampal menyebabkan perubahan
plastisitas sinaptik dan kehilangan tulang belakang dendritik . Secara paralel ,
penipisan kolinergik Sap -induced meniru gangguan AA mungkin menyebabkan
perubahan keseimbangan eksitasi - hambatan dan menghasilkan kerusakan
excitotoxic di hipokampus dan neuron neokorteks , yang menumpuk aktif caspase
- 3 . Pada dasar tersebut , pertanyaannya adalah : Bagaimana Donepezil pelindung
saraf akan diberikan ? Dengan menghambat aktivitas AChE , dengan Donepezil
pra-perawatan

bisa

mengurangi

perubahan

GABAergic

dan

mencegah

glutamatergic excitotoxicity dan ketidakseimbangan eksitasi - inhibisi . Dengan

cara ini , caspase - 3 akumulasi akan menurun , memberikan kontribusi untuk
pemeliharaan fungsi hipokampus dan neokorteks .

Kesimpulan
Hasil ini menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa Donepezil sebelum
pengobatan dapat memperlambat defisit memori yang disebabkan oleh penurunan
kolinergik dan untuk mengurangi caspase- 3 akumulasi di daerah hipokampus dan
neokorteks . Meskipun penelitian lebih lanjut memperdalam pemahaman tentang
mekanisme molekuler aksi saraf donepezil diperlukan , hasil ini menjanjikan dan

31

dapat menyebabkan pengembangan strategi baru untuk pencegahan dan terapi

penyakit neurodegenerative .

Singkatan
Ach : Asetilkolin ; AChE - I: inhibitor Acetylcholinesterase ; AD : penyakit
Alzheimer ; ANOVA : Analisis varian ; AP : anteroposterior ; AA : Amyloid ;
Chat: asetiltransferase Kolin ; Don- Sap : imunoglobulin G saporin - lesi tikus
Donepezil diobati ; Don- Sham : Donepezil - diperlakukan tikus sham - lesi ; DV :
dorsoventral ; EPM : Peningkatan ditambah labirin ; FC : AC Takut ; MCI :
gangguan kognitif ringan ; ML : mediolateral ; MS : septum medial ; nAChR :
reseptor asetilkolin nikotinat ; NBM : Nucleus basalis magnocellularis ; DARI :
Buka lapangan dengan benda ; PBS : Fosfat - buffered saline ; PI3K :
Phosphatidylinositol 3 - kinase ; PKC : Protein kinase C ; PLC : Phospholipase
C ; PSNT : Preferensi untuk uji kebaruan sosial; RAM : lengan Radial labirin ; Sal
- Sap : Saline diobati imunoglobulin G tikus saporin - lesi ; Sal - Sham : Saline diperlakukan tikus sham - lesi ; Sap : 192 imunoglobulin G saporin ; STZ :
Streptozotocin ; USV : Ultrasonic vokalisasi .

Bersaing kepentingan
Para penulis tidak memiliki konflik kepentingan untuk menyatakan .

Penulis Kontribusi
DC , LP dan MDA memberikan kontribusi besar untuk konsepsi dan desain
penelitian. PDB dilakukan lesioning immunotoxic dan analisis histologis . DC ,
PC dan AMT memperlakukan hewan dan melakukan evaluasi perilaku . DO
kontribusi untuk akuisisi dan analisis data USV . AN biokimia dilakukan analisis .
DC dan AN melakukan analisis statistik . DC , LP , MDA dan FDA terlibat dalam

32

penyusunan naskah dan merevisi secara kritis untuk konten intelektual penting .
Semua penulis memberikan kontribusi terhadap interpretasi data dan memberikan
persetujuan akhir mereka versi naskah yang akan diterbitkan .

Ucapan Terima Kasih

Donepezil adalah hadiah yang murah hati dari Pfizer , Inc Penelitian ini didukung
oleh menteri pendidikan Italia , Universitas dan hibah Penelitian ( LP dan MDA ) .
MDA secara finansial didukung oleh hibah dari Asosiasi Alzheimer ( NIRG - 11204588 ) .

References
1. Bartus RT, Dean RL 3rd, Beer B, Lippa AS: The cholinergic hypothesis of
geriatric memory dysfunction.

Science 1982, 217:408-414.

2. Bartus RT: On neurodegenerative diseases, models, and treatment

strategies: lessons learned and lessons forgotten a generation following
the cholinergic hypothesis.

Exp Neurol 2000, 163:495-529.

3. Sarter M, Bruno JP: Developmental origins of the age-related decline in

cortical cholinergic function and associated cognitive abilities.

Neurobiol Aging 2004, 25:1127-1139.

4. Galimberti D, Scarpini E: Treatment of Alzheimers disease: symptomatic and

disease-modifying approaches.

Curr Aging Sci 2010, 3:46-56.

33

5. Schwarz S, Froelich L, Burns A: Pharmacological treatment of dementia.

Curr Opin Psychiatry 2012, 25:542-550.

6. DAmelio M, Rossini PM: Brain excitability and connectivity of neuronal

assemblies in Alzheimers disease: from animal models to human
findings.

Prog Neurobiol 2012, 99:42-60.

7. Pepeu G, Giovannini MG: Cholinesterase inhibitors and beyond.

Curr Alzheimer Res 2009, 6:86-96.

8. Akaike A, Takada-Takatori Y, Kume T, Izumi Y: Mechanisms of neuroprotective

effects of nicotine and acetylcholinesterase inhibitors: role of 4 and 7
receptors in neuroprotection.

J Mol Neurosci 2010, 40:211-216.

9. Akasofu S, Kimura M, Kosasa T, Sawada K, Ogura H: Study of neuroprotection of

donepezil, a therapy for Alzheimers disease.

Chem Biol Interact 2008, 175:222-226.

10. Arias E, Als E, Gabilan NH, Cano-Abad MF, Villarroya M, Garca AG, Lpez
MG:Galantamine prevents apoptosis induced by -amyloid and
thapsigargin: involvement of nicotinic acetylcholine receptors.

Neuropharmacology 2004, 46:103-114.

11. Geerts H: Indicators of neuroprotection with galantamine.

Brain Res Bull 2005, 64:519-524.

34

12. Meunier J, Ieni J, Maurice T: Antiamnesic and neuroprotective effects of

donepezil against learning impairments induced in mice by exposure to
carbon monoxide gas.

J Pharmacol Exp Ther 2006, 317:1307-1319.

13. Meunier J, Ieni J, Maurice T: The anti-amnesic and neuroprotective effects of

donepezil against amyloid 25-35 peptide-induced toxicity in mice involve
an interaction with the 1 recepto.

Br J Pharmacol 2006, 149:998-1012.

14. Saxena G, Patro IK, Nath C: ICV STZ induced impairment in memory and
neuronal mitochondrial function: a protective role of nicotinic receptor.

Behav Brain Res 2011, 224:50-57.

15. Shen H, Kihara T, Hongo H, Wu X, Kem WR, Shimohama S, Akaike A, Niidome T,

Sugimoto H: Neuroprotection by donepezil against glutamate
excitotoxicity involves stimulation of 7 nicotinic receptors and
internalization of NMDA receptors.

Br J Pharmacol 2010, 161:127-139.

16. Takada Y, Yonezawa A, Kume T, Katsuki H, Kaneko S, Sugimoto H, Akaike

A: Nicotinic acetylcholine receptor-mediated neuroprotection by
donepezil against glutamate neuroto xicity in rat cortical neurons.

J Pharmacol Exp Ther 2003, 306:772-777.

17. Takada-Takatori Y, Kume T, Izumi Y, Ohgi Y, Niidome T, Fujii T, Sugimoto H, Akaike

A:Roles of nicotinic receptors in acetylcholinesterase inhibitor-induced
neuroprotection and nicotinic receptor up-regulation.

Biol Pharm Bull 2009, 32:318-324.

35

18. Wang R, Tang XC: Neuroprotective effects of huperzine A: a natural

cholinesterase inhibitor for the treatment of Alzheimers disease.

Neurosignals 2005, 14:71-82.

19. Barnes CA, Meltzer J, Houston F, Orr G, McGann K, Wenk GL: Chronic treatment
of old rats with donepezil or galantamine: effects on memory,
hippocampal plasticity and nicotinic receptors.

Neuroscience 2000, 99:17-23.

20. Cutuli D, Foti F, Mandolesi L, De Bartolo P, Gelfo F, Federico F, Petrosini

L: Cognitive performances of cholinergically depleted rats following
chronic donepezil administration.

J Alzheimers Dis 2009, 17:161-176.

21. Dong H, Csernansky CA, Martin MV, Bertchume A, Vallera D, Csernansky

JG:Acetylcholinesterase inhibitors ameliorate behavioral deficits in the
Tg2576 mouse model of Alzheimers disease.

Psychopharmacology (Berl) 2005, 181:145-152.

22. Hernandez CM, Gearhart DA, Parikh V, Hohnadel EJ, Davis LW, Middlemore ML,
Warsi SP, Waller JL, Terry AV Jr: Comparison of galantamine and donepezil for
effects on nerve growth factor, cholinergic markers, and memory
performance in aged rats.

J Pharmacol Exp Ther 2006, 316:679-694.

23. Marighetto A, Valerio S, Desmedt A, Philippin JN, Trocm-Thibierge C, Morain

P:Comparative effects of the 7 nicotinic partial agonist, S 24795, and
the cholinesterase inhibitor, donepezil, against aging-related deficits in
declarative and working memory in mice.

Psychopharmacol (Berl) 2008, 197:499-508.

36

24. Sonkusare S, Srinivasan K, Kaul C, Ramarao P: Effect of donepezil and

lercanidipine on memory impairment induced by intracerebroventricular
streptozotocin in rats.

Life Sci 2005, 77:1-14.

25. Yamada K, Takayanagi M, Kamei H, Nagai T, Dohniwa M, Kobayashi K, Yoshida S,

Ohhara T, Takuma K, Nabeshima T: Effects of memantine and donepezil on
amyloid -induced memory impairment in a delayed-matching to position
task in rats.

Behav Brain Res 2005, 162:191-199.

26. Kamat PK, Tota S, Shukla R, Ali S, Najmi AK, Nath C: Mitochondrial dysfunction:
a crucial event in okadaic acid (ICV) induced memory impairment and
apoptotic cell death in rat brain.

Pharmacol Biochem Behav 2011, 100:311-319.

27. Su D, Zhao Y, Wang B, Xu H, Li W, Chen J, Wang X: Isoflurane-induced spatial

memory impairment in mice is prevented by the acetylcholinesterase
inhibitor donepezil.

PLoS One 2011, 6:e27632.

28. Waite JJ, Chen AD: Differential changes in rat cholinergic parameters
subsequent to immunotoxic lesion of the basal forebrain nuclei.

Brain Res 2001, 918:113-120.

29. Petrosini L, De Bartolo P, Cutuli D: Neurotoxic effects, mechanisms and

outcome of 192-IgG-saporin. In Handbook of Neurotoxicity. Edited by
Kostrzewa RM. New York: Springer-Verlag; 2013.

in press. ISBN: 978-1-4614-5835-7

37

30. Brudzynski SM: Communication of adult rats by ultrasonic vocalization:

biological, sociobiological, and neuroscience approaches.

ILAR J 2009, 50:43-50.

31. Brudzynski SM, Holland G: Acoustic characteristics of air puff-induced 22kHz alarm calls in direct recordings.

Neurosci Biobehav Rev 2005, 29:1169-1180.

32. Whr M, Borta A, Schwarting RK: Overt behavior and ultrasonic vocalization
in a fear conditioning paradigm: a doseresponse study in the rat.

Neurobiol Learn Mem 2005, 84:228-240.

33. Cavallucci V, Berretta N, Nobili A, Nistic R, Mercuri NB, DAmelio M: Calcineurin

inhibition rescues early synaptic plasticity deficits in a mouse model of
Alzheimers disease.

Neuromolecular Med 2013, 15:541-548.

34. Coleman PD, Yao PJ: Synaptic slaughter in Alzheimers disease.

Neurobiol Aging 2003, 24:1023-1027.

35. DAmelio M, Cavallucci V, Middei S, Marchetti C, Pacioni S, Ferri A, Diamantini A,

De Zio D, Carrara P, Battistini L, Moreno S, Bacci A, Ammassari-Teule M, Marie H,
Cecconi F:Caspase-3 triggers early synaptic dysfunction in a mouse model
of Alzheimers disease.

Nat Neurosci 2011, 14:69-76.

36. DAmelio M, Sheng M, Cecconi F: Caspase-3 in the central nervous system:

beyond apoptosis.

Trends Neurosci 2012, 35:700-709.

38

37. Paxinos G, Watson C: The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4th edition. San
Diego, CA: Academic Press; 1998.

38. Frick KM, Kim JJ, Baxter MG: Effects of complete immunotoxin lesions of the
cholinergic basal forebrain on fear conditioning and spatial learning.

Hippocampus 2004, 14:244-254.

39. Save E, Poucet B, Foreman N, Buhot MC: Object exploration and reactions to
spatial and nonspatial changes in hooded rats following damage to
parietal cortex or hippocampal formation.

Behav Neurosci 1992, 106:447-456.

40. Ricceri L, Cutuli D, Venerosi A, Scattoni ML, Calamandrei G: Neonatal basal

forebrain cholinergic hypofunction affects ultrasonic vocalizations and
fear conditioning responses in preweaning rats.

Behav Brain Res 2007, 183:111-117.

41. Cutuli D, Foti F, Mandolesi L, De Bartolo P, Gelfo F, Federico F, Petrosini

L: Cognitive performance of healthy young rats following chronic
donepezil administration.

Psychopharmacology (Berl) 2008, 197:661-673.

42. De Bartolo P, Cutuli D, Ricceri L, Gelfo F, Foti F, Laricchiuta D, Scattoni ML,

Calamandrei G, Petrosini L: Does age matter? Behavioral and neuroanatomical effects of neonatal and adult basal forebrain cholinergic
lesions.

J Alzheimers Dis 2010, 20:207-227.

43. Ricceri L: Behavioral patterns under cholinergic control during

development: lessons learned from the selective immunotoxin 192 IgG
saporin.

39

Neurosci Biobehav Rev 2003, 27:377-384.

44. Knox D, Berntson GG: Effect of nucleus basalis magnocellularis cholinergic

lesions on fear-like and anxiety-like behavior.

Behav Neurosci 2006, 120:307-312.

45. Bontempi B, Whelan KT, Risbrough VB, Lloyd GK, Menzaghi F: Cognitive
enhancing properties and tolerability of cholinergic agents in mice: a
comparative study of nicotine, donepezil, and SIB-1553A, a subtypeselective ligand for nicotinic acetylcholine receptors.

Neuropsychopharmacology 2003, 28:1235-1246.

46. Ogura H, Kosasa T, Kuriya Y, Yamanishi Y: Donepezil, a centrally acting

acetylcholinesterase inhibitor, alleviates learning deficits in
hypocholinergic models in rats.

Methods Find Exp Clin Pharmacol 2000, 22:89-95.

47. Savage S, Kehr J, Olson L, Mattsson A: Impaired social interaction and

enhanced sensitivity to phencyclidine-induced deficits in novel object
recognition in rats with cortical cholinergic denervation.

Neuroscience 2011, 195:60-69.

48. Buhot MC, Rage P, Segu L: Changes in exploratory behaviour of hamsters

following treatment with 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin.

Behav Brain Res 1989, 35:163-179.

49. Bussey TJ, Saksida LM: Object memory and perception in the medial
temporal lobe: an alternative approach.

Curr Opin Neurobiol 2005, 15:730-737.

40

50. Riedel G, Kang SH, Choi DY, Platt B: Scopolamine-induced deficits in social
memory in mice: reversal by donepezil.

Behav Brain Res 2009, 204:217-225.

51. Rockwood K, Graham JE, Fay S, ACADIE Investigators: Goal setting and
attainment in Alzheimers disease patients treated with donepezil.

J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002, 73:500-507.

52. Mattsson A, Lindqvist E, Ogren SO, Olson L: Increased phencyclidine-induced

hyperactivity following cortical cholinergic denervation.

Neuroreport 2005, 16:1815-1819.

53. Mattsson A, Olson L, Svensson TH, Schilstrm B: Cortical cholinergic deficiency

enhances amphetamine-induced dopamine release in the accumbens but
not striatum.

Exp Neurol 2007, 208:73-79.

54. Louneva N, Cohen JW, Han LY, Talbot K, Wilson RS, Bennett DA, Trojanowski JQ,
Arnold SE:Caspase-3 is enriched in postsynaptic densities and increased in
Alzheimers disease.

Am J Pathol 2008, 173:1488-1495.