Anda di halaman 1dari 7

AKTIVITAS ANTIBAKTERI FUNGI ENDOFIT Thievalia polygonoperda, ISOLAT DARI

TUMBUHAN AKAR KUNING (Fibraurea chloroleuca Miers)


ANTIBACTERIAL ACTIVITY PRODUCED BY Thievalia polygonoperda, AN
ENDOPHYTIC FUNGI FROM AKAR KUNING (Fibraurea chloroleuca, Miers)
Widyati Prihatiningtias 1, S.M. Widyastuti2, Subagus Wahyuono3
Fakultas Farmasi UGM1, Fakultas Kehutanan UGM2, Fakultas Farmasi UGM3
INTISARI
Thievalia polygonoperda merupakan fungi endofit yang diisolasi dari tumbuhan akar kuning dari
Hutan Baka, Kalimantan Tengah. Tumbuhan akar kuning ini merupakan tumbuhan obat yang sudah
digunakan secara tradisional oleh masyarakat sekitar Bukit Bakauntuk mengobati penyakit kuning dan
penyakit mata. Seperti tumbuhan inangnya, T. polygonoperda juga mampu menghasilkan senyawa
antibakteri yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri Shigella dysentri dan Micrococcus luteus.
Tujuan penelitian ini adalah untuk memperoleh senyawa bioaktif dari fungi endofit T.
polygonoperda dan mengetahui aktivitas antibakterinya. Produksi senyawa antibakteri ini dapat
diperbanyak melalui proses fermentasi. Pada akhir proses fermentasi, media fermentasi diekstrak dengan
etil asetat untuk menghasilkan ekstrak etil asetat. Hasil uji bakteri dengan metode difusi menunjukkan
bahwa pada konsentrasi ekstrak 100, 200, dan 300 g/disk mampu menghambat pertumbuhan Micrococcus
luteus dan Shigella dysentri.
Hasil bioautografi menunjukkan bahwa senyawa aktif ekstrak etil asetat T. polygonoperda
memiliki Rf. 0,35, identifikasi dengan pereaksi Serium (IV) sulfat, Vanilin-H2SO4, dan Lieberman
Burchard mengarah pada golongan terpenoid. GC-MS menunjukkan bahwa kemurnian senyawa tersebut
adalah 76%, memiliki berat molekul m/z 578.
Kata kunci : Thievalia polygonoperda, endophytic fungi, antibakteri, akar kuning

ABSTRACT
Thievalia polygonoperda is an endophytic fungi obtained from akar kuning plant. T.
polygonoperda produces antibacterial compound. The antibacterial compounds, inhibited the growth of M.
luteus and S. dysentri. This study was aimed to obtain bioactive compounds as antibacterial agent,
produced by T. polygonoperda, an endophytic fungi from akar kuning plant, and study its antibacterial
activity.
To producing antibacterial compound in large scale, fermentation process was used. After the end
of fermentation process, fermentation medium was extracted with ethyl acetat to obtained ethyl acetat
extract. This extract was used for antibacterial assay by difussion methode.
On the antibacterial assay results, ethyl acetat extract from fermentation medium of T.
polygonoperda inhibited growth of Micrococcus luteus at concentration 50 g/disk and Shigella dysentri at
concentration 100 g/disk.
On the GC-MS result, demonstrated that the active compound appeared as a major peak (76%)
having molecular weight at m/z 578 , and it was identified as a terpenoid compound based on TLC
visualized by specific reagents.
Key words : Thievalia polygonoperda, endophytic fungi, antibacterial agent, akar kuning plant

PENDAHULUAN
Fungi endofit merupakan fungi yang
hidup di dalam jaringan tumbuhan tanpa
menimbulkan gejala penyakit pada tumbuhan
inangnya. Fungi endofit mampu menghasilkan
senyawa-senyawa bioaktif misalnya senyawa
antibakteri, antifungi, antivirus, antikanker,
antimalaria dan sebagainya (Strobel, 2003).
Sebagai contoh adalah fungi endofit
Taxomyces
andreanae
yang
mampu
menghasilkan senyawa antikanker, yaitu taxol.
Senyawa ini ternyata juga dihasilkan oleh
tumbuhan inangnya yaitu Taxus brevifolia.
Fungi endofit mampu menghasilkan senyawa
yang sama dengan senyawa yang dihasilkan
oleh tumbuhan inangnya, namun hal ini jarang
terjadi. Senyawa yang dihasilkan fungi endofit
umumnya berbeda dengan senyawa yang
dihasilkan oleh tumbuhan inangnya (Strobel
2004).
Fungi endofit menghasilkan berbagai
senyawa yang memiliki aktivitas biologi,
diantaranya alkaloid, terpenoid, fenolik, dan
sebagainya (Tan, 2001). Fungi endofit yang
tumbuh pada jaringan tumbuhan obat, juga
dapat menghasilkan senyawa yang memiliki
khasiat sama dengan tumbuhan inangnya,
walaupun jenis senyawanya berbeda. Bahkan,
senyawa yang dihasilkan fungi endofit
seringkali memiliki aktivitas yang lebih besar
dibandingkan
aktivitas
senyawa
dari
tumbuhan inangnya (Prihatiningtias, 2005).
Fungi T. polygonoperda merupakan
fungi endofit yang diisolasi dari tumbuhan
akar kuning. Akar kuning merupakan
tumbuhan obat yang telah banyak digunakan
secara tradisional oleh masyarakat sekitar
bukit Baka, Kalimantan Tengah, untuk
mengobati diare, sakit mata, dan penyakit
kuning (Wahyuono et al., 2003). Akar kuning
mampu menghasilkan senyawa antibakteri,
sehingga fungi endofit dari tumbuhan ini juga
memiliki aktivitas yang sama dengan senyawa
dari tumbuhan inangnya (Prihatiningtias,
2005).
T.
polygonoperda
mampu
menghasilkan senyawa bioaktif sebagai
antibakteri. Senyawa bioaktif ini mampu

dihasilkan dalam jumlah besar dengan proses


fermentasi. Setelah fermentasi berakhir, media
fermentasi diekstrak dengan etil asetat untuk
menghasilkan ekstrak. Dari ekstrak yang
mengandung senyawa bioaktif, digunakan
untuk uji antibakteri.
METODOLOGI
Bahan
Fungi endofit, bakteri uji (M. luteus dan S.
dysentri), media fermentasi (sukrosa, 30 g/l,
malt ekstrak 20 g/l, Bacto Pepton 2 g/l, yeast
ekstrak 1 g/l, KCl 0,5g/l, MgSO4. 7H2O 1 g/l,
KH2PO41 g/l, akuades 1000ml), etil asetat.
Alat :
Mikropipet, timbangan elektrik.
Cara Penelitian
1.Fermentasi fungi endofit.
Masing-masing spesies fungi endofit
yang memiliki daya antimikroba difermentasi
dengan shake culture, namun sebelum
dilakukan proses fermentasi terlebih dahulu
dibuat inokulum dari fungi endofit tersebut.
Inokulum fungi endofit sebanyak 50 ml,
diinokulasikan ke dalam 250 ml media M102b.
Dalam media fermentasi fungi endofit
ditambahkan infusa dari daun tumbuhan akar
kuning sebanyak 2,5% ( v/v ). Infusa yang
ditambahkan berasal dari 3 gram daun akar
kuning per 100 ml akuades. Fermentasi
dilakukan selama 18 hari pada suhu kamar.
2. Penentuan Profil Pertumbuhan Fungi
endofit
Selama proses fermentasi, miselia fungi
dipanen setiap 24 jam untuk mendapatkan
profil pertumbuhan fungi endofit. Profil
pertumbuhan fungi endofit dibuat berdasarkan
pertambahan berat sel kering miselia fungi.
Setiap 24 jam, miselia fungi dari kultur fungi
dalam media fermentasi dipanen sebanyak 1
ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung
Eppendorf, selanjutnya disentrifuse dengan
kecepatan 6000 rpm pada suhu kamar selama
10 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang,
sehingga yang tertinggal adalah miselia fungi,
selanjutnya akuades ditambahkan ke dalam

eppendorf yang berisi miselia fungi,


disentrifuse kembali selama 10 menit dengan
kecepatan 6000 rpm pada suhu kamar,
kemudian supernatan (akuades)
kembali
dibuang. Pencucian miselia fungi dengan
akuades dilakukan dua kali ulangan.
Selanjutnya, miselia fungi dioven semalam
pada suhu 100 0C untuk memperoleh berat
kering sel. Penambahan berat kering miselia
selama proses fermentasi menunjukkan
pertumbuhan fungi, sehingga dapat dibuat
profil pertumbuhan fungi endofit. Penambahan
berat kering diplotkan pada sumbu Y,
sedangkan waktu fermentasi diplotkan pada
sumbu X. Dari grafik tersebut dapat diperoleh
profil pertumbuhan fungi.
3. Ekstraksi media fermentasi
Setelah proses fermentasi berakhir,
media fermentasi fungi dipisahkan dari miselia
fungi dengan cara disaring menggunakan
kertas saring. Media fermentasi tersebut
diekstrak sebanyak tiga kali dengan etil asetat.
Media fermentasi dan pelarut yang digunakan
dalam ekstraksi dimasukkan ke dalam corong
pisah, kemudian digojok perlahan selama
kurang lebih 5 menit. Setelah digojok,
campuran media fermentasi dan pelarut
didiamkan beberapa saat untuk memisahkan
bagian media dan pelarut yang telah tercampur
selama proses penggojokan. Setelah dua
bagian tersebut telah terpisah kembali, pelarut
yang mengandung senyawa bioaktif terlarut
dituang ke dalam cawan porselin, selanjutnya
pelarut diuapkan untuk menghasilkan ekstrak.
4. Identifikasi senyawa bioaktif yang
dihasilkan oleh kultur fungi endofit
a. Bioautografi
Untuk menentukan senyawa bioaktif
yang terkandung dalam ekstrak media
fermentasi, dilakukan uji bioautografi dengan
menggunakan metode Rahalison, yaitu
bioautographic overlay assay (Gibbons,
1998).
b. Isolasi senyawa aktif
Hasil
uji
bioautografi
dapat
menunjukkan posisi spot senyawa bioaktif,
sehingga mudah untuk dilakukan isolasi
senyawa murni. Isolasi senyawa bioaktif
dilakukan menggunakan metode KLT
preparatif.

HASIL DAN PEMBAHASAN


Fermentasi fungi T. Polygonoperda
(Gambar 1) dilakukan selama 18 hari. Fungi
tersebut menghasilkan senyawa bioaktif
selama proses fermentasi pada fase stasioner.
Penentuan fase stasioner dilihat pada kurva
pertumbuhan T. Polygonoperda. Profil
pertumbuhan T. polygonoperda menunjukkan
lag phase yang berlangsung sekitar 3 hari,
sedangkan exponential phase berlangsung
selama 7 hari, yang ditandai dengan
meningkatnya berat sel kering fungi. Gambar
2 menunjukkan bahwa setelah mencapai
pertumbuhan yang maksimal pada hari ke-11,
pertumbuhan fungi mulai memasuki stationer
phase yang hanya berlangsung selama dua
hari, yaitu pada hari ke-11 sampai hari ke-12.
Pada hari ke-13 mulai terjadi penurunan
proses pertumbuhan fungi, ditandai dengan
menurunnya biomassa fungi dan akhirnya
memasuki death phase pada hari ke-17.
Terjadinya penurunan biomassa fungi
disebabkan nutrisi yang tersedia telah habis,
dan biomassa fungi yang terbentuk selama
exponential phase mulai terdegradasi (Gambar
2).
Setelah proses fermentasi berakhir,
media fermentasi diekstrak dengan etil asetat
dan diperoleh ekstrak etil asetat.

Gambar 1. Koloni T. polygonoperda

Berat Sel Kering (gram)

0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Waktu (hari)

Gambar 2. Profil pertumbuhan T. polygonoperda pada media M102b .

Tabel 1. Zona hambatan pada bakteri uji dengan empat konsentrasi ekstrak etil asetat dari
polygonoperda.
Bakteri uji

media fermentasi T.

Diameter zona hambatan (mm)


50 g/disk

100 g/disk

200 g/disk

300 g/disk

S. dysentri

1,75

2,08

3,25

M. luteus

9,30

15,12

18,58

22,30

1,00

0,50
0,35

0,35

0,00

(a)
(b)
Gambar 3. (a) Hasil uji bioautografi ekstrak media fermentasi T. polygonoperda pada S. dysentri
(b) Spot yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri S. dysentri dengan nilai Rf 0,35.

Hasil pengujian antibakteri ekstrak


media fermentasi menunjukkan bahwa
pertumbuhan S. dysentri terhambat pada
konsentrasi ekstrak 100 g/disk dengan
diameter hambatan sebesar 1,75 mm, pada
konsentrasi ekstrak 200 g/disk zona
hambatan yang terbentuk sebesar 2,08 mm,
dan pada konsentrasi ekstrak 300 g/disk zona
hambatan yang terbentuk adalah 3,25 mm
(Tabel 1).
Pada bakteri uji M. luteus, makin tinggi
konsentrasi ekstrak, makin besar zona
hambatan yang terbentuk. Pertumbuhan M.
luteus sudah mulai terhambat pada konsentrasi
50 g/disk dengan zona hambatan yang
terbentuk sebesar 9,30 mm, pada konsentrasi
100 g/disk zona yang terbentuk sebesar 15,12
mm. Zona hambatan yang terbentuk pada
konsentrasi 200 g/disk adalah 18,58 mm, dan
pada konsentrasi 300 g/disk, zona yang
terbentuk sebesar 22,30 mm (Tabel 1).
Pada M. luteus, dengan konsentrasi
ekstrak 50 g/disk sudah dapat menghambat
pertumbuhan, namun pada S. dysentri
pertumbuhannya baru dapat dihambat pada
konsentrasi yang lebih besar, yaitu 100
g/disk. Hal ini disebabkan karena M. luteus
merupakan bakteri Gram positif yang
memiliki struktur dinding sel lebih sederhana
dibandingkan dengan struktur dinding sel
bakteri Gram negatif. Struktur yang sederhana
pada Gram positif menyebabkan senyawa
antibakteri mudah masuk ke dalam sel bakteri
dan menyebabkan kerusakan komponen sel,
dan pada kadar senyawa antibakteri yang
relatif kecil, sudah mampu membunuh sel
bakteri (Atlas, 1998).
Untuk melakukan uji bioautografi,
komponen senyawa dalam ekstrak etil asetat
media fermentasi
T. polygonoperda
dipisahkan dengan KLT menggunakan plat
KLT Silica GF 254 menggunakan fase gerak
kloroform-etil asetat (25:2 v/v). Hasil uji
bioautografi (Gambar 3b) menunjukkan
bahwa komponen senyawa dalam ekstrak yang
aktif sebagai antibakteri memiliki nilai Rf
0,35, ditandai dengan terbentuknya zona jernih
yang sangat jelas dan dengan penyemprotan
dengan Serium (IV) Sulfat senyawa tersebut
memberikan warna merah. Kromatogram
menunjukkan bahwa senyawa tersebut

memberikan intensitas warna yang jelas dan


memiliki spot besar (Gambar 3b), sehingga
dapat dikatakan senyawa tersebut merupakan
komponen utama dalam ekstrak etil asetat.
Senyawa aktif yang telah diketahui letak
spotnya pada plat KLT, selanjutnya diisolasi
menggunakan metode KLT preparatif, yang
akan menghasilkan isolat senyawa bioaktif
murni.
Sebelum senyawa bioaktif diidentifikasi,
terlebih
dahulu
dilakukan
identifikasi
golongan senyawa menggunakan pereaksi
semprot
yang
spesifik
(Tabel
2).
Penyemprotan dengan Dragendorf yang
spesifik untuk senyawa alkaloid, memberikan
hasil negatif, dan penyemprotan dengan FeCl3
yang khas untuk senyawa fenol juga
menunjukkan hasil yang negatif, sedangkan
penyemprotan dengan Serium (IV) sulfat yang
merupakan pereaksi semprot untuk senyawa
secara umum, memberikan warna merah.
Penyemprotan
dengan
vanilin-H2SO4
memberikan warna biru kehijauan, dan
penyemprotan
menggunakan
pereaksi
Lieberman Burchard menunjukkan warna
merah muda keunguan (Gambar 4). Pereaksi
semprot vanilin-H2SO4 dan Lieberman
Burchard merupakan pereaksi semprot yang
spesifik untuk senyawa-senyawa golongan
terpenoid,
sehingga
senyawa
bioaktif
diidentifikasi sebagai golongan terpenoid. Hal
ini sesuai dengan hasil penelitian Tan dan Zou
(2001) yang menyatakan bahwa senyawasenyawa terpenoid juga banyak dihasilkan
oleh fungi endofit.
Hasil identifikasi isolat senyawa bioaktif
dengan
spektrofotometri
GC-MS
menunjukkan bahwa senyawa tersebut
memiliki kemurnian 76% dan memiliki berat
molekul m/z 578 hal ini didukung oleh
munculnya dua puncak pada spektrum GC-MS
(Gambar 5), sehingga isolat senyawa yang
secara KLT telah murni, ternyata masih
merupakan campuran dengan senyawa lain.
Munculnya dua puncak pada spektrum GCMS dapat dimungkinkan karena isolat
senyawa bioaktif terurai oleh uap panas dalam
sistem alat GC-MS, sehingga memutus ikatan
yang kurang tahan terhadap panas, dan
memunculkan dua puncak pada detektor.

Tabel 2. Identifikasi senyawa bioaktif dengan berbagai penyemprot spesifik


Penyemprot
Dragendorf
FeCl3
Serium(IV) Sulfat
Vanilin-H2SO4
Liebarman Burchard

Rf

Hasil Penyemprotan
Tidak menghasilkan warna
Tidak menghasilkan warna
Warna merah
Warna hijau
Warna merah keunguan

Keterangan
Menunjukkan bukan senyawa alkaloid
Menunjukkan bukan senyawa fenol
Menunjukkan senyawa bioaktif
Menunjukkan senyawa terpenoid
Menunjukkan senyawa terpenoid

B C

Gambar 4. Penyemprotan dengan berbagai pereaksi semprot yang spesifik


A. Serium (IV) sulfat memberikan warna merah pada senyawa bioaktif ( Rf 0,35)
B. Vanilin-H2SO4 memberikan warna biru kehijauan pada senyawa bioaktif (Rf 0,35)
C. Lieberman Burchard memberikan warna merah keunguan pada senyawa bioaktif (Rf 0,35)
Hasil identifikasi isolat senyawa bioaktif dengan spektrofotometri GC-MS

Gambar 5. Spektrum GC-MS isolat senyawa bioaktif T. polygonoperda

Gambar 6. Spektrum ultraviolet isolat senyawa bioaktif T. polygonoperda dalam kloroform

Gambar 7. Spektrum inframerah (KBr) isolat senyawa bioaktif T. polygonoperda

Hasil spektrum ultraviolet isolat


senyawa bioaktif menunjukkan panjang
gelombang () maksimal pada 260 nm,
sedangkan serapan pada panjang gelombang
241 nm menunjukkan panjang gelombang
kloroform sebagai pelarutnya (gambar 6).
Spektrum
infra
merah
(IR)
menunjukkan bahwa isolat senyawa bioaktif
menunjukkan
adanya
puncak
serapan
karakteristik pada 3348, 2970, 2916, 1743,
1685, 1373, dan 1230 cm-1. Puncak serapan
pada 3348 cm-1 adalah puncak serapan gugus
OH, puncak serapan 2916 cm-1 dan 2970 cm-1
merupakan puncak serapan gugus C-H
alifatik. Adanya gugus C = O ditandai dengan
puncak serapan pada 1685 cm-1 dan1743 cm-1,
sedangkan gugus CH3 memiliki puncak
serapan 1373 cm-1 dan gugus C O C
memiliki puncak serapan pada 1230 cm-1
(Gambar 7)
KESIMPULAN :
Dari hasil-hasil yang telah diperoleh, dapat
diambil kesimpulan sebagai berikut :
1. Konsentrasi ekstrak :
a). 100 g/disk menghambat pertumbuhan
S. dysentri dengan diameter hambatan 1,75
mm.
b). 50 g/disk menghambat pertumbuhan
M. luteus dengan diameter hambatan 9,30
mm.
2.

Identifikasi
senyawa
bioaktif
T.
Polygonoperda adalah golongan terpenoid.

UCAPAN TERIMA KASIH


PT Sari Bumi Kusuma, Kalimantan
Barat atas semua fasilitas yang telah diberikan
untuk pengambilan sampel.
DAFTAR PUSTAKA
Atlas, R.M. 1998. Principles of Microbiology. 2nd
edition. Mc.Grawhill Inc. pp 108-109 .
Gibbon, S and A.I Gray. 1998. Isolation by Planar
Chromatography.
Natural
Product
Isolation. Cannell, RJP (ed). Humana Press,
New Jersey. pp. 240-241.
Prihatiningtias,W. 2005. Senyawa Bioaktif Fungi
Endofit Tumbuhan Akar Kuning (Fibraurea
chloroleuca Miers) Sebagai Agensia
Antimikroba.
Tesis.
Program
Studi
Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana UGM.
Strobel, G.A. 2003. Endophytes as sources of
bioactive products. Review of Microbiology.
pp.11
Strobel, G.A. 2004. Natural Products from
Endophytic Microorganism. J.Nat.Prod.. 67:
257-268.
Tan, R.X., and W.X. Zou. 2001. Endophytes : a
rich source of functional metabolites. Nat.
Prod. Rep. 18: 448-459.
Wahyuono, S., S.M. Widyastuti, dan Soekotjo.
2003. Identifikasi potensi hutan sebagai
sumber
senyawa
bioaktif.
Laporan
Penelitian Dephut-Farmasi UGM.