LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

ANALISIS KANDUNGAN TUMBUHAN OBAT

PRAKTIKUM II
Analisis Flavonoid dari Daun Ketela Pohon
(Manihot utilissima Pohl.)

Disusun oleh :
Golongan II / FBA/ Kelompok 2
1. Desy Widyastuti

FA/08734

2. Amalia Azzahra

FA/08753

Tanggal Praktikum

: Rabu, 24 September 2014

Asisten Jaga

: Fatia, Ihsan

LABORATORIUM KIMIA PRODUK ALAM

BAGIAN BIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2014

PRAKTIKUM II
Analisis Flavonoid dari Daun Ketela Pohon (Manihot utilissima Pohl.)
I.

TUJUAN
Pada akhir praktikum diharapkan mahasiswa dapat memahami dan dapat
melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela pohon berikut analisis kualitatif golongan
senyawa tersebut dengan metode Kromatografi Lapis Tipis.

II. SKEMA KERJA

Serbuk ketela pohon

Maserasi 3x @ 30mL
Filtrat
Diuapkan
Filtrat 10 mL

Filtrat A

Filtrat 10 mL
Fraksi eter

Fraksi air asam

Analisis kualitatif
(KLT)
Filtrat B1

Analisis kualitatif
(KLT)
&
Kuantitatif
(Perhitungan Kadar
Flavonoid Total)

Filtrat B2

Analisis kualitatif
(KLT)

III. HASIL DAN ANALISIS DATA

1. Penimbangan Simplisia = 4,99 gram
2. Volume solven (Metanol)
Maserasi I, II, dan III @ 25 mL
3. Waktu Penyarian
Maserasi I, II dan III @ 10 menit
4. Analisis Kualitatif
a) Sistem KLT I
Fase diam

: Selulosa

Fase gerak

: Asam asetat 15 %

Jarak migrasi : 8 cm
Deteksi

: Sinar tampak, UV 254, UV 366, dan Pereaksi semprot sitroborat

Penotolan

: masing-masing 3 totolan pipa kapiler

Sampel

Rf

Sebelum disemprot
Tampak

Setelah disemprot

UV 254

UV 366

kuning

Kuning

Tampak

Kuning

0,06

0,26

0,53

kuning

hitam

B1

B2

Sinar tampak
sebelum
disemprot

Sinar UV 254
sebelum
disemprot

Berpendar berpendar
kuning

Kuning

Berpendar berpendar

Sinar UV 366
sebelum
disemprot

UV 366

Kuning
pudar

Sinar tampak
setelah
disemprot

berpendar
Kuning
berpendar
hitam

Sinar UV 366
setelah
disemprot

b) Sistem KLT II
Fase diam

: Selulosa

Fase gerak

: n- Butanol:Asam asetat:Air (4:1:5 % v/v; lapisan atas)

Jarak migrasi : 5,3 cm

Deteksi

: Sinar tampak, UV 254, UV 366, dan Pereaksi semprot sitroborat

Penotolan

: masing-masing 3 totolan pipa kapiler

Sampel

Rf

0,19

0,34

Sebelum disemprot
Tampak
-

UV 254
Kuning
berpendar

Kuning

Kuning

pudar

berpendar

Setelah disemprot

UV 366

Tampak

UV 366

Biru

A
0,66

Kuning

muda

pudar

berpendar

Biru muda
Kuning

(tailing)

(tailing)
0,94

Hijau

Kuning

Merah

kecokelatan

tua

Hijau tua

Biru
0,66

B1

muda
berpendar

Hijau

Kuning

Merah

kecokelatan

tua
Biru

0,15

Kuning

muda
berpendar

0,38

Kuning

B2

Hijau tua

Merah tua

Merah

Biru muda

pudar

berpendar

muda

Merah

berpendar

pudar

(tailing)
0,66

Kuning

berpendar
(tailing)

Biru
0,58

Merah tua

Biru muda

(tailing)
0,98

berpendar

Kuning

Biru muda
berpendar
(tailing)
Kuning

berpendar
0,98

Sinar tampak
sebelum
disemprot

Orange

Sinar UV 254
sebelum
disemprot

Merah

Hijau

tua

pudar

Sinar UV 366
sebelum
disemprot

5. Analisis Kuantitatif
a) Pembuatan Kurva Baku
Konsentrasi

Absorbansi

(%)

Tanpa AlCl3

Ditambah AlCl3

0,001

0,165

0,294

0,0008

0,132

0,246

0,0006

0,131

0,207

0,0004

0,120

0,161

0,0002

0,077

0,109

b) Perhitungan Kadar
Sampel

berpendar

Absorbansi
Tanpa AlCl3

Ditambah AlCl3

0,075

0,096

0,076

0,124

0,074

0,100

Sinar tampak
setelah
disemprot

Merah tua

Sinar UV 366
setelah
disemprot

Kadar Flavonoid Total terhadap Pembanding

X(%) =

Cp (Au-Abu)
100
x 1,25 x
(Ap-Abp)
Bobot sampel

Keterangan:
X

= Kadar flavonoid total dihitung sebagai flevonoid pembanding (dalam %)

Cp = Konsentrasi larutan pembanding (yang dipilih konsentrasi 0,001%)

Au = Serapan larutan sampel dengan AlCl3
Abu = Serapan larutan sampel tanpa AlCl3
Ap = Serapan larutan pembanding dengan AlCl3 (0,294)
Abp = Serapan larutan pembanding tanpa AlCl3 (0,165)
1,25 = Faktor konstanta

Kadar A

X(%) =

0,001 (0,096-0,075)
(0,294-0,165)

x 1,25 x

100
4,99

= 4,078.10-3 %

Kadar B

X(%) =

0,001 (0,124-0,076)
(0,294-0,165)

x 1,25 x

100
4,99

= 9,321.10-3 %

Kadar C

X(%) =

0,001 (0,100-0,074)
(0,294-0,165)

x 1,25 x

100
4,99

= 5,049.10-3 %

Rata-Rata Kadar Flavonoid Total terhadap Pembanding

X rata-rata (%) =

IV.

(4,078.10-3 )+ (9,321.10-3 ) + (5,049.10-3 )

3

= 6,149.10-3 %

PEMBAHASAN
Percobaan kali ini bertujuan untuk melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela
pohon berikut analisis kualitatif golongan senyawa tersebut dengan metode
Kromatografi Lapis Tipis.
Rutin merupakan golongan senyawa flavonoid dalam bentuk glikosida dari
kuersetin. Rutin merupakan salah satu metabolit sekunder yang bersifat polar,
termasuk kedalam kelompok glikosida O (molekul gula berikatan dengan O-aglikon).
Sedangkan aglikonnya yaitu kuersetin merupakan senyawa yang tidak larut dalam air

atau bersifat nonpolar. Bentuk glikosidanya maupun bentuk aglikonnya yaitu

kuersetin dapat disari menggunakan pelarut methanol yang merupakan pelarut
spectrum luas. Sedangkan untuk pemisahan aglikon dari glikosidanya dapat dilakukan
dengan hidrolisis asam lemah. Pada praktikum kali ini, simplisia yang digunakan
adalah serbuk daun Ketela pohon (Manihot utilissima Pohl.)
Berikut ini klasifikasi dari Ketela pohon:
Kingdom : Plantae
Divisi

: Spermatophyta

Sub Divisi : Angiospermae

Kelas

: Dicotyledoneae atau biji berkeping dua

Ordo

: Euphorbiales

Famili

: Euphorbiaceae

Genus

: Manihot

Spesies

: Manihot utilissima Pohl. ; Manihot esculenta Crantz sin.

Rutin

Langkah pertama dalam percobaan ini adalah mengisolasi flavonoid dari

simplisia dengan cara maserasi. Maserasi dilakukan dengan menggunakan larutan
methanol. Bentuk aglikon dan glikosidanya dapat disari menggunakan pelarut
methanol karena methanol termasuk penyari yang ideal yang dapat menyari flavonoid
yang berada dalam bentuk glikosida maupun aglikon bebasnya. Penyarian dilakukan
hiingga 3 kali replikasi dengan 10 mL methanol setiap penyarian, sehingga
diharapkan flavonoid yang tersari lebih banyak. Selanjutnya filtrate yang diperoleh
dibagi menjadi dua, masing-masing 5,0 ml. Bagian yang pertama diuapkan hingga
pekat, dan bagian ini (sampel A) akan digunakan untuk analisis aglikon bebas dan
glikosidanya secara kualitatif dengan metode KLT.

Bagian kedua diuapkan hingga kental lalu ditambahkan 5ml HCl 1%.
Penambahan HCl dimaksudkan untuk menghidrolisis glikosida flavonoid. Hal ini
dilakukan untuk memisahkan bentuk aglikon dari glikosidanya. Setelah itu direfluks
selama 1 jam. Hal ini dilakukan untuk menyempurnakan reaksi. Setelah direfluks,
hasil refluks didinginkan dan kemudian ditambahkan 5 mL air kemudian dimasukkan
dalam corong pisah.
Partisi dilakukan dengan menambahkan 10 ml eter pada larutan hasil
hidrolisis. Digojog menggunakan corong pisah, kemudian ambil fase eter-nya lalu
sisihkan. Penggojogan tidak boleh terlalu kuat karena methanol yang masih tersisa
dapat membentuk emulsi dengan eter. Sedangkan fase air nya ditambah eter lagi,
disari lagi hingga diperoleh lagi fase eter dan fase air. Fase eter yang diperoleh
kemudian ditambah Natrium sulfat lalu diuapkan tanpa panas. Kemudian digunakan
sebagai sampel B1, yaitu untuk analisis flavonoid kuersetin. Fase air yang diperoleh
dari partisi tadi diuapkan dengan pemanasan hingga kurang lebih 1 ml. ini digunakan
kemudian untuk analisis senyawa rutin-nya (sebagai sampel B2).
Sampel A, B1, dan B2 dianalisis secara kualitatif menggunakan metode
kromatografi lapis tipis. Masing-masing sampel di elusi dengan dua sistem, sistem
pertama menggunakan fase gerak asam asetat 15%, sedangkan sistem kedua
menggunakan campuran n-butanol asam asetat- air (4:1:5). Sistem satu bersifat
lebih polar karena mengandung air lebih banyak dari sistem dua. Kedua sistem ini
diamati pada sinar tampak, UV 254, UV 366 sebelum disemprot sitroborat dan pada
sinar tampak, UV 366 setelah disemprot sitroborat.
Karena sistem satu bersifat polar, maka sistem ini digunakan untuk
menganalisis rutin yg bersifat polar. Rutin yang polar akan terelusi oleh fase
geraknya, sedangkan senyawa non polar akan tertahan pada fase diam karena
lemahnya interaksi dengan fase geraknya. Pada sampel A terlihat adanya bercak
dengan Rf 0,06; 0,26; dan 0,53 pada UV254 dan UV366 baik sebelum maupun
sesudah disemprot. Sedangkan pada sampel B1 dan B2 tidak ditemukan adanya
bercak baik sebelum maupun sesudah disemprot. Kedua sampel ini tidak terelusi, hal
ini menunjukan bahwa kedua totolan bersifat nonpolar karena tidak terelusi oleh fase
gerak yang bersifat polar. Hasil elusi ini menunjukkan bahwa sampel A diduga
mengandung glikosida rutin. Hal ini dapat terjadi karena pada sampel A merupakan

ekstrak ketela pohon yang tidak mengalami hidrolisis menjadi aglikonnya. Pada
sampel B1 tidak ada bercak elusi yang timbul, hal ini tentu saja terjadi karena sampel
B1 merupakan fraksi eter yang bersifar nonpolar yang akan menyari aglikon
(kuersetin), eter tidak mampu menyari rutin yang bersifat polar. Pada sampel B2 juga
tidak menunjukkan adanya rutin, hal ini menunjukkan bahwa rutin sepenuhnya telah
terhidrolisis menjadi kuersetin. Jika rutin belum terhidrolisis sempurna maka akan
tersari rutin pada fraksi ini.
Sedangkan pada sistem kedua merupakan sistem yang bersifat nonpolar, maka
sistem ini digunakan untuk menganalisis kuersetin yang juga bersifat nonpolar. Pada
sistem ini semua sampel terelusi dengan menghasilkan beberapa bercak. Bercak yang
bersifat polar akan sulit terelusi (Rf kecil) sedangkan senyawa yang bersifat nonpolar
akan mudah terelusi (Rf besar). Pada sampel A ditemukan bercak pada Rf 0,19 dan
0,34 pada sinar tampak dan UV 254 sebelum disemprot. Nilai Rf yang kecil tersebut
menunjukan bahwa senyawa pada sampel A merupakan senyawa polar yang diduga
sebagai rutin. Pada sampel B1 ditemukan bercak pada Rf 0,66 dan 0,98. Rf yang besar
ini menunjukan bahwa senyawa pada sampel B1 merupakan senyawa nonpolar yang
diduga sebagai kuersetin. Hal ini sesuai dengan teori bahwa sampel B1 mengandung
kuersetin karena sampel B1 diberi perlakuan hidrolisis rutin menjadi kuersetin.
Sedangkan pada sampel B2 ditemukan bercak pada Rf 0,15; 0,38 (Rf rendah) dan
pada Rf 0,58; 0,66 ; 0,98 (Rf tinggi). Hal ini menunjukkan adanya senyawa baik polar
maupun nonpolar pada sampel B2. Diduga,bercak pada Rf tinggi merupakan senyawa
kuersetin yang masih tersisa atau belum tersari sempurna oleh adanya eter, sedangkan
bercak pada Rf rendah diduga merupakan senyawa rutin yang belum terhidrolisis
sempurna. Belum dapat dipastikan secara jelas apakah sampel B2 mengandung
senyawa rutin karena pada sistem satu tidak ditemukan adanya bercak elusi.
Dilihat dari warna pada bercak elusi sistem satu dibanding sistem dua, bercak
pada sistem dua akan berwarna lebih terang dibandingkan pada sistem satu. Hal ini
tterjadi karena pada sistem dua, senyawa yang terelusi adalah kuersetin dimana
kuersetin memiliki gugus OH lebih banyak pada struktur flavonoid utamanya. Pada
sistem satu, salah satu OH pada struktur flavonoid terkonjugasi dengan gugus gula.
Gugus OH pada struktur flavonoid berfungsi sebagai ausokrom yang dapat
menguatkan intensitas warna pada suatu senyawa.

Kemudian dilakukan analisis secara kuantitatif dengan menghitung kadar

flavonoid total yang dinyatakan dengan kesetaraan pembanding kuersetin. Pada
analisis ini digunakan sampel B1 karena sampel mengandung rutin yang telah
mengalami hidrolisis menjadi aglikonnya yaitu kuersetin. Dengan terhidrolisisnya
seluruh glikosida menjadi kuersetin dapat menggambarkan flavonoid total yang
berada dalam sampel 4,99 mg daun ketela pohon. Larutan uji B1 dipipet 500 L
ditambah methanol 1,5 mL pada tabung reaksi kemudian ditambahkan dengan 0,1 mL
Na-asetat; 2,8ml air suling, dan AlCl3 10%, kemudian larutan dicampur hingga
homogen dan diinkubasi pada suhu kama selama 30 menit. Inkubasi ini dilakukan
agar kuersetin yang memiliki gugus orto hidroksi karbonil telah bereaksi sempurna
dengan AlCl3. Reaksi ini akan dimaksutkan untuk memberikan perpanjangan serapan
gugus flavonoid. Larutan ini dibuat kembali dengan tanpa penambahan AlCl3.
Kemudian, larutan diukur pada alat spektrofotometer UV-Vis 415 nm. Selain itu juga
dilakukan pembacaan absorban larutan pembanding kuersetin 10 mg/mL yang diberi
perlakuan sama dengan larutan B1. Setelah didapatkan data absorban, maka dilakukan
perhitungan kadar flavonoid total. Dari percobaan isolasi flavonoid dari daun ketela
pohon ini didapatkan kadar flavonoid total 6,149.10-3 %. Nilai ini belum tentu
sepenuhnya benar karena belum dapat dipastikan semua rutin terhidrolisis sempurna
menjadi kuersetin.

V. DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1980, Materia Medika Indonesia, Jilid IV, DepKes RI, Jakarta
Harborne, J.B., 1996, Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan, Penerbit ITB, Bandung
Stahl, E., 1985, Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, ITB, Bandung
Sudarsono, dkk, 1996, Tumbuhan Obat, PPOT-UGM, Yogyakarta
Trease, and Evans, 1978, Pharmacognosy 11th ed., Ballesse Tindall, London