Microbiologia

Tcnicas de Colorao
1) Ziehl-Neelsen
Cobrir a superfcie da lmina com fucsina fenicada e aquecer com lamparina ou bico de Bunsen
at a emisso de vapores (5 minutos)
Lavar com gua
Descorar com soluo lcool-cido
Lavar com gua
Cobrir a superfcie da lmina com azul de metileno (30 segundos)
Lavar com gua
Deixar secar
Observar ao microscpio com objetiva de 100X utilizando leo de imersso
Reagentes:
a) Fucsina Fenicada
- Fucsina Bsica 15g
- Fenol 86mL (Dissolvido em banho-maria)
- lcool Absoluto 150mL
- gua Reagente 1.500mL
OBS: Dissolver a fucsina c/ fenol em um gral, acrescentando o lcool e por fim a gua. Deixar em
repouso por 24 horas e filtrar com papel de filtro. Estocar em frasco escuro.
b) Soluo de lcool-cido
- HCl P.A. 30mL
- lcool 95 GL 970mL
OBS: Acrescentar o HCl sobre o lcool pelas paredes do frasco. Armazenar em frasco escuro.
c) Soluo de Azul de Metileno
- Azul de Metileno 15g
- Fenol Liquido 57mL (Dissolvido em banho-maria)
- lcool Absoluto 100mL
- gua Reagente 1.000mL
OBS: Dissolver o azul de metileno com fenol. Acrescentar o lcool e por fim a gua. Deixar em
repouso por 24 horas. Filtrar com papel de filtro. Guardar em frasco escuro.
2) Gram

Cobrir a lmina com cristal violeta (1 minuto)

Lavar com gua
Cobrir a lmina com lugol (1 minuto)
Lavar com gua
Descorar com soluo de lcool-acetona
Lavar com gua
Cobrir a lmina com fucsina (30 segundos)
Lavar com gua
Deixar secar e observar ao microscpio com objetiva de 100X utilizando leo de imersso.

Reagentes:
a) Cristal Violeta
- Cristal Violeta 4g
- lcool Absoluto 100mL
- Fenol Fundido 10mL
- gua Reagente 890mL
OBS: Colocar o cristal violeta em um gral, misturar o lcool absoluto e em seguida o fenol. Por
fim acrescentar a gua. Deixar em repouso por 24 horas e filtrar com papel de filtro. Armazenar
em frasco escuro.
b) Lugol
- Iodo 4g
- Iodeto de Potssio 6g
- gua Reagente 900mL
OBS: Colocar o Iodo e o Iodeto de Potssio em gral, macerar e adicionar gua.
c) Fucsina
- Idem Fucsina de Ziehl diluda 10X em gua reagente
d) Soluo de lcool-Acetona
- Acetona 250mL
- lcool Absoluto 750mL
Provas Bioqumicas para Gram Negativos
1) EPM Fermentao da Glicose, Urase, Tryptofano, Produo de Gs e H2S
Teste
Glicose
Urase
Tryptofano
Gs
H2S

Positivo
Base Amarela
Base Azul
Superfcie Verde Escura
Presena de Bolhas
Meio Escurecido (Preto)

Negativo
Sem Alterao (Verde)
Sem Alterao (Verde)
Sem Alterao (Verde) ou Azul
Ausncia de Bolhas
Sem Alterao

2) MILI Motilidade, Indol e Lisina

Teste
Motilidade
Indol
Lisina

Positivo
Crescimento em todo o meio (Turvo)
Reagente de Kovaks (Alo Vermelho)
Meio Lils ou Sempre que o meio no estiver
amarelo

Negativo
Crescimento no local de inoculao
Alo Amarelo
Meio Amarelo

3) gar Citrato de Simmons Fonte de Carbono

Quando o teste positivo o meio muda a cor de verde para azul com crescimento na superfcie do
meio.

Algoritmo de Identificao de Bactrias:

Meio

Crescimento

Tipo de Identificao

Testes

Staphylococus

TSA
Staphy Teste (S. aureus)
Novobiocina (S. saprophyticus)

Streptococcus

Bile Esculina (Enterococcus)

Caldo NaCl (Enterococcus)
CAMP (S. agalactiae)
Bacitracina (S. pyogenes)
Optoquina (S. pneumoniae)
Soro Tipagem p/ Strepto

Enterobactrias

Painel (Automatizado)
Provas Bioqumicas

No Fermentadores

Painel (Automatizado)

Enterobactrias

Painel (Automatizado)
Provas Bioqumicas

Gram Positivos
Agar Sangue

Gram Negativos

Mac Conkey

Gram Negativos

TSB

Gram Positivos

Colnias com -Hemlise

Meio para Crescimento ST

Muller-Hinton

Gram + e -

Kirby - Bauer

Antibiograma

EnteroKit B (Probac) EPM / MILI / Citrato

Primeiro Algarismo
Lactose (MC) = 4
Gs (EPM) = 2
H2S (EMP) = 1
Total

Segundo Algarismo
URE (EMP) = 4
LTD (EMP) = 2
MOT (MILI) = 1
Total

Terceiro Algarismo
Indol (MILI) = 4
LIS (MILI) = 2
CIT (Citrato) = 1
Total

OBS: Os valores representados correspondem ao resultado positivo dos testes. Para resultados negativos
considerar o valor 0 (zero). Procurar o resultado na tabela.
Rotinas de Laboratoriais:
1.

2.

3.

Avaliar o crescimento bacteriano nos meios de cultura (AS, MC, ACH) em 24 horas, e caso negativo,
re-incubar por mais 24 horas. Relatar na folha de trabalho (Neg 24) em caso de urocultura.
Crescimento em AS / ACH para Gonococo (Orofaringe)
Gram
(+) ST ou STA + ou - / Catalase (+) STA / (-) ST
o STA Staphy Teste
o ST BE , CHC, CAMP (SV / SP)
(-) Oxidase (+) No Fermentador Painel / (-) Enterobactrias PB ou Painel

5.

Gardnerella 48h
Gonococo Incubar em Jarra CO2

6.

Crescimento em MC / SS (Coprocultura) PB ou Painel

7.

Painel G+ Se cultura automatizada com antibiograma

4.

8.

Antibiograma Manual
Preparao do Inoculo em BHI, TSB ou Salina (Incubar em estufa)
Semear com Swab a suspenso preparada
Aplicar os discos de antibiticos
Incubar o Meio (MH). p/ S. pneumoniae, Haemophilus ou N. gonorrhoeae (Jarra CO2)
Sensvel Alo de inibio grande / Resistente Crescimento

MicroScan / AutoScan (Dade Behringer)

Painel Gram Positivo
1. Observar Crescimento no poo G
2. Observar Reao Positiva para:
PGT Amarelo (+) / Transparente (-)
Pelo menos 3 Carbonos Amarelo ou Laranja (+) / Vermelho (-)
3. Colocar os Reagentes
VP 1 gota VP1 (KOH 40%) e 1 gota VP2 (Alfa Naftol 5%)
NIT 1 gota NIT1 (Ac. Sulfanlico 0,8%) e 1 gota NIT 2 Dimetil-Alfa-Naftilamina)
PYR 2 gotas do Reagente Peptidase ( Temperatura ambiente. Retirar da geladeira 30
minutos antes ser usado).
4. Esperar 20 minutos e Ler o painel
Painel Gram Negativo
1. Observar Crescimento no Poo G
2. Observar o poo GLU (Glicose) (+) Amarelo / Fermentador ; (-) Laranja / No Fermentador
3. Somente para No Fermentadores (Observar)
ARG + (Prpura) e OF/G + (Amarelo) ou
ARG + (Prpura) e CET + (Crescimento) ou
LYS + (Prpura) ou
ORN + (Prpura)
4. Colocar os Reagentes
VP 1 gota VP1 e 1 gota VP2
TDA 1 gota de FeCl3 (Ccloreto Frrico 10%)
IND 3 gotas de Reativo de Kovaks
NIT (Somente para No Fermentadores) 1 gota NIT 1 e 1 gota NIT 2
5. Esperar 20 minutos e Ler o Painel
OBS: Os painis s devem ser lidos se houver crescimento no poo G e reaes descritas pelo menos
uma possibilidade positiva. Caso contrrio re-incubar por mais 24 horas.
Pesquisa para H. pylori Urase

Inocular a amostra (bipsia) em caldo contendo urase (Probac) com ala de platina
Incubar a 35 C
Observar mudana da cor do meio de Laranja para Rosa aps 4 horas
Fazer um esfregao do caldo, corar pelo Gram e observar bacilos Gram Negativos Curvos

OBS: A urase produzida pelo H. pylori alcaliniza o estmago

Micoplasma e Ureaplasma
U. urealyticum Metaboliza Uria
M. hominis Metaboliza Arginina
Observar mudana de colorao do meio de amarelo-laranja para rosa, devido a produo de amnia que
deixa o pH alcalino. Incucar a 37C por 24 horas.
1 Etapa: Triagem Inoculao da amostra em uma tira com 10 poos (4 sees) Mycofast
Poos 1 a 3: Titulao de U.u. entre 103 e 105 ccu/mL
Poos 4 a 6: Resistncia a Antibiticos (U.u e M.h) contra:
o Doxiciclina (D) 8 g/mL
o Roxitromicina (ROX) 4 g/mL
o Ofloxacino (OFX) 4 g/mL
Poos 7 a 9: Identibitico: Resistncia contra:
o Lincomicina (L)
o Sulfametox. + Trimetroprim (SXT)
o Eritromicina (E)
Poo 10: Titulao M.h. 104 ccu/mL
2 Etapa: Titulao:
U.u Lincomicina (3 primeiros poos) Inibio do crescimento de M.h.
M.h. no poo 100, a Eritromicina inibe o crescimento do U.u.
BK (Micobacterium tuberculosis)
Colorao pela tcnica de Z.N.
Micobactrias Bastonetes delgados, ligeiramente curvos, isolados, aos pares ou em grupos, corados de
vermelho (BAAR) e outras bactrias coradas de azul.
Observar 100 campos com objetiva de 100X com leo de imersso
Como relatar o resultado:
(-) No Foram encontrados BAAR em 100 campos de 100X
(+) Menos de 1 BAAR por campo em 100 campos de 100X
(++) 1 a 10 BAAR por campo em 50 campos de 100X
(+++) Mais de 10 por campo em 20 campos de 100X
OBS-1:
1 a 4 BAAR em 100 campos. Contar mais 100 campos. Se permanecer o valor, liberar o resultado como
negativo e solicitar nova amostra. Se persistir, realizar a cultura em Meio LJ (Lowenstein Jensen).
OBS-2:
Para espcimes clnicos provenientes de cavidades fechadas como lquidos orgnicos (Lquor, Sangue,
Liquido Pleural, Medula ssea) no necessrio a utilizao do mtodo de descontaminao (coleta
assptica e coletor estril).
Realizar a concentrao por centrifugao

Descontaminao com Fosfato Tribsico:

Em tubo 15 x 100 mm estril com tampa, adicionar 2mL do material (Parte purulenta do escarro) e juntar
7mL da mistura das solues purificadora e precipitante na proporo 1 parte (Precipitante) + 5 partes
(purificadora). Vedar o tubo e agitar por 2 minutos. Centrifugar a 3.000 RPM por 10 minutos (equilibrar
os tubos na centrfuga). Incubar em estufa bacteriolgica por 8 horas a 37C. Desprezar o sobrenadante
em um bker com hipoclorito 1%. Adicionar 0,2mL (200L) de soluo solvente e Homogeinizar.
Soluo Precipitante
- Cloreto de Clcio P.A. (CaCl2) 7,5g
- gua Reagente 1.500mL
Pesar 7,5g de CaCl2 e dissolver em 500mL de gua reagente em um clice graduado. Transferir o
contedo do clice para um erlemeyer de 3.000mL e completar o volume at 1.500mL. Autoclavar a
121C por 15 minutos. Estocar em geladeira.
Soluo Purificadora
- Hidrxido de Sdio (NaOH) 30g
- Fosfato de Sdio Tribsico (Na3PO4 12H2O) 30g
- gua Reagente 3.000mL
Dissolver aos poucos e transferir para um erlemeyer de 3.000mL e completar o volume. No Autoclavar.
Estocar temperatura ambiente.
Soluo Solvente
- cido Ctrico (C6H8O7 H2O) 15g
- Citrato de Amnio Dibsico ((NH4)2C6H6O7)N- 12,5g
- gua reagente 500mL
Dissolver aos poucos e completar o volume para 500mL em clice graduado. Distribuir 4mL em tubo
16 x 150 mm. Autoclavar a 121C por 35 minutos. Estocar em geladeira.
Cultura
Colocar 100L do espcime tratado ou no, com pipeta em tubos contendo o Meio LJ (Semear 2 tubos
para cada paciente). Inclinar os tubos de modo que o inculo cubra toda a superfcie do meio. Coloca-los
em caixas e incubar a 37C em estufa bacteriolgica.
1 Verificao aps 48 horas: secagem do inoculo e presena de contaminao:
Aps esta etapa, fechar os tubos queimando a parte externa do capucho e vedar com rolhas de cortia.
Incubar a 37C por 45 dias fazendo leituras semanais para observar crescimento.
Identificao:
1. Tempo de crescimento (Primeiras colnias aparecem com 15 dias)
2. Caractersticas da Colnia
3. Produo de Pigmento
4. Teste da Niacina (Fita)
5. Teste do Nitrato (Fita)
Teste da Niacina
o
Adicionar 1 mL de gua reagente no tubo LJ com 4 semanas de crescimento, fazendo alguns
cortes no meio com auxlio da ala a fim de liberar a niacina
o
Deixar o tubo na horizontal por 10 minutos e transferir 0,6mL (600L) desta soluo para um
tubo com tampa de rosca de 90 x 120 mm. Colocar a fita da niacina na suspenso com a parte

plstica para cima. Agitar suvemente o tubo na vertical por 20 minutos. O aparecimento de
colorao amarela na suspenso indica teste positivo

Teste no Nitrato
o
Preparar uma suspenso com 2 colnias em 0,8mL (800L) de gua reagente. Usar tubos com
tampa de rosca 90 x 120 mm.
o
Introduzir na suspenso a fita de nitrato mantendo a parte plstica para cima.
o
Tampar e incubar 37C / 2 horas na vertical
o
Retirar da estufa e agitar suavemente 6 vezes permitindo que a soluo cubra toda a superfcie
da fita. Uma colorao azul na extremidade da fita indicar resultado positivo.
Antibiograma para BK
Meio LJ + Drogas
Isoniazida (INH) 0,2g/mL 1%
Rifampicina (RNP) 40g/mL 1%
Pirazinamida (PZA) 100g/mL 10%
Estreptomicina (SM) 4g/mL 10%
Etambutol (EMB) 2g/mL 1%
Etinamida( ETH) 20g/mL 10%