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PRCTICA 5

FLAVONOIDES

Prctica #5
DETERMINACIN DE FLAVONOIDES
Cortazar Murillo Elvis Marian
OBJETIVOS
Identificar flavonoides mediante reacciones colorimtricas en flores de algunas plantas.
- Identificacin de un tipo especfico de flavonoide en la flor de Bindes pilosa L. (mozote).
Conocer la funcin de los reactivos a utilizar para la determinacin de flavonoides.
INTRODUCCIN
Los flavonoides fueron descubiertos por el premio nobel Szent-Gyrgi, quien en 1930 aisl de la
cscara de limn una sustancia, la citrina, que regulaba la permeabilidad de los capilares sanguneos.
Los flavonoides se denominaron en un principio vitamina P (por permeabilidad) y tambin vitamina C
(porque se comprob que algunos flavonoides tenan propiedades similares a la vitamina C).
El Dr. Szent-Gyrgi descubri que los flavonoides favorecen la funcin de la vitamina C, mejorando su
absorcin y protegindola de la oxidacin. Los flavonoides comprenden varias clases de sustancias
naturales, entre las cuales estn muchas de las que les confieren color amarillo, naranja, rojo, violeta
y azul, a muchas flores, hojas y frutos, especialmente.
Esta ruta resulta de dos vas biosintticas separadas, la va del cido chiqumico y la va cido
malnico. Puede observarse que de manera general son molculas que tienen dos anillos bencnicos
(o aromticos, para los qumicos orgnicos) unidos a travs de una cadena de tres tomos de
carbono, puesto que cada anillo bencnico tiene 6 tomos de carbono, los autores los denominan
simplemente como compuestos C6C3C6 (figura 1).

Figura 1. Esqueleto bsico de flavonoides. Flavonoles: X=OH; quercitina, R1=OH, R2=H; kamferol, R1=H,
R2=H; myricetina, R1=OH, R2=OH. Flavonas: X=H; apigenina, R1=H, R2=H; luteolina, R1=OH, R2=H (Hertog
et al, 1992).

Basados principalmente en el grado de oxidacin del puente de tres carbonos, los flavonoides son
clasificados en diferentes grupos. El esqueleto de carbono bsico de un flavonoide puede tener
numerosos sustituyentes (tabla 1).

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Tabla 1. Caractersticas de las subclases de flavonoides.

Hasta ahora hemos visto aspectos relacionados con la estructura simple de los flavonoides, sin
embargo dentro de las plantas los estudios han mostrado que estas sustancias se encuentran la
mayora de las veces, ligados a molculas de carbohidratos. A este tipo de combinacin ncleo
flavonoide bsico + una o varias unidades de carbohidratos, se les denomina GLICOSIDOS, y
cuando no tienen ligadas molculas de carbohidratos se las denomina AGLICONAS FLAVONOIDES.
Distribucin y estado natural
Los flavonoides se encuentran ampliamente distribuidos en las plantas verdes (especialmente las
angiospermas), y slo algunos pocos se han detectado en hongos y algas. Se han encontrado en las
diferentes partes de las plantas, especialmente en las partes areas; y se les encuentra en forma libre
(tambin llamados agliconas flavonoides), como glicsidos (la mayora de las veces), como sulfatos y
algunas veces como dmeros y polmeros. Muy pocas veces se encuentran varias clases de
flavonoides en un mismo tejido vegetal, sin embargo de las races de Lonchocarpus subglauscescens
(leguminosas) se aislaron varias flavonas, flavonoles, isoflavonas, rotenoides, chalconas y flavanoles
(Kanda et al, 1995).
Propiedades fsicas
Las propiedades fsicas dependen de la clase de flavonoide considerado y su forma (libre, glicsido o
sulfato). Por ejemplo las flavonas, flavonoles y auronas, debido al sistema conjugado son compuestos
slidos con colores que comprenden desde el amarillo muy tenue hasta el rojo. Las antocianidinas
son de colores rojo intenso, morado, violeta y azul. Las flavanonas y flavanonoles debido al carbono
quiral C-2 presentan el fenmeno de la rotacin ptica. Los glicsidos son en general slidos
amorfos, mientras que las agliconas y los altamente metoxilados son cristalinos. La solubilidad
depende de la forma en que se encuentren y el nmero y clase de sustituyentes presentes. Los
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glicsidos, las antocianidinas y los sulfatos son solubles en agua y alcohol. Las agliconas flavonoides
altamente hidroxiladas son solubles en alcohol (etanol, metanol y n-butanol), mientras que las poco
hidroxiladas lo son en solventes como ter etlico, acetato de etilo y acetona. Las agliconas
flavonoides altamente metoxiladas son solubles en solventes menos polares como el ter de petrleo
y el cloroformo. Los flavonoides con hidroxilos fenlicos son solubles en soluciones alcalinas, pero
algunos altamente hidroxilados se descomponen por accin de las bases fuertes, un hecho que
permite reconocerlos y diferenciarlos de otros, y que hace aos se utiliz para su elucidacin
estructural.
Propiedades de los flavonoides
Los flavonoides contienen en su estructura qumica un nmero variable de grupos hidroxilo fenlicos
y excelentes propiedades de quelacin del hierro y otros metales de transicin, lo que les confiere
una gran capacidad antioxidante (Peres, 1994). Por ello, desempean un papel esencial en la
proteccin frente a los fenmenos de dao oxidativo, y tienen efectos teraputicos en un elevado
nmero de patologas, incluyendo la cardiopata isqumica, la aterosclerosis o el cncer (Jang et al,
1997). Sus propiedades anti-radicales libres se dirigen fundamentalmente hacia los radicales hidroxilo
y superxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de peroxidacin
lipdica y se ha descrito su capacidad de modificar la sntesis de eicosanoides (con respuestas antiprostanoide y anti-inflamatoria), de prevenir la agregacin plaquetaria (efectos antitrombticos) y de
proteger a las lipoprotenas de baja densidad de la oxidacin (prevencin de la placa de ateroma)
(Geleijnse et al, 2002). Adems de sus conocidos efectos antioxidantes, los flavonoides presentan
otras propiedades que incluyen la estimulacin de las comunicaciones a travs de las uniones en
hendidura, el impacto sobre la regulacin del crecimiento celular y la induccin de enzimas de
destoxificacin tales como las monooxigenasas dependientes de citocromo P-450, entre otras (Stahl,
Ale-Agha y Polidori, 2002).
FUNDAMENTO
Ensayos de coloracin
Los flavonoides se pueden reconocer experimentalmente mediante diferentes ensayos de coloracin.
A continuacin se describen un ensayo general de reconocimiento como es el ensayo de Shinoda, y
otros ensayos ms especficos para varias clases de flavonoides.
Ensayo de Shinoda
Los flavonoides con el ncleo benzopirona (p. ej. flavonas, flavonoles, flavanonas, etc.) producen
coloraciones rojizas cuando a sus disoluciones acuosas o alcohlicas se les adiciona magnesio
seguido de HCl concentrado. Aunque no se conoce el mecanismo de esta prueba, es muy utilizada
para reconocer esta clase de compuestos.
Ensayo con Zn/HCl
Al remplazar el Mg por el Zn en el procedimiento del ensayo de Shinoda, solamente los
dihidroflavonoles (o flavononoles) producen coloraciones rojo-violetas. Las flavanonas y flavanoles no
producen color o producen coloraciones rosadas dbiles.
Ensayo de Pacheco

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El slido flavonoide se calienta sobre una llama con unos pocos cristales de AcONa y 0.1 ml de
anhdrido actico. Luego con 0.1 ml de HCl conc. Los dihidroflavonoles producen un color rojo
caracterstico. Las flavonas, chalconas, auronas, flavonoles y flavanonas dan una respuesta negativa.
Ensayo del estroncio-amoniaco
Este ensayo se utiliza para distinguir entre flavonas y flavonoles-3-O-sustitudos 5,6-dihidroxilados y
5-hidroxil-6-metoxilados.
Reconocimiento de antocianinas
Las antocianinas se comportan como indicadores cido-base debido al proceso:
A pH cido presentan coloraciones rojas, violetas y moradas; mientras que a pH alcalino presentan
coloraciones verdes y azules. Con esta prueba se pueden diferenciar entre las antocianinas y las
betacianinas (pigmentos nitrogenados de colores rojos y violeta de plantas del orden Centrosperma,
como p. ej. Los pigmentos de la remolacha Beta vulgaris, Fam. quenopodiceas y tambin presentes
en otras plantas como la Phytolacca americana, Fam. Fitolacceas).
DIAGRAMA DE FLUJO Y RESULTADOS
Ptalos de la flor a estudiar: mozote blanco (Bidens alba L.)
Ptalos + vapores de amoniaco
Compuesto tipo

Rx coloracin

Resultado

Flavonas

Amarillo

Flavonoles

Amarillo

Antocianinas

Rojo intenso

Chalconas

Amarillo-rojo

Aurona

Amarillo-rojo

Obtencin del extracto

Preparacin de la planta en 4 partes


Planta + metanol

Planta + agua

planta + cloroformo

Planta + ter
isoproplico

Calentar a ebullicin. Filtrar


Ensayo de diferentes extractos:
En tubo de ensaye colocar: 3 gotas extracto + viruta Mg + 4 gotas HCl conc.
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Compuesto tipo

Rx coloracin

Resultado
Metan

Agu

Cloro

ter

ol

f.

Flavonas

Naranja

+++

Flavonoides

Rojo

Flavonoles

Rojo azulado

Flavononas

Verde

Flavononoles

Verde azulado

Xantanos

Violeta

En tubo ensaye colocar: 3 gotas extracto + 3 gotas H2SO4


Compuesto tipo

Rx coloracin

Resultado
Meta

Ag

Clor

nol

ua

of.

er

Chalconas

Rojo azulado

Auronas

Rojo-guinda

Flavonas

Amarillo fuerte

Flavononas

Naranja o guinda

+++

Flavonoles

Amarillo fuerte

+
-

En tubo ensaye colocar: 2 gotas extracto + pizca Zn + 4 gotas HCl


Compuesto tipo

conc.
Rx coloracin

Resultado
Metan

Agu

Clor

ter

ol

of.

Leucoantocianidi

Rojo

nas
Catequinas

Caf amarillento

+++: Positivo en su totalidad


++: Positivo
+: Positivo dudoso

OBSERVACIONES
La flor elegida fue mozote blanco (Bidens alba L.); se realiz la molienda no solo de los ptalos sino
del tallo, hojas y estambre. Se ha reportado en lecturas que el mozote contiene un aproximado de 60
flavonoides (Bartolome, Villaseor y Yang, 2013), entre otros metabolitos secundarios; sin embargo
no especifica en qu parte de la planta se encuentran determinados flavonoides. Se hace mencin de
que la mayor cantidad de flavonoides esta en las flores y en las hojas.

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Imagen 1. Mozote blanco

Imagen 2. Ptalo positivo a


vapores de amoniaco: (+) a
flavonas/flavonoles.

Imagen 3. Prueba de Shinoda;


de izq4.aPrueba con H 2SO4; de izq a
Imagen
der: metanol, ter, agua y cloroformo.
(++ ter, agua y cloroformo. (++
der: metanol,
+) a flavonas y (+) a flavononas.
+) a flavononas en metanol; (+) a
flavonas en ter; (++) a flavononas en
agua.

Imagen 5. Negativo a virutas de Zn y HCl

Como se puede observar en los resultados obtenidos, los flavonoides contenidos en la planta mozote
blanco fueron flavonas y flavanonas:

En la reaccin de Shinoda, el magnesio metlico es oxidado por el HCl concentrado, dando como
productos al H2, que es eliminado en forma de gas y el MgCl2, que es el que forma complejos con los
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flavonoides dando coloraciones caractersticas. El magnesio divalente intensifica la coloracin por


estar doblemente coordinado (imagen 3).
La mayora de los flavonoides cumplen con las mismas funciones; la bsqueda de la importancia de
los diferentes flavonoides ha surgido en estos aos.
La solubilidad en metanol puede deberse a la presencia agliconas flavonoides altamente hidroxiladas
(solubles en alcohol), las poco hidroxiladas lo son en solventes como ter etlico; las agliconas
flavonoides altamente metoxiladas son solubles en solventes menos polares como cloroformo.
CONCLUSIONES
Se cumple con el objetivo de la identificar algunos flavonoides presentes en la planta mozote blanco;
para una identificacin ms precisa de los flavonoides, se hubiese descartado los dems rganos de
las plantas y trabajar nicamente con los ptalos. Algunos mecanismos de los reactivos a utilizar no
estn del todo claros; sin embargo la versatilidad de los radicales que tiene la estructura del
flavonoide le permite reaccionar de distinta manera ante las soluciones cidas y bsicas.
ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS
1. Describe la ruta biosinttica de los flavonoides:
Los flavonoides son metabolitos secundarios vegetales de origen biosinttico mixto: el anillo A
proviene de la ruta de la malonilcoenzima A y el anillo B y la cadena C3 provienen de la ruta del
cido shikmico. Un trictido se cicliza y se condensa con una molcula de cido p-cumrico. La
enolizacin del ciclo proveniente de la ruta de la malonilCoA da origen al anillo aromtico A en las
chalconas y flavanonas. Estas a su vez son los precursores de las dems clases de flavonoides.
Es importante recalcar que este proceso de biosntesis sustenta el hecho de que en la mayora de
flavonoides el anillo A sea meta-oxigenado, es decir como es caracterstico de los anillos
aromticos originados por la va de la malonilCoA; y por otro lado, el anillo B proveniente de la
ruta del cido shikmico, generalmente es orto-oxigenado.

(Martnez A, 2005)

2. Cul es la importancia de los flavonoides y sus aplicaciones en la industria farmacutica y de


alimentos?
Los flavonoides contienen en su estructura qumica un nmero variable de grupos hidroxilo
fenlicos y excelentes propiedades de quelacin del hierro y otros metales de transicin, lo
que les confiere una gran capacidad antioxidante. Por ello, desempean un papel esencial en
la proteccin frente a los fenmenos de dao oxidativo, y tienen efectos teraputicos en un
elevado nmero de patologas, incluyendo la cardiopata isqumica, la aterosclerosis o el
cncer. Sus propiedades anti-radicales libres se dirigen fundamentalmente hacia los radicales
hidroxilo y superxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de
peroxidacin lipdica y se ha descrito su capacidad de modificar la sntesis de eicosanoides
(con respuestas anti-prostanoide y anti-inflamatoria), de prevenir la agregacin plaquetaria
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(efectos antitrombticos) y de proteger a las lipoprotenas de baja densidad de la oxidacin


(prevencin de la placa de ateroma).
Funciones de los flavonoides:
protegen contra el cncer,
previenen los ataques cerebrales,
frenan el proceso degenerativo de la arteriosclerosis,
tienen efecto cardioprotector (inhiben la oxidacin de la lipoprotenas y la agregacin
plaquetaria) regulan la presin arterial,
potencian la accin de la vitamina C,
son antiinflamatorios y tienen accin antialrgica,
son diurticos.
Los flavonoides son apropiados como agentes antisolares debido a que tienen una alta
absorbancia UV y a que no son txicos. La mayor parte de la radiacin UV que alcanza la
tierra est entre 320 y 400 nm (UV-A) y aunque la radiacin entre 290-320 nm (UV-B) es
mucho menor, su nivel de energa es mucho mayor y causa quemaduras, daos en las
clulas y cncer de piel. Las flavanonas bloquean la UV-B y las flavonas son filtros
particularmente efectivos para la UV-A. Los steres de flavonoides tienen aplicaciones como
descongestionantes, agentes de tratamiento de piel sensible, agentes de fortalecimiento de
capilares sanguneos y agentes anti envejecimiento. Las esterasas presentes en los tejidos
celulares (particularmente la epidermis), rompen los steres y regeneran los flavonoides
iniciales, lo que permite que tengan su capacidad antioxidante inicial. Esto los hace
especialmente tiles en humectantes y cosmticos.
3. Cul es la caracterstica de los flavonoides, que les hace reaccionar con cidos y bases?
Basados en el grado de oxidacin del puente de tres carbonos, los flavonoides son
clasificados en diferentes grupos. El esqueleto carbono bsico de un flavonol puede tener
numerosos sustituyentes. Las propiedades cido-base muestran que los radicales flavonoides
son neutros en un medio cido (por debajo de pH 3) y con una carga negativa a pH 7. Las
repercusiones de la carga negativa son sumamente importantes en la evaluacin del potencial
antioxidante de los flavonoides. Primero, el radical cargado negativamente no es probable que
pase a travs de la membrana celular con carga negativa. Segundo, la reaccin de los
radicales flavonoides con la vitamina E, que es termodinmicamente factible para algunos
radicales flavonoides, tiene un obstculo adicional a causa de la repulsin electrosttica entre
el anin del radical flavonoide y la membrana fosfolipdica cargada negativamente, donde la
vitamina E se incrusta. Tercero, la oxidacin de un solo electrn de los flavonoides por
cualquier oxidante tendr una barrera entrpica, porque por lo menos dos protones se
intercambian en la reaccin. Los protones pueden intercambiarse entre los reactantes o con el
solvente en el estado de transicin.
4. Si tuviera que purificar flavonoides, qu solventes utilizara y por qu?
La solubilidad depende de la forma en que se encuentren y el nmero y clase de sustituyentes
presentes. Los glicsidos, las antocianidinas y los sulfatos son solubles en agua y alcohol. Las
agliconas flavonoides altamente hidroxiladas son solubles en alcohol (etanol, metanol y nbutanol), mientras que las poco hidroxiladas lo son en solventes como ter etlico, acetato de
etilo y acetona. Las agliconas flavonoides altamente metoxiladas son solubles en solventes
menos polares como el ter de petrleo y el cloroformo. Los flavonoides con hidroxilos
fenlicos son solubles en soluciones alcalinas, pero algunos altamente hidroxilados se
descomponen por accin de las bases fuertes, un hecho que permite reconocerlos y
diferenciarlos de otros.
5. Realizar un cuadro de los resultados obtenidos y concluye interpretndolos.
Revisar resultados y conclusin.
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BIBLIOGRAFA
Bartolome, P., Villaseor, I., Yang, WC. 2013. Bidens pilosa L. (Asteraceae): Botanical Properties,
Traditional Uses, Phytochemistry, and Pharmacology. Evidence-Based Complementary and
Alternative Medicine. ID 340215, 51 pp.
Geleijnse JM, Launer LJ, Van der Kuip DA, Hofman A y Witteman JC.: Inverse association of tea and
flavonoid intakes with incident myocardial infarction: the Rotterdam study. Am J Clin Nutr, 2002,
75:880-886.
Hertog, G.L., Hollmna, C.H., Venema, P. 1992. Optimization of a quantitative HPLC determination of
potentially anticarcinogenic flavonoids in vetetables and fruits.J. Agric. Food Chem. 40:15911598.
Jang M, Cai L, Udeani GO y cols.: Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product
derived from grapes. Science, 1997, 275:218-221
Kanda, N. y col.; J. CHEM. EDUC. 72 (12) 1131 (1995).
Martnez, A. 2005. Flavonoides. Fac. Qumica Farmacutica. Universidad de Antioqua, Medelln.
Peres W: Radicais Livres em nveis biolgicos. Ed. Universidade Catlica de Pelotas, Brasil, 1994,
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Stahl W, Ale-Agha N y Polidori MC: Non-antioxidant properties of carotenoids. Biol Chem, 2002,
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