Anda di halaman 1dari 36

Assalamualaikum wr.

wb

Kami dari kelompok 7:


Nor Haslinda
Oktavia Reni
Rika Puspita
Rismaya Hafsari

Akan membahas tentang.....

Kromatografi Cair Kinerja


Tinggi
(KCKT)

Sejarah KCKT
Alat Kromatografi adalah suatu
alat umum yang digunakan untuk
bermacam-macam teknik pemisahan
warna atau pugmen.
Penemu Alat Kromatografi adalah
Tswett yang pada tahun 1930

Istilah kromatografi diciptakan


oleh Tswett untuk melukiskan daerahdaerah yang berwarna yang bergerak
kebawah kolom.
D.T. Day juga menggukan alat
kromatografi untuk memisahkan
fraksi-fraksi peroleum, namun Tswett
lah yang pertama diakui sebagai
penemu alat dan yang menjelaskan
tentang proses kromatografi.

Tahun 1967-1969, Kirland, Huber dan


Havarth memperkenalkan prinsip serta
alat kromatografi cair dengan tekanan
5000 psi (300 atm).

Akhir tahun 1930 an dan permulaan


tahun 1940 an, kromatografi mulai
berkembang.

Akhir tahun 1960 an, semakin banyak


usaha dilakukan untuk pengembangan
alat kromatografi cair

Kromatografi Cair Kinerja


Tinggi

KCKT adalah suatu metoda


kromatografi yang mampu
memisahkan makro molekul, senyawasenyawa ionik, produk alam yang
lebih, senyawa polimerik dan
kelompok-kelompok polifungsional
yang memiliki berat molekul tinggi
dengan cara penyairan berfraksi,
penyerapan atau penukaran ion.
Menggunakan fase yang interaktif dan

Fungsi utama KCKT pada dasarnya


adalah kemampuannya dalam
memisahkan berbagai komponen
penyusun dalam suatu sampel. Kinerja
tinggi dari kromatografi awalnya
ditentukan oleh ketinggian
tekanannya, namun perkembangan
teknologi telah menghasilkan produk
kromatografi cair berkinerja tinggi
dengan tekanan yang tidak terlalu
tinggi.

KCKT digunakan secara luas dalam


pemisahan dan pemurnian berbagai
sampel dalam berbagai bidang seperti
farmasi, lingkungan, industri makanan
dan minuman, industri polimer dan
berbagai bahan baku. KCKT lebih
banyak digunakan untuk keperluan
identifikasi (analisis kualitatif).

KCKT digunakan untuk


Pemisahan molekul-molekul
berbagai senyawa
organik
Penentuan
netral,
maupun
anorganik, ataupun
spesimen
ionik
maupunzwitter
ion
biologis
Isolasi dan pemurnian senyawa
Analisis ketidakmurnian (impurities)
Pemisahan senyawa-senyawa

Analisis struktur
senyawa-senyawa
dengan
kimia yangyang
miriptak
mudah menguap (non-volatil)
Pemisahan senyawa-senyawa dalam
jumlah kecil (trace elements)

Komponen KCKT
Wadah Fase Gerak
harus terbuat dari bahan yang bersih
daninert.

dapat menampung sekurangkurangnya 1-2 liter fase gerak, dan


terlebih dahulu harus dibebas gas kan.
Karena gas akan menimbulkan
gelembung pada pompa dan detektor
yang akan sangat mengacaukan hasil
analisis.

Secara umum ada 2 tipe fase gerak:

Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen


dengan komposisi pelarut yang tidak
berubah selama percobaan
kromatografi

Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase


gerak dengan komposisi pelarut yang
berubah selama masa kromatografi

Berdasarkan kepolaran fase gerak


dibandingkan fase diamnya, fase gerak
dibedakan menjadi:

Fase normal, yaitu fase diam lebih


polar dari fase gerak. Kemampuan
elusinya akan meningkat seiring
peningkatan polaritas fase gerak.

Fase terbalik, yaitu bila fase diam


kurang polar dibanding fase geraknya.
Kemampuan elusi akan menurun
seiring peningkatan kepolaran fase
geraknya.

Pompa

Untuk keperluan preparatif, pompa

Pompa KCKT harus terbuat dari bahan


yang digunakan harus mampu
yag inert terhadap fase gerak. Bahan
mengalirkan fase gerak dengan
pompa dapat terbuat dari: gelas, baja
kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada
tahan karat, teflon maupun batu nilam.
2 tipe pompa:

Pompa
yang
digunakan
sebaiknya

Pompa dengan tekanan konstan


mampu
memberikan tekanan hingga

Pompa dengan aliran fase gerak


5000 psi dan mamp mengalirkan fase
yang konstan. Pompa tipe ini lebih
gerak dengan kecepatan 3 ml/menit.
umum digunakan.

Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT,
yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor.

Kolom merupakan bagianHPLC yang


mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.

Keuntungan kolom mikrobor


mengkonsumsi fase gerak hanya 80%
dari konsumsi
konvensional.
Meskipun
demikian,kolom
dalam prakteknya,
kolom

Aliran fase
gerak
pada
mikrobor
yang
mikrobor
ini tidak
setahan
kolom
konvensional
lebih
lambat
membuat
kolomrutin.
mikrobor
dan
kurang
bermanfaat
untuk analisis
lebih ideal untuk digabungkan dengan
spektrometer massa

Sensitivitas kolom mikrobor lebih


tinggi karena pelarut yang lebih pekat,
sehingga cocok digunakan dalam
analisis sampel berskala kecil, seperti

Fase Diam
Kebanyakn fase diam berupa silika
yang dimodifikasi secara kimiawi, silika
yang tak dimodifikasi atau polimerpolimer stiren dan divinil benzena.

Detektor
Contoh
detektor
yang bersifat
Detektor
KCKT dikelompokkan
universal
detektor
indeks
menjadi
duaadalah
golongan
yaitu detektor
biasbersifat
dan spektrometri
massa.
yang
universal, yaitu
detektor
Dandapat
jenis mendeteksi
detektor lainnya
yang
zat secara
adalah
detektor
spesifik
yang
umum,
tidak
bersifat
spesifik,
dan
hanya
akanselektif.
mendeteksi analit
tidak
bersifat
secara spesifik dan selektif,
seperti detektor UV-Vis,
fluoresensi dan elektrokimia.

Karakteristik detektor ideal


Mempunyai
sel
volume
yang
kecil

Mempunyai
respon
terhadap
analit
sehingga mampu meminimalkan
yang
cepat
dan
reproduksible
pelebaran
pita.
Untuk
kolom

Mempunyai
sensitivitas
yang
tinggi,
konvensional 8 ul atau lebih kecil
yakni
mendeteksi
analit
pada
dan 1mampu
ul atau lebih
kecil pada
kolom
kadar
yang
sangat
kecil
mikrobar.

Stabil
dalam
pengoperasiannya

Signal yang dihasilkan berbanding


lurus dengan konsentrasi analit
pada kisaran yang luas

Tidak peka terhadap perubahan


suhu dan kecepatan alir fase gerak

Perangkat Pendukung Lainnya

Perangkat pendukung lain yang


digunakan dalam KCKT dapat berupa
komputer, integrator dan rekorder.

Jenis teknik pemisahan


dalam KCKT

b.
Kromatografi
partisi
a.
c.Kromatografi
Kromatografiadsorpsi
penukar ion
Linarut dibagi atas fase gerak cair
Fase
diam
yang
biasa digunakan

Prinsip
kerja
berdasarkan
dengan
cairan
yang
tidak
adalah
alam
polar
seperti
partisi bahan
ion
antara
fase
gerak
bercampur
yang
dilapiskan
pada Fase
partikel
silika
atau
alumina
dan fase
diam
pada
lokasi hidrat.
suatu
patikel
padat
sebagai fase
mobil
berkompetisi
terhadap
lokasi
penukaran
ion.
Pemisahan
diam.
Fase
diam
dapat
aktif
adsorpsi
pada
partikel
fasefase
diam.
terjadi
akibat
partisi
ionberupa
diam
disalutkan
pada
Komponen
yang
terikat
lebihpartikel
kuat akan
dalamyang
derajat
yang
berbeda.
penyangga.
Kolom
terikat
tertahan
lebih
lama fase
di dalam
kolom.
(bonded-fase
merupakan
Waktu
retensi colum)
bergantung
pada
kolom yang
paling umum
kepolaran
sampel.

Hasil sistem KCKT dan optimasinya


sangat tergantung pada beberapa hal,
antara lain :

a. Temperatur

b. Tekanan

c. Diameter partikel fase diam

d. Viskositas

e. Panjang kolom

Sistem KCKT
Sistem elusi isokratik (isocratic
Sistem elusi bertahap
3.1.
2. Sistem elusi gradient (gradient elution)
elution)

Baik
sampelbaik
yang
Adadigunakan
perubahanuntuk
fasa gerak
secara

Sampel
ke dalam kolom
mengandung
komponen-komponen
yang
bertahapdiinjeksikan
atau
berkesinambungan
selama
bergerak
cepat, yang
diikuti
senyawa-senyawa
yang
fasa
geraknya
tidak
proseskomposisi
berlangsung.
Pada
mula-mula
yang
lambat
gerakannya,
elusi,
seluruh
komponen
sampel
ditahan
berubah
selama
analisis
dilakukan
di bagiansampel
atas kolom,
setelah
sampai
terelusi
darigradien
kolom,
mulai, kekuatan
fase
gerak akan
sistem
isokratikelusi
yang
memiliki
nilai k
meningkat.

(rasio atau koefisien partisi yang


bervariasi) akan menghasilkan resolusi
yang buruk dan sukar mendeteksi pita

Alat Kromatografi Cair Kerja


Tinggi

PENENTUAN KADAR PARASETAMOL


DALAM SAMPEL DENGAN METODE
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
Alat Dan Bahan
1.2.Alat-alat
Bahan: :

Kromatografi
cair kinerja tinggi (HPLC)
1 set
Standar parasetamol
6,25 mg

Lumpang
dan alu
Metanol
375 mL 1 buah
Sampel obat
6 butir 1 set

Spatula
Aquades
secukupnya

Labu
takar 25 mL dan 10 mL
7 buah

Membran PTFE
1 set

Neraca
analitik
1 set
Selulosa nitrat
1 set

Corong
pendek
Kertas saring
secukupnya1 buah

Pipet tetes
5 buah

Gelas kimia 5 mL
1 buah

Gelas ukur 10 mL
1 buah

Ultrasonic Vibrator
1 set

3. Pembuatan larutan standar parasetamol


Prosedur
Kerja
Larutan induk
parasetamol masing-masing dipipet
1.sebanyak
Pembuatan
gerak
1 mL,pelarut
2 mL, 3 dan
mL, 4fasa
mL dan
5 mL yang masingmasing dimasukkan
ke dalam
labu ukur
Setelah itu
Metanol
disaring dengan
PTFE
dan10
airmL.
disaring
ditambahkan
pelarut
masing-masing
sebanyak
5 mL dan
dengan
selulosa
nitrat.
Laludicampur
masingdihomogenkan. Kemudian ditambah lagi pelarut sampai
masing
dengan perbandingan 75:25 dengan
tanda batas. Selanjutnya disaring dengan PTFE dan
volume
total
sebanyak
mL.
disimpan
dalam
botol vial 500
lalu didegassing.
Pembuatan larutan
sampel
2.4.Pembuatan
larutan
indukparasetamol
parasetamol
Sebanyak 66,25
tablet
obat
sampel masing-masing
Sebanyak
mg
parasetamol
ditimbangditimbang
beratnya dan dihitung berat rata-ratanya. Tablet obat
dengan
neraca analitik dalam botol
tersebut digerus dalam mortar hingga halus dan ditimbang
timbang.
Parasetamol
tersebut
serbuknya
sebanyak 27 mg
dengandilarutkan
neraca analitik dalam
dengan
sedikitKemudian
pelarut, dilarutkan
dipindahkan
kesedikit
dalampelarut
botol timbang.
dengan
dan ukur
dipindahkan
dalam labu
25 mL, sampeldan
labu
25 mL.keSetelah
itu,ukur
dihomogenkan
dihomogenkanpelarut
dalam ultrasonic
Setelah itu
ditambahkan
sampai vibrator.
tanda batas.
ditambahkan pelarut hingga tanda batas.

Larutan sampel tersebut kemudian disaring dan


ditampung dalam labuerlenmeyer. Kemudian dipipet
sebanyak 1 mL dan disimpan dalam labu ukur 10 mL
yang diencerkan dengan pelarut sampai tanda batas.
Larutan sampel teresbut disaring kembali
menggunakan membran PTFE dan filtratnya
didegassing selama 5 menit. Setelah itu, sampel siap
untuk diinjeksikan.

Hasil dan Analisis Data


Pada percobaan penentuan kadar parasetamol
Dalamsampel
pembuatan
larutan induk parasetamol,
dalam
obat menggunakan
kromatografi
pembuatannya
harus
dilakukan
dalam satu kali
cairan
kinerja tinggi
(HPLC)
ini menggunakan
fasa
pengerjaan,
membuat
larutan
gerak
metanolartinya
dan airuntuk
dengan
komposisi
75:25. Fasa
standar
parasetamol
untuk
keperluan
gerak
dalam
HPLC ini dan
selain
berfungsi
sebagai
pengenceran
sampelinteraktif
harus menggunakan
pelarut,
juga bersifat
sehingga bisalarutan
induk parasetamol
sama. Hal tersebut
berinteraksi
dengan yang
komponen-komponen
cuplikan.
dilakukan
agar peak
yang pelarut
Fasa
gerakuntuk
dalammenjaga
hal ini bertindak
sebagai
ditunjukkan
kromatogram
sampel
memungkinkan
sangat
mempengaruhi
waktu
retensi,
sehingga
masih yang
berada
dalam rentang
konsentrasi larutan
pelarut
digunakan
harus benar-benar
jernih dan
standar
yang
dibuat.
murni.
Oleh
sebab
itu, metanol dan air terlebih
dahulu disaring.

Selain itu, baik dalam pembuatan larutan induk


parasetamol, larutan standar parasetamol maupun
sampel harus dihomogenkan, supaya larutan benarbenar bercampur sempurna (merata). Larutan standar
Akibat perbedaan interaksi antara solut dengan fasa
dan sampel juga harus didegassing untuk
gerak dan fasa diam yang terjadi mulai dari kolom
menghilangkan gas-gas yang kemungkinan ada dalam
sampai terdeteksi oleh detektor, maka hasil yang
larutan tersebut. Hal itu dilakukan karena gas dapat
diperoleh adalah dalam bentuk kromatogram yang
mengganggu baseline pada kromatogram, sehingga
diperlihatkan oleh rekorder. Deret larutan standar
peak yang dihasilkan tidak sesuai.
yang dibuat mulai dari konsentrasi 25, 50, 75, 100
dan 125 ppm

Berikut tabel data deret larutan standar yang


diperoleh:

Analisis terhadap cuplikan atau sampel obat


dilakukan setelah semua deret larutan standar telah
dianalisis. Sampel diinjeksikan sebanyak 2 kali injeksi
untuk memperoleh luas area rata-rata yang nantinya
akan digunakan untuk menghitung kadar parasetamol
yang terdapat dalam sampel obat tersebut.
Berikut tabel data sampel yang diperoleh:

Kromatogram
dari masing-masing
parasetamolsampel
adalah yang
peak diperoleh
yang pertama
(penginjeksian pertama)
penginjeksian
menunjukkan
adanya 2 peak
dankarena
4 peak.dilihat
Hal dari
dan peak yang
ketiga (penginjeksian
kedua)
tersebut
dikarenakan
kandungan
dalam
sampel
obat
tidak
waktu retensi
yang sama
atau
hampir
sama
dengan
waktu retensi
Berikut
kurva kalibrasi
deret
larutan
standar
yang
diperoleh:
hanya
mengandung
parasetamol
saja, tetapi
juga mengandung
deretkurva
larutan
standar.
Dari
kalibrasi
tersebut, diperoleh
persamaan
garis y =
bahan
deklorfenilamina
maleat dan
Untuklain
menentukan
kadar parasetamol
yang terkandung
dalam
84535x
+ seperti
24549, propanezon,
sehingga
setelah
dilakukan
perhitungan
kafein,
sehingga
peak lainnya
yang
ditunjukkan
dalam
sampel
obat tersebut,
maka
dibuat
terlebih
kurva kalibrasi
menggunakan
persamaan
garis,
maka
kadardahulu
parasetamol
kromatogram
adalah
bahan
lain yang
terkandung
dalam
sampel
dari data
deret
larutan
standar.
dalam
sampel
adalah
84,837%
dalam
27 mg sampel
obat.
obat tersebut. Peak yang dianggap sebagai peak

Kesimpulan
Berdasarkan percobaan, diperoleh kadar parasetamol
dalam 27 mg sampel obat sebesar 84,837%.

Ada Pertanyaan?

Wassalamualaikum wr. wb