OPTIMASI AGITASI (SHAKING) DAN WAKTU KULTIVASI TERHADAP

PRODUKSI SENYAWA BIOAKTIF EMESTRIN A DAN B DARI KAPANG LAUT

Emericella nidulans
Optimazation of Agitation and Cultivation Time to Production Bioactive Compound
Emestrin A and B From Marine Fungus Emericella nidulans
(Martua Manullang1, Joko Samiaji2 and Muhammad Nursid3)
1

Student of Fishery and Marine Science Faculty, Riau University

Lecturer of Fishery and Marine Science Faculty, Riau University
3
Researcher of Research and Development Center for Marine and Fisheries Product Processing and Biotechnology
E-mail : thespecialone73@yahoo.co.id
2

ABSTRACT
Research to investigate the effects of agitation speed and cultivation time of marine
fungus Emericella nidulans on production of bioactive compound emestrin A dan B has been
done. The fungal was cultivated in four different agitation speeds, i.e. 0 rpm, 50 rpm, 100
rpm and 150 rpm for 1, 2, 3 and 4 weeks respectively. The concentration of emestrin A and
B was analyzed by using high perfomance liquid chromatography (HPLC). The result showed
that the highest concentration (3006.43 ppm) of emestrin A was recorded from mycelia in 1
week cultivation at 0 rpm agitation speed. The highest concentration of emestrin B (3467.82
ppm) was found from broth in 2 week of cultivation at 50 rpm agitation. The treatment based
on timing cultivation did not give significant result, meanwhile the speed of agitation
performed the significant differences.
Keywords : Emericella nidulans, emestrin, agitation speed, cultivation time

PENDAHULUAN
Laut menyimpan kekayaan berbagai sumberdaya hayati yang dapat dimanfaatkan

sebagai sumber bahan alami yang dikembangkan sebagai bahan obat. Bhadury et al, (2006)
mengatakan bahwa Kapang yang berasal dari lingkungan laut (marine derived fungi)
berpotensial sebagai sumber senyawa aktif.

Emericella nidulans merupakan salah satu

kapang yang berasal dari lingkungan laut yang bersimbion pada karang jenis Ascidia.
Senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh kapang laut E. nidulans adalah senyawa
bioaktif emestrin.

Menurut Nursid et al. (2011) dikemukakan bahwa ekstrak miselium

kapang laut E. nidulans mengandung senyawa makrosiklik epidithiodioxopiperazine (EPT)

yang memiliki aktivitas antikanker. Senyawa emestrin A dengan rumus molekul
C27H22N2O10S2 memiliki aktivitas sitotoksik kuat terhadap sel kanker payudara (T47D),
HepG2, C28 dan Hela dengan IC50 berturut-turut sebesar 1,7 g/ml, 4,3 g/ml, 2,6 g/ml,
dan 12,8 g/ml. Senyawa emestrin B memiliki rumus molekul C27H21N2O10S3 dan aktif
terhadap sel HeLa (10,2 g/ml), sel WiDr (1,5 g/ml), dan sel kanker payudara T47D (0,19
g/ml).
Senyawa bioaktif emestrin E. nidulans memiliki potensi yang besar untuk
dieksplorasi sebagai senyawa bioaktif antikanker. Masalah suplai senyawa bioaktif menjadi
hambatan utama dalam pengembangan senyawa bioaktif dari organisme laut terutama ketika
pengembangan senyawa bioaktif tersebut sedang memasuki evaluasi pra klinis dan klinis
karena keperluan uji pra klinis dan klinis membutuhkan senyawa dalam jumlah besar
sementara rendemen yang dihasilkan sangat kecil.
Faktor utama yang mempengaruhi produksi kadar senyawa bioaktif emestrin E.
nidulans adalah waktu kultivasi, salinitas, pH dan faktor tekanan fisik seperti agitasi dan
suhu. Dengan mempertimbangkan faktor-faktor tersebut maka optimalisasi produksi senyawa

bioaktif emestrin A dan B dari ekstrak kasar miselium dan broth kapang laut E. nidulans
dilakukan dengan mempertimbangkan waktu kultivasi dan kecepatan agitasi sehingga dalam
memproduksi senyawa bioaktif emestrin (ETP) lebih optimal sehingga permasalahan
kecilnya nilai rendemen untuk uji praklinis dan klinis dapat terpencahkan.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah Kapang Laut E. nidulans media
kultivasi Malt Extract Agar (MEA) dengan komposisi 0,3% extract malt, 0,3 extract yeast,
0,5% pepton dan 1,5% agar, sedangkan medium yang digunakan untuk fermentasi (kultivasi)
adalah : Malt Extract Broth (MEB) dengan komposisi 0,3 % malt extract, 0,3 % yeast extract
dan 0,5 % pepton, pelarut acetonitril (Baker), etil asetat (Baker), diklorometan (Baker),
methanol (Baker), asetonitril HPLC grade (Baker), air HPLC grade (Baker).
Metode
Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian adalah Rancangan Acak
Lengkap (RAL) Faktorial dengan dwifaktor dengan 4 taraf dengan tiga kali ulangan.
Media Kultivasi Kapang

Media yang digunakan pada kultivasi Kapang Laut (E. nidulans) adalah Malt Extract
Broth (MEB) sebanyak 100 ml dengan komposisi 0.3 gr malt extract, 0.3 gr yeast extract
dan 0.5 gr peptone untuk 1000 ml. Semua komposisi media MEB dilarutkan ke dalam klorida
100 ml dengan salinitas 10 ppt air laut buatan (artificial sea water/ASW) dengan komposisi
70 g Natrium klorida, 1,1 g Natrium sulfat, 3,0 g Kalium klorida, 20,4 g Magnesium klorida,
dan 0,6 g Kalsium. Salinitas 10 ppt merupakan salinitas yang paling optimum dalam
menghasilkan senyawa emestrin (Nursid et al., 2013) Kemudian media disterilisasi dengan
menggunakan autoclave pada suhu 1210C selanjutnya media disimpan pada suhu kamar.

Penyegaran dan penumbuhan kapang Emericella nidulans

Isolat kapang laut Emericella nidulans didapat dari hasil isolasi pada karang Ascidia
(Aplidium longithorax). Biakan beku dari spora E. nidulans diambil dari freezer bersuhu

73oC lalu didiamkan beberapa saat dalam suhu kamar 27 29oC hingga media dan gliserol
yang ada dalam tabung mencair. Spora yang terdapat dalam biakan dipindahkan secara
aseptis ke dalam cawan petri yang berisi media MEA dengan menggunakan jarum tanam
tajam. Cawan petri dibungkus dengan kertas parafilm kemudian diinkubasikan pada suhu 27
29oC selama 3 7 hari hingga biakan spora tumbuh dengan baik.
Kultivasi Kapang Laut E. nidulans
Kapang laut Emericella nidulans dari koloni yang ditumbuhkan dalam cawan petri
dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang mengandung 10 ml media MEB, kemudian
diinkubasi selama 24 jam.
Setiap biakan dalam tabung reaksi di pindah ke dalam labu erlenmeyer 250 ml yang
mengandung 100 ml media MEB Kultivasi selama 1, 2, 3, dan 4 minggu pada suhu ruang.
Pengukuran Biomassa
Biomassa E. nidulans yang dihasilkan dari setiap perlakuan dihitung berdasarkan
massa kering miselium. Miselium dipisahkan dengan media kultivasi (broth) melalui
penyaringan lalu dikeringbekukan dengan

freezedryer (Labconco). Miselim yang sudah

kering tersebut lalu ditimbang massanya.

Pengukuran pH
Pengukuran pH dengan menggunakan pH meter thermo scientifik, pengukuran
dilakukan pada media kultivasi (broth) yang sudah dipisahkan dengan miselium

Pengukuran Salinitas
Pengukuran salinitas dengan menggunakan Salinometer, pengukuran dilakukan pada
broth yang sudah dipisahkan dari miselium.

Ekstraksi metabolit
Ekstraksi metabolit yang terdapat dalam miselium dilakukan mengikuti metode
Nursid et al. (2010). Miselium kapang disaring dengan menggunakan kertas saring untuk
memisahkan miselium dari media kultivasi (broth). Miselium selanjutnya dikeringbekukan
dengan freezedryer (Labconco). Setelah kering miselium direndam ke dalam Erlenmeyer dan
ditambah campuran DCM : MeOH = 1 : 1 sebanyak 25 ml. Erlenmeyer disonikasi selama 2
jam, lalu filtrat yang didapat disaring dengan kertas saring whatman nomor 41.
Media kultivasi (broth) 100 ml disaring dalam corong pisah lalu ditambahkan etil
asetat 100 ml. Corong pisah dikocok selama 3 menit lalu didiamkan beberapa saat sampai
lapisan etil asetat (bagian atas) dan media kultivasi (broth) (bagian bawah) memisah dengan
jelas. Lapisan etil asetat dipisahkan dan ditampung dalam erlenmeyer.
Pelarut yang terdapat dalam ekstrak miselium dan ekstrak broth selanjutnya
dievaporasi dengan Buchi Rotavapor 512 hingga diperoleh ekstrak pekat miselium dan broth
.
Karakterisasi Senyawa Emestrin
Ekstrak miselium dan broth dikarakterisasi dengan menggunakan High Performance
Liquid Chromatography (HPLC).
Scanning Electron Microscope (SEM)
Sampel miselium yang sudah dikeringkan dengan frezee drier selanjutnya miselium
dipotong menjadi bagian yang sangat kecil. Sampel miselium diletakkan pada specimen
holder selanjutnya miselium dilapisi emas (coating gold). Visualisasi miselium secara
miskroskopis dengan menggunakan Scanning Electron Microscope (SEM) JCM 6000.

Uji Anova Dua Arah Dengan Interaksi

Data dianalisis dengan menggunakan Uji Anova Dua Arah Dengan Interaksi (Mattjik
dan Sumertajaya, 2000). Jika ada perbedaan bermakna diteruskan dengan uji Duncan
Multiple Range Test (Steel,1993).

Rendemen Ekstrak
Rendemen ekstrak digunakan untuk menentukan berapa persen kandungan bioaktif
yang terdapat pada suatu bahan. Persentase rendemen ekstrak dihitung dengan rumus berikut:
............ (1)
Keterangan:
Pr : Persen rendemen
Be : Bobot ekstrak
Bs : Bobot sampel awal
HASIL DAN BAHASAN
Biomassa Miselium Kapang Laut E. nidulans
Biomassa miselium kapang laut E. nidulans yang dikultivasi 1 minggu dengan agitasi
(shaking) 100 rpm memiliki massa paling besar sebesar 600.00 mg.

Perlakuan agitasi

(shaking) 100 rpm dengan waktu kultivasi 1 minggu memberikan pengaruh yang sangat nyata
(P<0,01) terhadap biomassa miselium kapang laut E. nidulans. Tingginya biomassa miselium
pada kultivasi minggu I disebabkan kandungan niutrien dalam medium MEB masih sangat
tercukupi sehingga kebutuhan nutrien kapang laut E. nidulans dapat terpenuhi. Agitasi
menstimulan kapang laut E. nidulans untuk menghasilkan hifa lebih banyak

agar

mendapatkan nutrien yang cukup dari medium. Menurut Madigan et al., (2008) bahwa hifa
merupakan serabut jala putih yang terbentuk dari spora yang berfungsi untuk mengabsopsi
nutrien dan tumbuh di dalam medium.

Biomassa Miselium Kering (mg)

700.00
600.00
500.00
400.00
300.00
200.00
100.00
S1T1 S1T2 S1T3 S1T4 S2T1 S2T2 S2T3 S2T4 S3T1 S3T2 S3T3 S3T4 S4T1 S4T2 S4T3 S4T4
Kombinasi Perlakuan

Gambar

1.

Profil

biomassa

miselium

kapang

laut

E.

nidulans

Analisis KCKT dan Kadar Emestrin

Analisis produksi senyawa emestrin A dan B oleh kapang laut E. nidulans
berdasarkan waktu retensi dan profil serapan UV yang dihasilkan. Kadar emestrin A dan B
ditentukan dengan menggunakan kurva standar emestrin yang telah diisolasi. Kurva standar
dibuat dengan membuat plot antara serial dosis emestrin versus luas puncak. Kurva linier
standar emestrin memiliki persamaan y=18945x + 32698 dengan nilai R2 sebesar 0,98
dimana y = luas puncak dan x = kadar emestrin. Kurva standar emestrin disajikan pada
Gambar 2.
1400000
1200000

y = 18945x + 32698
R2 = 0.976

1000000
800000
600000
400000
200000

10

20

30

40

50

Kadar Emestrin (ppm)

Gambar 1. Kurva standar emestrin

60

70

17.346

1.644

10000

27.772

m AU
11000

9000

48.025

8000

20.542

7000
6000

35.072

25.414

14.636

4.116

2000

10.418

3000

39.994

32.225

4000

45.046

5000

1000
0
10

20

30

40

50

m in

Konsentrasi Emestrin (ppm)

Gambar 2. Kromatogram dan Serapan UV dari ekstrak miselium kapang laut E. nidulans
Rerata Kadar Emestrin A

3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0

S1T1S1T2S1T3S1T4S2T1S2T2S2T3S2T4S3T1S3T2S3T3S3T4S4T1S4T2S4T3S4T4
Kombinasi Perlakuan

Gambar 3. Kadar emestrin A dari ekstrak miselium kapang laut E. nidulans

Berdasarkan Gambar 2. Senyawa emestrin A terelusidasi pada menit 17. Berdasarkan
Gambar 3. bahwa kadar emestrin A yang dihasilkan ekstrak miselium E. nidulans tertinggi
pada minggu ke I dengan kecepatan agitasi 0 rpm sebesar 3006,43 ppm terelusidasi pada
menit 17,34 . Kadar emestrin A pada minggu ke IV pada setiap kecepatan agitasi sangat
kecil. Menurut Nursid et al, (2011) bahwa tinggimya kadar emestrin A pada minggu I
dikarenakan kebutuhan akan nutrisi dari media pertumbuhan (MEB) masih tercukupi. Nutrisi
merupakan prekursor dalam

proses biosintesis senyawa bioaktif. Menurut Porcel et al,

(2005) bahwa kadar senyawa bioaktif yang dihasilkan pada proses kultivasi statis akan
menghasilkan senyawa bioaktif yang optimal. Hal ini dikarenakan kapang laut pada habitat
aslinya bersifat statis.

mAU

mAU
19.06/ 1.00

203

1.704

35000

650

600

550

32500

500

450

30000

400

350

27500

250

237

251

300

25000

200

150

22500

100

441

424

460
463

0
200.0

225.0

250.0

275.0

300.0

325.0

350.0

375.0

400.0

425.0

450.0

482
485

50

20000

475.0

nm

4.258

17500
15000

48.735

54.822

44.810

40.242
41.302
42.090

27.705

35.312

2500

29.202
31.210

5000

23.932

7500

14.281

10.219
11.342

10000

16.943
19.076
21.115

12500

0
10

20

30

40

50

min

Gambar 4. Kromatogram dan Serapan UV dari broth kapang laut E. nidulans

5000

Rerata Kadar Emestrin B

4000
3000
2000
1000
0

S1T1 S1T2 S1T3 S1T4 S2T1 S2T2 S2T3 S2T4 S3T1 S3T2 S3T3 S3T4 S4T1 S4T2 S4T3 S4T4
Kombinasi Perlakuan

Gambar

5.

Kadar

emestrin

dari

broth

kapang

laut

E.

nidulans

Berdasarkan Gambar 4. Bahwa senyawa emestrin terelusidasi pada menit 19. Kadar
emestrin B yang dihasilkan ekstrak media kultivasi (broth) E. nidulans tertinggi pada minggu
ke II dengan kecepatan agitasi 50 rpm sebesar 3467,82 ppm terelusidasi pada menit 19,55 .
Kadar emestrin B pada setiap minggu ke IV

pada setiap kecepatan agitasi cenderung

mengalami kenaikan kadar emestrin yang signifikan. Nursid et al, (2011) berpendapat bahwa
tinggimya kadar emestrin B pada minggu II dikarenakan kebutuhan akan nutrisi dari media
pertumbuhan (MEB) masih tercukupi. Nutrisi merupakan prekursor dalam proses biosintesis
senyawa bioaktif. Senyawa bioaktif emestrin B dijumpai pada ekstrak broth hal ini
menunjukkan bahwa senyawa emestrin B merupakan senyawa utama yang digunakan untuk
proses pertahanan diri dari serangan sesama mikroba. Menurut Nursid et al, (2013)

menyatakan bahwa senyawa-senyawa yang terdapat pada ekstrak broth merupakan senyawa
yang dilepas ke dalam broth selama proses kultivasi. Hal tersebut menunjukan bahwa
selama pertumbuhannya menghasilkan senyawa metabolit ekstraselular. Metabolit yang
terkandung dalam

broth

merupakan

metabolit ekstraselular hasil metabolisme primer

seperti polisakarida, protein dan hasil metabolisme sekunder.

Kesimpulan
Perlakuan kecepatan agitasi (shaking) 0 rpm (statis) pada waktu kultivasi I minggu
merupakan kombinasi perlakuan yang paling optimal dalam memproduksi senyawa emestrin
A. Emestrin A banyak ditemukan pada miselium kapang E. nidulans
Perlakuan kecepatan agitasi (shaking) 50 rpm pada waktu kultivasi II minggu (shaking)
50 rpm pada waktu kultivasi II minggu merupakan kombinasi perlakuan yang paling optimal
dalam memproduksi senyawa emestrin B. Emestrin B banyak ditemukan pada broth kapang
laut E. nidulans.
Daftar Pustaka
Bhadury, P., Mohammad, B.T., Tright, P.C., 2006. The Current Status Of Natural Products
From Marine Fungi and Their Potential As Anti-Infective Agents. J. Ind. Microbiol.
Biotechnol. 33
Nursid, M., A. Pratitis., dan E. Chasanah. 2010. Kultivasi Kapang MfW-01-08 Yang
Diisolasi Dari Ascidia Aplidium longithorax Dan Uji Aktivitas Sitotoksiknya
Terhadap Sel Kanker Payudara T47D. Prosiding Seminar Nasional Pengelolaan
Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan 5 (2): 103-121.
Nursid, M., E. Chasanah., Murwantoko., dan S. Wahyuono. 2011. Penapisan Kapang Laut
Penghasil Senyawa Sitotoksik Dari Beberapa Perairan Indonesia. Jurnal Pascapanen
dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan Vol. 6 No1: 45-56.
Nursid, M. 2012. Isolasi Dan Indentifikasi Senyawa Berpotensi Antitumor Dari Kapang yang
Berasosiasi Dengan Organisme Laut. Disertasi Pascasarjana Universitas Gadjah
Mada. Yogyakarta.

Nursid, M., N.D. Fajarningsih., dan E. Chasanah. 2013. Isolasi, Identifikasi Dan Optimasi
Produksi Emestrin B dari Kapang
Laut Emericella nidulans. Prosidng Seminar Hasil Penelitian Terbaik. Balitbang
KKP.
Madigan, M.T., J.M. Martinko., and J. Parker. 2000. Brock Biology of
Microorganisms. 9th ed. Prentice Hall International, Inc., London.
Porcel, E.M.R., J.L.C. Lopez, J.A.S., Perez. 2005. Effects Of Pellet Morphology On Broth
Rheology In Fermentations Of Aspergillus
terreus. Biochemical Engineering Journal.