Anda di halaman 1dari 9

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Dasar Teori
2.1.1 Elektroforesis
Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau
perpindahan melalui partikel-partikel listrik.Elektroforesis adalah suatu cara analisis
kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam
medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh
bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Titrawani, 1996). Molekul
terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh
rasio muatan dan massa. Sebagai contoh jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk
yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode.
(David G. Watson, 2007). Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang
telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai
bermigrasi (Ricardson dkk. 1986).
Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan,
bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi
makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel
dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi
dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga
untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.
Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi
konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis
spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik.
Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan
bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan
pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan
negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode),
sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub
negatif (anode) (Klug & Cummings, 1994: A 6). Prinsip inilah yang dipakai dalam
elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya sehingga
pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fase diam (stationary phase) dalam
sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka
partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Kemampuan perpindahan pergerakan
muatan molekul tersebut menuju ke arah kutub yang berlawanan merupakan suatu
parameter kecepatan dalam proses elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas
elektroforetik. Mobilitas elektroforetik merupakan laju perpindahan partikel bermuatan
dalam cm per detik yang disebabkan karena pengaruh medan listrik 1 V per cm,
dinyatakan dalam cm2V-1s-1. Mobilitas elektroforetik dapat ditetapkan hanya untuk
elektrolit tertentu pada kondisi pengujian yang tepat.

Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan


menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan
elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan
penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan
dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat
terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan
teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi
sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang
biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose
poliasetat. Adapun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai
elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa
digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu
peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim
tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik.
Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat
bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung
pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam
elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan
agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan
asam nukleat.
Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni:
(Soedarmadji, 1996)
1. Ukuran molekul protein
Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran
kecil.
2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi
molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat
mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang
bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas
sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan
molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas
sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat
lambat.
4. Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang
bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik,
sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel
poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).

Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang
lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul
yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur
dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan
bisakrilamid.
5. Kekuatan voltase
a. Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding
dengan tingginya voltase yang digunakan.
b. Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara
lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta
jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik).
6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur
tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika
temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.
2.1.2. Elektroforesis gel
Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat kemurnian DNA atau
protein yang tidak bisa diperoleh dengan metode lain seperti gradient sentrifugasi. Media
yang banyak dipakai dalam proses pemisahan ini adalah agarose atau akrilamid. Agarose
digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang lebih besar karena memiliki ukuran
partikel yang lebih besar. Sehingga daya pisah dari agarose (resolusi) lebih kasar (lebih
lemah) dibandingkan akrilamid. Akrilamid memiliki ukuran partikel yang lebih halus
sehingga daya pemisahannya lebih baik.
Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan Teknik ini
merupakan teknik yang sederhana, cepat, dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan
dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi
gradient. (David G. Watson, 2007).
Jenis-jenis Elektroforesis Gel
Elektroforesis gel agarosa
Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan
memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini sederhana, cepat
terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya
secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. (Maniatis T. et al, 1982)
Agarosa yang disari dari ganggang laut merupakan polimer dengan dasar struktur Dalaktosa dan 3,6 anhidro L-galaktosa. DNA dari 200 basa sampai 50 kilo basa dapat
dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya
dilakukan dalam konfigurasi horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap.
(David G. Watson, 2007)
Gel agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dengan buffer dan kemudian
dituangkan pada cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa
membentuk matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika

medan magnet diberikan antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH
netral, bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi ini ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA,
konformasi DNA, konsentrasi agarosa dan besaran tegangan yang digunakan. (David G.
Watson, 2007)
Molekul DNA untai ganda linear, yanag diletakkan pada salah satu ujung gel,
bergerak melalui matriks gel pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap log
jumlah asam basa. Molekul yang lebih besar bergerak lebih lama karena terjadi gesekan
lebih besar. (David G. Watson, 2007)
Hal ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel sehingga kurang efisien lajunya
daripada molekul yang lebih kecil.Fragmen DNA linear dengan panjang tertentu bermigrasi
dengan kecepatan yang berbeda pada gel yang mengandung konsentrasi agarosa berbeda.
Cara yang paling mudah untuk mendeteksi adanya DNA dengan menggunakan
etidium bromide, suatu senyawa berfluoresensi yang biasanya digunakan untuk mendeteksi
DNA pada gel agarosa atau poliakrilamid. (David G. Watson, 2007)
b. Elektroforesis Gel Poliakrilamid
Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas, biasanya
diberikan oleh ammonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi berantai
sehingga monomer terpolimerisasi menjadi rantai panjang.
Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antar dua lempeng kaca yang
dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrilamid berukuran dari
5 cm sampai 50 cm panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan elektroforesis
dengan cara vertikal. (David G. Watson, 2007)
c. Elektroforesis Gel Poliakrilamid-SDS ( SDS-PAGE)
Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran massanya dengan elektroforesis gel
poliakrilamid dengan system gerak. Sebelumnya, campuran protein dipanasi dengan
natrium dedosil suldat (SDS), suatu detergen anionik utnuk menyelubungi molekul protein.
Penyelubungan ini menyebabkan interaksi nonkovalen terganggu sehingga molekul protein
dalam struktur primer. Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu molekul
SDS untuk dua residu asam amino. . (David G. Watson, 2007)
Merkaptoetanol atau ditiotreitol juga ditambahkan untuk mereduksi ikatan
disulfida. Kompleks SDS dengan protein terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif
yang sebanding dengan ukuran protein. Muatan negatif yuang terdapat pada ikatan SDS ini
jauh lebih besar daripada muatan pada protein asli. Kompleks protein SDS kemudian
dielektroforesis, sehingga semua molekul protein bergerak menuju kutub positif. Ketika
elektroforesis selesai, protein dalam gel dapat ditampakkan oleh pewarnaan dengan perak
atau zat warna seperti Coonassie biru, yang akan menampakkan beberapa pita. (David G.
Watson, 2007).

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan


suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan
ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam
percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara
rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai
cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan
prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada
medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah
pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik
bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010)
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan
bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang
terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan
negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekulmolekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda)
(Klug and Cummings, 1994).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi
dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar
memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan
untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu
(Fairbanks & Andersen, 1999).
Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya
melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan
suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas
molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbell dkk, 2002).
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
berukuran besar.

3.

Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem


elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar
(Davis dkk. 1994).

Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar
(lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari
200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan
berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relatif
tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel,
kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi
fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang
terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil
bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki
gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang
rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar,
dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran
tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat
mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat
memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman,
2010).
Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada
fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu,
DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul
DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel.
Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan
kecepatan migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan
(di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen
yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada
gel (Lee & Bahaman, 2010).
Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:
1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.
2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses
elektroforesis
(Birren and Lai, 1993).

Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang


bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida
dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas,
sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan
molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993).
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari
produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu
dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis
dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan
gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai
genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab
kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam
sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai
tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu,
mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi
natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA,
RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi
melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan
menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA
(Russell, 1994; Fairbanks and Andersen, 1999).
Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi
atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien
karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa.
Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak
berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga
hasilnya sulit diinterpretasikan (Tarigan, 2011).

Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis. Amersham Biosciences :


USA.
Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. Academic
Press, Inc., San Diego.
Boffey, S. A. (1984). Isolation of high molecular weight DNA, in Methods in Molecular
Biology, vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana, Totowa, NJ.
Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga :
Jakarta.
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed.
Appleton & Lange, Norwola.
Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole
Publishing Company, New York.
Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8th ed.
John Wiley & Sons Inc., New York.
Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis Aplications in Clinical
Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4th ed. Merrill Publishing
Co. : Columbus, Ohio.
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment
analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2): 351-354 (2010).
Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA.
Warta Biotek : Bogor.
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech
Publisher : Rijeka, Croatia.
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd.,
Oxford.
Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College Publishers,
New York.
Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked
Oligonucelotide
Sorbent
Assay
(PCR-ELOSA)
untuk
Deteksi
Agen
Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing
Company, Belmont.

DAFTAR PUSTAKA

David G. Watson. 2009. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC


Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta
Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall,
Englewood cliffs: xvi + 779 hlm.
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis.
Sambrook, L., Fritsch, and Maniatis. 1990. Molecular Cloning. CSH. USA.
Skoog, A. D; F. J. Holler; and T. A. Nieman. 1998. Principle of Instrumental Analysis Fifth
Edition. Saunders College Publishing