TUGAS BIOTEKNOLOGI

Dyah Kesuma Ramadhani

06111009014

1. Apa kelebihan dari Agrobacterium tumafaciens sehingga bisa menyelipkan

DNA/ gen asing ke organisme lainnya dan bagaimana mekanismenya?
JAWAB
Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang
banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman
untuk

menghasilkan

suatu

tanaman

transgenik.

Secara

alami,

A.

tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotiledon melalui bagian

tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu
(crown gall tumor).

Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini

memiliki sebuah plasmid besar yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen
penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini pada tanaman.
Untuk memulai pembentukan tumor, A. tumefaciens harus menempel
terlebih dahulu pada permukaan sel inang dengan memanfaatkan
polisakarida asam yang akan digunakan untuk mengkoloniasi/menguasai
sel tanaman. Selain tanaman dikotiledon, tanaman monokotiledon seperti
jagung, gandum, dan tebu telah digunakan untuk memasukkan sel asing
ke dalam genom tanaman. Agrobacterium diisolasi dari tanaman yang
terinfeksi Crown Gall. Tumor Crown Gall adalah jaringan tanaman yang
pertumbuhannya tidak terdiferensiasi akibat adanya interaksi antara
tanaman-tanaman yang rentan dengan strain virulen Agrobacterium
tumefaciens.

Dari banyak teknik transfer gen yang berkembang, teknik melalui media
vector A. tumefaciens paling sering digunakan untuk metransformasi
tanaman,

terutama
dikotil. Bakteri
Gb.tanaman
1 Tumor kelompok
Crown Gall yang
disebabkan oleh Agrobacterium
tumafaciens

ini

mampu

mentransfer gen kedalam genom tanaman melalui eksplan baik yang

berupa potongan daun (leaf disc ) atau bagain lain dari jaringan tanaman
yang mempunyai potensi beregenerasi tinggi.
Gen yang ditransfer terletak pada plasmid Ti (tumor inducing ). Segmen
spesifik DNA plasmid Ti disebut T-DNA (transfer DNA ) yang berpindah dari
bakteri ke inti sel tanaman dan berintegrasi kedalam genom tanamn.
Karena A. tumefaciens merupakan patogen tanaman maka Agrobacterium
sebagai vektor yang digunakan untuk transformasi tanaman adalah
bakteri dari jenis plasmid Ti yang dilucuti virulensinya (disarmed),
sehingga sel tanaman yang ditransformasi oleh Agrobacterium dan yang
mampu beregenerasi akan membentuk suatu tanaman sehat hasil
rekayasa

genetik.

Teknik

transformasi

melalui

media

vektor

Agrobacterium pada tanaman dikotil telah berhasil dengan baik tetapi

sebaliknya tidak umum digunakan pada tanaman monokotil. Namun
beberapa peneliti telah melaporkan bahwa beberapa strain Agrobacterium
berhasil metransformasi tanaman monokotil seperti jagung dan padi.
Dasar dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah transfer dan
integrasi T-DNA ke dalam genom di dalam inti sel tanaman. T-DNA adalah
suatu bagian pada tumor inducing (Ti) plasmid yang terdapat di dalam sel
Agrobacterium. Ti-plasmid berukuran sekitar 200-800 kbp dan T-region (TDNA)nya sendiri berukuran sekitar 10% nya (10-30 kbp). T-region ini
dibatasi oleh dua sekuen pembatas (border) yaitu right border dan left
border yang mengapit T-region. Bagian lain dari Ti-plasmid yang tidak
kalah pentingnya adalah vir-region yang mengandung sejumlah gen-gen
virulen (virA, virB, virC, virD, virE, virF,virG dan virH) yang berfungsi
didalam

proses

transfer

Gb. 2 Daerah virulensi pada Ti

plasmid

T-DNA

ke

dalam

sel

tanaman.

Proses transformasi dimulai dengan melekatnya Agrobacterium pada sel

tanaman. Kejadian awal ini dimediasi oleh gen-gen yang berlokasi pada
kromosom bakteri (gen chvA, chvB dan att). Langkah berikutnya adalah
terinduksinya gen-gen pada vir-region oleh suatu signal yang spesifik
didalam sel bakteri sehingga dihasilkan produk dari expresi gen-gen
virulen untuk memproses T-DNA dan mentransfernya dari dalam sel
bakteri. Prosesing dan transfer T-DNA dimediasi oleh berbagai protein
yang dikode pembentukannya oleh gen-gen virulen. Prosesing T-DNA
dimulai dari suatu kejadian memproduksi T-DNA untai tunggal yang
disebut T-strand yang ditransfer ke dalam sel tanaman. Kejadian ini
dimediasi oleh produk dari genvirD1 dan virD2 yang berfungsi memotong
T-DNA di bagian left border dan right border. Salah satu produk yaitu
molekul VirD2 tetap melekat secara kovalen pada 5 end dari T-strand dan
membentuk apa yang disebut T-complex yang masih setengah jadi.
Pembentukan T-complex ini dilaporkan berfungsi untuk menjaga T-DNA

dalam perjalanannya menuju inti sel tanaman inang. Tahap akhir dari
transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah integrasi T-DNA ke dalam
genom sel tanaman inang.

Agrobacterium
menyebabkan

tumefaciens
penyakit

adalah

tumor

pada

bakteri

tanah

beberapa

yang

tanaman.

dapat
Bakteri

menginfeksi melalui bagian yang luka pada batang tanaman dan

mengakibatkan tumor pada daerah sekitar akar dan batang tanaman.

Gb. 3 Tahapan dasar pada proses

transformasi oleh Agrobacterium

Penyebab pembentukan tumor bukan berasal dari bakteri itu sendiri tetapi
dari plasmid yang dikenal dengan plasmid Ti. Ukuran DNA plasmid Ti
cukup besar, berkisar antara 140-235 kb (1 kb = 1000 pasang basa).
Selama menginfeksi, sebagian kecil dari DNA plasmid Ti (15-30 kb),
disebut T-DNA, ditransfer kedalam inti sel tanaman dan tersisipi kedalam
DNA inti sel tanaman. Dari sini T-DNA sudah terintegrasi dan stabil
terpelihara

dalam

genom

sel.

T-DNA membawa gen yang bertangung jawab terhadap pembentukan

tumor dan sintesa asam amino yang dikenal sebagai opine. Gen-gen yang
bertanggungjawab untuk transfer T-DNA juga terdapat dalam plasmid Ti
yang disebut gen-gen virulen (gen vir). Infeksi Agrobakterium memerlukan
jaringan tanaman yang luka karena gen vir dapat terinduksi oleh senyawa
fenolik

yang

dilepaskan

ole

sel-sel

tanaman

yang

terluka.

Daerah ini merupakan potongan DNA berukuran relatif pendek berisi

urutan 25 pasang basa yang berulang. Setiap potongan DNA yang tersisipi
diantara kedua batas T-DNA akan ditransfer dan diintegrasikan kedalam
genom tanaman. Oleh karena itu plasmid Ti merupakan vektor yang
sangat cocok untuk mengintroduksi gen-gen asing ke dalam sel tanaman.

2. Jelaskan

Gb. 4 Mekanisme penyisipan Agrobacterium

tumafaciens untuk menghasilkan tanaman
transgenik
mekanisme

buatan lainnya

dari teknik

DNA rekombinan!
JAWAB
1. TEKNIK PLASMID/ Membuat insulin dengan bantuan E. coli
Plasmid adalah gen yang melingkar tepat pada sel bakteri, tak terikat
pada kromosom. Teknik plasmid adalah penggunaan plasmid sebagai
vektor dalam teknologi DNA rekombinan, misalnya pada bakteri
penghasil insulin.

Insulin adalah hormon yang mengubah glukosa menjadi glikogen, dan

berfungsi mengatur kadar gula darah bersama hormon glukagon.
Kekurangan insulin karena cacat genetik pada pankreas, menyebabkan
seseorang

menderita

diabetes

melitus

(kencing

manis)

yang

berdampak sangat luas terhadap kesehatan, mulai kebutaan hingga

impotensi.
Sebelum ditemukan teknik sintesis insulin, hormon ini hanya bisa
diperoleh dari ekstraksi pankreas babi atau sapi, dan sangat sedikit
insulin bisa diperoleh. Setelah ditemukan teknik sintesis insulin di
bidang bioteknologi inilah, harga insulin bisa ditekan dengan sangat
drastis sehingga bisa membantu para penderita diabetes melitus.
Pada

proses

pembuatan

insulin

ini,

langkah

pertama

adalah

mengisolasi plasmid dari E. coli. Plasmid adalah salah satu bahan

genetik bakteri yang berupa untaian DNA berbentuk lingkaran kecil.
Selain plasmid, bakteri juga memiliki kromosom. Keunikan plasmid ini
adalah: ia bisa keluar-masuk tubuh bakteri, dan bahkan sering
dipertukarkan antar bakteri. Langkah kedua, plasmid yang telah diisolir
dipotong pada segmen tertentu menggunakan

enzim

restriksi

endonuklease. Sementara itu DNA yang di isolasi dari sel pankreas

dipotong pada suatu segmen untuk mengambil segmen pengkode
insulin. Pemotongan dilakukan dengan enzim yang sama.

DNA kode

insulin tersebut disambungkan pada plasmid menggunakan bantuan

enzim DNA ligase. Hasilnya adalah kombinasi DNA kode insulin dengan
plasmid bakteri yang disebut DNA rekombinan.
Selanjutnya, DNA rekombinan yang terbentuk disisipkan kembali ke sel
bakteri. Bila bakteri E. coli berbiak, maka akan dihasilkan koloni bakteri
yang memiliki DNA rekombinan. Setelah tumbuh membentuk koloni,
bakteri

yang

mengandung

DNA

rekombinan

diidentifikasi

menggunakan probe. Probe adalah rantai RNA atau rantai tunggal DNA
yang diberi label bahan radioaktif atau bahan fluorescent dan dapat
berpasangan dengan basa nitrogen tertentu dari DNA rekombinan.
Pada langkah pembuatan insulin ini probe yang digunakan adalah

ARNd dari gen pengkode insulin pankreas manusia. Untuk memilih

koloni bakteri mana yang mengandung DNA rekombinan, caranya
adalah menempatkan bakteri pada kertas filter lalu disinari dengan
ultraviolet. Bakteri yang memiliki DNA rekombinan dan telah diberi
probe akan tampak bersinar. Nah, bakteri yang bersinar inilah yang
kemudian diisolasi untuk membuat strain murni DNA rekombinan.
Dalam metabolismenya, bakteri ini akan memproduksi hormon insulin.
2. TEKNIK HIBRIDOMA/ Pembuatan Antibodimonoklonal dari sel kanker
dan sel limfosit
Teknik hibridoma adalah teknik pembuatan sel yang dihasilkan dari fusi
antara sel B limfosit dengan sel kanker.

Sifat dari sel hibridoma ini

adalah imortal. Dalam percobaan yang umum dilakukan, proses

pembuatan sel hibridoma dilakukan dengan menggunakan sel mieloma
NS-1 dan sel limpa dari mencit.
Proses pembuatan dari sel hibridoma :
a. proses imunisasi dengan menggunakan antigen tertentu yang
disuntikan ke
dalam tubuh mencit (Mus musculus)*
b. sel B-limfosit mencit akan merespon antigen sehingga terbentuk
antibodi .
c. pemisahan sel B-limfosit yang sudah mengandung antibodi dari
organ limpa mencit
d. sel B-limfosit kemudian difusikan dengan sel kanker immortal
menghasilkan
sel hibridoma
e. fusi sel hibridoma ini dilakukan dengan membuat membran sel
menjadi
lebih permeabel sehingga kedua sel bisa menyatu
f. sel hibridoma kemudian diklon pada kultur sel sehingga
dihasilkan banyak sel yang memiliki anti bodi tertentu sehingga
dikenal dengan antibodi monoklonal yang bisa disimpan lama
dalam keadaan dibekukan

GB. 5 Teknik hibridoma

3. TERAPI GENETIK
Terapi gen adalah

suatu

teknik

terapi

yang

digunakan

untuk

memperbaiki gen-gen mutan (abnormal/cacat) yang bertanggung

jawab terhadap terjadinya suatu penyakit. Pada awalnya, terapi gen
diciptakan untuk mengobati penyakit keturunan (genetik) yang terjadi
karena

mutasi

pada

satu

gen,

seperti

penyakit

fibrosis

sistik.

Penggunaan terapi gen pada penyakit tersebut dilakukan dengan

memasukkan gen normal yang spesifik ke dalam sel yang memiliki gen
mutan. Terapi gen kemudian berkembang untuk mengobati penyakit
yang terjadi karena mutasi di banyak gen, seperti kanker.

Selain

memasukkan gen normal ke dalam sel mutan, mekanisme terapi gen

lain yang dapat digunakan adalah melakukan rekombinasi homolog
untuk melenyapkan gen abnormal dengan gen normal, mencegah
ekspresi gen abnormal melalui teknik peredaman gen, dan melakukan
mutasi balik selektif sehingga gen abnormal dapat berfungsi normal
kembali.

4. KLONING
Kloning adalah penggunaan sel somatik makhluk hidup multiseluler
untuk membuat satu atau lebih individu dengan materi genetik yang
Gb. 6 Terapi
sama atau identik.
gen
Ada beberapa langkah dasar dalam Kloning Gen yaitu sebagai berikut :
a. Suatu frakmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon
diinsersikan pada molekul DNA sirkular yang di sebut sektor
untuk menghasilkan chimoera atau molekul DNA rekombiner.
b. Vektor bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk
kedalam sel tuan rumah (host) yang biasanya berupa bakteri,
walaaupun sel-sel jenis lain dapat di gunakan.

c. Didalam sel host, vektor mengadakan replikasi menghasilkan

banyak kopi atau turunan yang identik, baik vektornya sendiri
maupun gen yang dibawanya.
d. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA rekombinasi
diwariskan pada progeni dan terjadi replikasi vektor selanjutnya.
e. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan
f.

koloni atau klonsel host yang identik

Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu kopi atau lebih
molekul DNA rekombinasi dengan demikian dikatakan bahwa
gen yang dibawa oleh molekul rekombinasi telah diklon.

GB. 7 Kloning pada

domba dolly