Anda di halaman 1dari 4

Desain dan Sintesis Inhibitor Pfmrk yang Berpotensi sebagai Agen antimalarial

Abstrak
sintesis dan aktivitas penghambatan 10 inhibitor potensial Pfmrk, Plasmodium
falciparum cyclin-dependent protein kinase, dijelaskan. Inhibitor yang paling ampuh
adalah senyawa 3-fenil-quinolinone dengan nilai IC50 18mM. Ini adalah senyawa
yang pertama kali dilaporkan menghambat Pfmrk di kisaran molar mikro.
Malaria merupakan salah satu penyakit tropis yang paling serius dan
mempengaruhi 400 juta orang dengan 1-2 juta kematian setiap tahun. Selama
beberapa dekade terakhir, resistensi obat dalam parasit malaria telah menjadi
masalah kesehatan utama. Telah ada resistensi luas terhadap klorokuin, agen
antimalaria yang telah digunakan selama bertahun-tahun. Selain itu, resistensi
terhadap suphadoxine / pirimetamin, terapi lini pertama malaria, sekarang muncul
di beberapa negara Afrika. Oleh karena itu, pengembangan agen antimalaria baru
telah menjadi salah satu prioritas utama. Dari empat parasit malaria manusia
diketahui, Plasmodium falciparum adalah bentuk yang paling mematikan dan
penelitian biologi dasar dari parasit sudah mulai mencari target molekul baru untuk
pengembangan agen antimalaria baru.
Baru-baru ini, keluarga protein kinase [cyclin-dependent kinases (CDKs)] yang
mengontrol perkembangan siklus sel telah menjadi target potensial untuk
pengembangan obat. CDKs dilestarikan di antara spesies eukariotik dan beberapa
CDKs telah diisolasi dari Plasmodium falciparum. Karakterisasi terbaik Plasmodial
CDK adalah homolog Cdk1 manusia yang disebut PfPK5. Inhibitor Cdk1 manusia
seperti hymenialdisine, indirubin-3'-monooxime dan purvalanol menunjukkan
aktivitas penghambatan terhadap PfPK5. Pfmrk adalah karakterisasi lain Plasmodial
CDK yang menunjukkan homologi yang signifikan dengan CDK7 manusia. Pada
manusia, CDK7 menghubungkan dengan faktor transkripsi TFIIH dan mengatur
transkripsi DNA dan perbaikan. PfPK5 dan Pfmrk diidentifikasi sebagai target
potensial untuk pengembangan agen antimalaria.
Meskipun inhibitor PfPK5 telah diidentifikasi, inhibitor Pfmrk belum pernah
dilaporkan. Sebagian besar inhibitor CDK dirancang untuk bersaing dengan tempat
pengikatan ATP dari kinase. Diketahui ATP-kompetitif manusia inhibitor Cdk2
Olomoucine dan Roscovitine (Gbr. 1) gagal untuk menghambat Pfmrk. Kedua
inhibitor mengandung sistem cincin purin. Baru-baru ini, inhibitor kinase yang
mengandung gugus laktam seperti Oxindole dan Kenpaullone dilaporkan (Gambar.
1). Kenpaullone adalah inhibitor poten dari Cdk1, Cdk2, dan Cdk5 sementara
Oxindole adalah inhibitor selektif Cdk4. Tampaknya bahwa gugus laktam
tersubstitusi sangat penting dalam membentuk ikatan-H dengan tulang punggung
peptida di tempat pengikatan ATP. Pada Kenpaullone, aktivitas penghambatan Cdk1
nya menurun 50 kali lipat ketika nitrogen di gugus laktam termetilasi.

Dalam upaya untuk mengidentifikasi senyawa penuntun baru untuk menghambat


Pfmrk, kami merancang dan mensintesis 10 senyawa (1-10) mengandung gugus
laktam dengan lima kelas struktural yang berbeda sebagai inhibitor potensial Pfmrk
(Gbr. 2). Kelas struktural adalah: (1) 3-fenil-quinolinone (1 dan 2), (2) dihidro-indolo
quinolinone (3), (3) benzofuro (3,2-c) quinolinone (4-6), (4 ) benzopyrano (4,3-c)
quinolinone (7), dan (5) benzofuro (2,3-b) quinolinone (8-10).
Sintesis senyawa 3 dilakukan menurut prosedur pada literatur. Sintesis dari
senyawa 1 dan 2 ditunjukkan dalam Skema 1. Pereaksian aldehida 11 dengan 3metoksifenil asam asetat 12 menghasilkan E dan Z (2: 1) campuran o-nitro-a- (3metoksifenil) asam sinamat 13. hidrogenasi 13 diikuti oleh siklisasi intramolekul
diberikan pada dihydroquinolinone 14. Oksidasi 14 dengan DDQ diikuti
demethylation menghasilkan 16. Senyawa 1 diperoleh dengan mereaksikan 16
dengan methylbromoacetate diikuti dengan hidrolisis ester. Pereaksian 16 dengan
2-chloroethanol menghasilkan 2.

Senyawa 4-6 dan 8-10 disintesis dari jalur sintetis yang sama (Skema 2).
Pengadukan phenylacetate 18 dengan dietil oksalat pada suhu 60 C menghasilkan
19, dengan mengalami dekarbonilasi termal pada suhu 175 C untuk membentuk 20.
refluks 20 dengan anilin atau p-tersubstitusi anilin memberikan 21a-c. Senyawa

21a-c adalah intermediet untuk sintesis senyawa 4-6 dan 8-10. Sebagai contoh,
refluks 21a di anhidrat piridin hidroklorida menghasilkan campuran 4 dan 8 dalam
rasio 2: 5.

Senyawa 7 disintesis seperti yang ditunjukkan dalam Skema 3. Pemanasan isatin


22, 2-metoksifenil asam asetat 23 dengan natrium asetat pada 200-230 C selama
50 menit menghasilkan senyawa 24. Esterifikasi intramolekuler dari 24 dalam
anhidrat piridin hidroklorida pada refluks menghasilkan 7.
Kami telah mengembangkan microtiter plate drug screen untuk mengidentifikasi
inhibitor Pfmrk. Aktivitas Pfmrk diuji dengan Pfcyc1, plasmodial cyclin yang
merangsang aktivitas Pfmrk. Wilayah terminal karboksi RNA polimerase II (CTD)
digunakan sebagai substrat karena telah terbukti lebih menguntungkan daripada
Histon H1 (hasil tidak dipublikasikan). Singkatnya, Pfmrk dan Pfcyc1 diekspresikan
dan dimurnikan dari Escherichia coli seperti yang dilaporkan sebelumnya. Filter obat
kinase dilakukan dalam uji pelat filter 96-well . Pengujian dimulai dengan
menginkubasi Pfmrk (4 mg) dan obat dalam buffer kinase (50mm Tris-HCl pH 7,5,
10mm MgCl2, 1mM DTT), 3mg Pfcyc1 dan 10mg CTD selama 5 menit pada suhu 30
C untuk memfasilitasi pengikatan obat dan diikuti dengan penambahan [g -32P] ATP
(5mCi, 3000Ci mmol / mL). Campuran diinkubasi pada 30 C selama 30 menit.
Setelah inkubasi, cawan dicuci dalam manifold vakum dengan enam kali pencucian
berturut-turut 200ml asam fosfat 5% per sumur. Setelah pencucian terakhir, cairan
kilau ditambahkan dan cawan dianalisis dalam Topcount microtiter plate scintillation
counter (Packard). Setiap reaksi dilakukan dalam rangkap tiga dan kontrol
dimasukkan pada setiap cawan untuk mengurangi latar belakang dari reaksi.
Hitungan per menit untuk setiap set reaksi rata-rata dengan variasi kurang dari 5%.
Setiap inhibitor diuji pada rentang konsentrasi untuk penentuan respon dosis dan
perhitungan nilai IC50. Nilai IC50 dari inhibitor ditunjukkan pada Tabel 1.

Kisaran nilai IC50 dari 18 sampai 539 mM. Nilai IC50 inhibitor 6, 7 dan 10 tidak
dapat ditentukan karena masalah kelarutan. Senyawa yang mengandung kelas
struktur dihidro-indolo quinolinone (3) dan benzofuro (3,2-c) quinolinone (4-6) tidak
ditoleransi oleh enzim. Inhibitor 3 dan 4 tidak menunjukkan adanya aktivitas
penghambatan. Subtitusi H dengan gugus OH pada posisi 2 dari keempat hasil
inhibitor (5) dengan aktivitas penghambatan sangat lemah (539mM). Benzofuro
(2,3-b) quinolinones (8 dan 9) menunjukan aktivitas penghambatan yang kecil
(<371 dan 187 mM). Peningkatan derajat rotasi dari pelepasan pada inhibitor (1 dan
2) meningkatkan aktivitas penghambatan. Inhibitor yang paling ampuh (2) memiliki
nilai IC50 18 mM. Inhibitor 2 adalah senyawa pertama kali dilaporkan menghambat
Pfmrk dan pada kisaran mM. Telah diidentifikasi sebagai senyawa utama untuk
penghambatan Pfmrk dan studi hubungan aktivitas struktur yang detail dari
inhibitor sedang berlangsung.