BAB I

PENDAHULUAN
Perbedaan antara konsentrasi glukosa pre- dan post-prandial pada wanita
diabetes dengan kontrol baik 10 kali lebih baik dibandingkan dengan wanita nondiabetes. Konsentrasi glukosa dalam cairan tuba dan uterus secara langsung
berhubungan dengan kadar glukosa dalam plasma,1

maka dari itu dapat

dihipotesis bahwa pada wanita diabetes dengan kontrol yang baik embrio
mungkin masih terpapar kadar glukosa yang tinggi secara intermiten selama
perkembangan dalam saluran reproduksi. Selain itu, paparan kadar glukosa yang
tinggi, secara mutlak hiperglikemia, mungkin mencetuskan tekanan pada
preimplantasi embrio, membahayakan perkembangannya dan berkontribusi
terhadap peningkatan insiden malformasi fetal pada wanita diabetes dengan
kontrol yang baik.2
Mekanisme dari diabetes pencetus embriopati sudah menjadi subjek
pada banyak penelitian diabetes yang biasanya pada model rodent. Penelitian
tersebut menunjukan bahwa pada ibu diabetes dengan kelainan metabolisme dan
hiperglikemia akan menganggu embriogenesis

pada masa awal tahap

perkembangan preimplantasi. Pada Blastokista (hari ke 4 kehamilan) hewan

diabetes, peningkatan fragmentasi inti sel, pengurangan jumlah inner cell mass
(ICM) dan peningkatkan insidensi apoptosis ICM lebih tinggi dibandingkan
dengan hewan non diabetes.3-8
Selain

itu,

pada

hewan

diabetes

perkembangan

trofoblas

juga

terhambat.9,10 De Hertough et al (1991) juga menambahkan bahwa pada tikus

diabetes terjadi pengurangan jumlah total embrio.5 Walaupun pada tikus diabetes
yang diberi insulin memiliki jumlah total embrio yang signifikan lebih rendah
dibandingkan dengan tikus non diabetes, namun insulin tetap diberikan untuk
mencegah diabetes embriopati.6
Percobaan in vitro yang menggunakan model rodent juga sudah dilakukan
untuk mengidentifikasi agen teratogenik dan hubungan yang mendasari

mekanisme embriopati diabetes selama peroide preimplantasi. Faktor penting

diantaranya termasuk hiperglikemia, tetapi juga tingginya kadar keton, reactive
oxygen species (ROS) dan tumor necrosis factor alpha ikut berperan.11-15
Percobaan pada kultur embrio dengan konsentrasi glukosa yang tinggi
(20-52mM) menunjukan inhibisi perkembangan blastokista, proliferasi sel dan
diferensiasi sel, serta meningkatkan apoptosis sel dan berpengaruh pada kadar
metabolit intraembrionik.3,5,11,16,17
Hiperglikemia dihubungkan bertentangan dengan regulasi Glucose
Transporter 1 (GLUT 1), GLUT 2 dan GLUT 3 dalam blastokista, pengurangan
aktivitas glikolitik dan menurunkan kadar glukosa bebas intraembrionik.10,16,17
Peningkatan kadar ROS dan stimulasi ekpresi dari gen pro-apoptotic (p53
dan Bax)12,21 dan efektor apoptotic intraselular (caspase-3 dan caspase-activated
deoxyribonuclease) menyebabkan pengurangan jumlah ICM.18

BAB II
PEMBAHASAN
2.1. 1

Determinasi Konsentrasi Glukosa yang Menyebabkan Embriopati

2.1.1. 1 Efek pada Perkembangan Preimplantasi

Penilaian tahap preimplantasi pada peneiltian ini meliputi
perkembangan morfologi sel blastokista, diferensiasi balstosis dan
penilaian tingkat apoptosis sel. (Gambar 1).

Gambar 1.
Assessment of
embryo development
(A) Blastocyst stained using 4,6Diamidino-2-phenylindole (scale
bar 50 m) for assessment of cell
proliferation. (B) Blastocyst
stained
using
terminal
deoxynucleotidyl
transferasemediated dUTP nick end labeling (scale bar 50 m) for assessment of cell death
(apoptosis). (C) Dual stained blastocyst (scale bar 20 m) for assessment of cell
differentiation
Penilaian

pada

tahap

peri-implantasi,

yaitu

dengan

mengamati penempelan blastokista, perkembangan morfolosi sel

blastokista, tingkat proliferasi sel, diferensiasi sel, apoptosis sel dan
tingkat pertumbuhan trofoblas. (Gambar 2).

Gambar 2 : Trophoblast outgrowth (scale bar 50 m)

(A) No trophoblast outgrowth, the embryo is highly compacted and raised. (B)
Slight trophoblast outgrowth, the embryo is highly compacted and raised with a
small area of flat growth. (C) Moderate trophoblast outgrowth, the embryo is less
compacted and is not as raised with an extended area of flat growth. (D)
Significant trophoblast outgrowth, the embryo is predominately flat.
Blastokista hasil pembilasan saluran telur tikus percobaan
ditempatkan pada 2 media buatan, yaitu KSOM (saluran telur buatan
yang diperkaya oleh potasium dengan penurunan 50% asam amino)
dan mKSOM (saluran telur buatan yang diperkaya oleh potasium).
Pada hari ke 5 post fertilisasi tingkat perkembangan blastokista
secara signifikan lebih besar pada KSOM (61,2%) dibandingkan
pada mKSOM (45.6%). Untuk selanjutnya media KSOM dipilih
untuk percobaan ini.
Dalam percobaan ini, pada tahap blastokista tidak ditemukan
adanya efek peningkatan konsentrasi glukosa pada perkembangan
morfologi sel embrio. Hal ini menjelaskan terjadi penurunan tingkat

perkembangan blastokista. Peningkatan konsentrasi glukosa (0.2-25

mM) menghasilkan perbedaan signifikan pada perkembangan
blastokista ketika embrio dikultur dari tahap 2 sel. (Tabel 1)

Tabel 1. The effect of increasing the concentration of glucose in

embryo culture medium on the percentage of expanded blastocysts, the
percentage of hatching blastocysts and blastocyst cell number on Day
5 pf.
Glucose
concentration
(mM)
0.2
5.56
15.56
25.56

Expanded
blastocysts (%)
64.8
64.4
56.8b
46.1b

Hatching
(%)
39.7
38.7
23.4c
17.2c

Total cell number

Mean
n
SEM
36 71.1 4.4
36 54.6 3.5a
30 57.4 3.5a
24 51.3 3.3a
P < 0.002

Total cell number significantly different to 0.2 mM glucose culture.

% Expanded blastocysts significantly different to 0.2 and 5.56 mM

cultures. (2, P <0.005).
c

% Hatching significantly different to 0.2 and 5.56 mM cultures( 2, P <

0.001).

Pada preimplantasi embrio hari ke 5 post fertilisasi dengan

pajanan glukosa yang tinggi menghasilkan blastokista yang lebih
sedikit dibandingkan dengan embrio kontrol (kultur dalam glukosa
5.56

mM).

Selain

itu,

peningkatan

konsentrasi

glukosa

menyebabkan gangguan pada alokasi sel, pengurangan jumlah sel

Inner cell mass (ICM) dan trophectoderm (TE) pada hari ke 5 post
fertilisasi. Rasio sel ICM : TE berbeda secara signifikan pada
kontrol kultur 5.56 mM. (Tabel 2)

Tabel 2. The Effect of Increasing The Concentration of Glucose in Embryo

Culture Medium on Cell Allocation and Ratio on Day 5 pf.
Day 5
Glucose
concentratio
n (mM)
n

Ratio
Total
ICM
TE
(ICM:TE)
12.63
0.2756
0.2
46 69.16 3.526 0.921
56.09 3.381 0.033
55.51
15.02
40.48
0.4335
5.56
46 2.803a
1.106
2.607b
0.042c
54.51
11.57
42.94
0.2880
15.56
42 2.707a
0.920
2.376b
0.027d
49.94
9.943
40.00
0.2706
a
e
b
25.56
35 2.492
0.895
2.319
0.026d
P < 0.01
P < 0.01
P < 0.01
P < 0.05
Values are expressed as Mean SEM. ICM, inner cell mass; TE, trophectoderm.
a

Significantly different to 0.2 mM glucose cultures (P < 0.01).

Significantly different to 5.56 mM glucose cultures (P < 0.01).

Significantly different to 0.2 mM glucose culture (P < 0.01).

Significantly different to 0.2 mM glucose culture (P < 0.01).

Significantly different to 5.56 mM glucose culture (P < 0.05).

Apoptosis sel tidak begitu dipengaruhi oleh peningkatan

konsentrasi glukosa. Pada embrio kontrol positif secara konsisten
menjadi mayoritas (>90%) terjadinya apoptosis sel. (Tabel 3)
Tabel 3.The Effect of Increasing the Concentration of Glucose in Embryo
Culture Medium on Cell Apoptosis on Day 5 pf.
Values are expressed as Mean SEM.
Day 5
Glucose
concentration (mM)
0.2
5.56
15.56
25.56

Total cell
No of
n number
apoptotic cells
43 66.9 4.0
5.4 0.7
43 59.5 3.0
4.6 0.7
35 49.8 3.5a
3.7 0.7
36 42.6 3.2a,b
3.4 0.6
P < 0.001
NS
a
Significantly different to 5.56 mM glucose cultures.

% Apoptotic cells
7.7 1.0
7.5 1.1
7.0 1.0
7.3 1.2
NS

Significantly different to 0.2 mM glucose cultures.

Hasil percobaan pada jurnal ini menunjukkan bahwa pada
tahap preimplantasi dengan kadar glukosa yang tinggi menyebabkan
pengurangan jumlah sel ICM dan sel TE yang selanjutnya
menghambat terbentuknya embrio.

2.1.2. 1 Efek pada Perkembangan Peri-Implantasi

Pada hari 8 post fertilisasi, peningkatan konsentrasi glukosa
akan menurunkan jumlah sel di dalam blastokista tetapi tidak
mengurangi jumlah sel dipermukaan blastokista. Selain itu,
peningkatan konsentrasi glukosa menyebabkan penurunan densitas
sel dalam blastokista dan berefek secara signifikan meningkatkan
pertumbuhan trofoblas. (Tabel 4)
Tabel 4. The Effect of Increasing The Concentration of Glucose in Embryo

Culture Medium on Median Cell Number (MCN), Surface Area (SA) and Cell
Density on Day 8 pf.
Glucose
concentration (mM) n

MCN
103.8
0.2
30
12.10
116.9
5.56
75
8.464
105.9
15.56
39
8.490
73.00
25.56
31
7.731a
P < 0.01
Values are expressed as mean SEM.

SA (104
m)
7.047
0.4967
7.177
0.4079
7.128
0.5222
6.455
0.5244
NS

Cell density
(MCN/SA)
19.75 0.4012
21.33 2.618
18.52 2.201
11.49 0.9133b
P < 0.05

Significantly different to 5.56 mM glucose culture (P < 0.01).

Significantly different to 5.56 mM glucose culture (P < 0.05).

Peningkatan

konsentrasi

glukosa

secara

signifikan

menyebabkan penurunan jumlah embrio yang mengandung ICM

(P<0.01). Pada kultur dengan konsentrasi glukosa 0.2 dan 5.56 mM,
didapatkan 80% embrio mengandung ICM. Sedangkan pada kultur
dengan konsentrasi glukosa 15.56 dan 25.56 mM hanya 60.5% dan
31.3% mengandung ICM.

2.2.1

Determinasi Periode Rentan Teratogenik Selama Perkembangan

Preimplantasi
Percobaan yang diuraikan diatas menunjukan bahwa efek embriopati
maksimal pada konsentrasi glukosa 25.56 mM. Oleh karena itu, embrio tikus
yang terpapar konsentrasi glukosa 25.56 mM selama 24 jam dan 48 jam
antara hari ke 2 dan 5 post fertilisasi digunakan untuk memeriksa pajanan

glukosa relatif yang dapat menyebabkan embriopati. (Gambar 3)

Gambar 3. Effect of Increasing The Concentration of Glucose in Embryo
Culture Media on Percentage of 2-Cell Embryos Forming Blastocysts by Day 5
pf.
*Significantly different to control culture (2, P < 0.001) Control embryos were
cultured in 5.56 mM glucose for the duration of the experiment.

Proliferasi sel secara signifikan terhambat pada embrio yang terpajan

oleh glukosa 25.56 mM selama 48 jam pada akhir percobaan tetapi tidak
terjadi pada awal percobaan. Selain itu, tidak ada efek signifikan pada
apoptosis sel ketika embrio terpajan oleh konsentrasi glukosa yang tinggi
selama 48 jam antara hari ke 2 dan ke 4. Selain itu, pada awal pajanan
percobaan tersebut tidak ditemukan adanya alokasi sel yang diamati ketika
embrio terpajan oleh konsentrasi glukosa 25.56 mM selama 48 jam. (Tabel 5)

Tabel 5. The Effect of Exposure to High Glucose in Embryo Culture Medium for
Either a 24 h or a 48 h Period on The Total Cell Number, Cell Allocation and
Cell Ratio on Day 5 pf.
Glucose concentration of
medium H = 25.56 mM, L = 5.56
mM
Total
Da Da Da
cell
y1 y2 y3 n
number
Expt
69.1
1
Control L L
L 41 2.9
Early
62.7
24 h
H L
L 35 3.2
Late 24
60.0
h
L L
H 36 3.6
Expt
62.3
2
Control L L
L 42 5.3
Early
54.6
48 h
H H L 35 4.6
Late 48
35.8
h
L H H 25 4.6a
Expt
53.7
3
Control L L
L 84 2.2
Mid 24
47.2
h
L H L 41 2.7
Split
40.6
48 h
H L
H 42 1.6d
Values are expressed as mean SEM.

ICM
16.6
1.1
16.5
1.3
13.7
1.0
15.5
1.6
12.6
1.5
7.9
1.4b
11.7
0.9
9.0
1.0
7.3
0.6e

TE
52.6
2.3
38.4
2.8
38.9
3.2
46.8
4.3
42.1
3.5
27.9
3.0c
41.3
1.7
39.2
2.7
31.8
1.7f

Ratio
(ICM:TE)
0.32 0.02
0.36 0.02
0.31 0.03
0.38 0.04
0.30 0.03
0.30 0.05
0.29 0.02
0.26 0.03
0.25 0.02g

Significantly different to Expt 2 control and early 48 h (P < 0.005).

Significantly different to Expt 2 control (P < 0.01).

Significantly different to Expt 2 control and early 48 h (P < 0.01).

Significantly different to Expt 3 control (P < 0.001).

10

Significantly different to Expt 3 control and mid 24 h (P < 0.01).

Significantly different to Expt 3 control (P<0.01).

Significantly different to mid 24 h (P < 0.01).

Pada sistem kultur konsentrasi glukosa 0.2 dan 5.56 mM

meningkatkan pertumbuhan blastokista pada hari ke 5 post fertilisasi. Kadar
glukosa darah yang lebih tinggi dari itu dihubungkan dengan kegagalan dari
proses tersebut. Pada kultur hiperglikemia jumlah total sel dan alokasi sel
terhambat.
Percobaan sebelumnya juga melaporkan bahwa pada blastokista
tikus diabetes terjadi peningkatan apoptosis terutama pada ICM yang
selanjutnya meningkatkan insiden terjadinya malformasi.6
Di sisi lain, telah disampaikan bahwa induksi faktor anti apoptotik
Bcl-2 dalam menanggapi hiperglikemia dan mekanisme yang mirip dengan
hal ini dapat menjelaskan kenapa tidak adanya penambahan apoptosis
tertentu yang terlihat dalam percobaan kami.19
Hasil pengamatan kita menunjukan bahwa peningkatan konsentrasi
glukosa tidak memiliki efek signifikan pada jumlah sel apoptotik atau
proporsi dari sel apoptotik. (Tabel 6). Hal ini tentu sangat berbeda tajam
dengan penelitian yeng telah diterbitkan sebelumnya.20-22
Tabel 6. The Effect of Exposure to High Glucose in Embryo Culture Medium for
Either a 24h or a 48 h Period on The Total Cell Number and Cell Apoptosis on
Day 5 pf.
Glucose concentration of medium H
= 25.5 6mM, L = 5.56 mM
Da Da Da
y1 y2 y3 n
Expt 1 Control L
L L 36
Early 24
h
H L L 33
Late 24 h L
L H 32
Expt 2 Control L
L L 34

No of
Total cell apoptotic
number
cells
52.1 3.7 3.8 0.6

% Apoptotic cells
7.1 1.2

58.6 3.6 3.9 0.6

48.3 3.3 3.8 0.8
50.0 3.0 2.5 0.4

7.1 1.2
7.5 1.5
5.3 1.0

11

Early 48
h
Late 48 h
Expt 3 Control
Mid 24 h
Split 48 h

H
L
L
L
H

H
H
L
H
L

L
H
L
L
H

29
37
56
52
32

52.0 3.6
41.5 2.9a
57.5 3.3
49.3 3.5
52.8 3.3
P < 0.05

2.9 0.9
2.4 0.4
4.3 0.9
3.3 0.5
3.5 0.5
NS

5.1 1.4
6.3 1.1
8.1 1.0
7.3 0.9
7.2 1.1
NS

Values are expressed as mean SEM.

a

Significantly different to Experiment 2 Control.

Hal ini mungkin terjadi akibat perbedaan desain percobaan, seperti
pada Jiemenez et al. (2003), sebelum menilai tingkat kematian sel, awalnya
embrio dikultur pada konsentrasi glukosa yang normal lalu konsentrasi
glukosa ditingkatkan.20 Sedangkan pada percobaan dalam jurnal ini, sebelum
menilai tingkat kematian sel, sel embrio terpajan konsentrasi glukosa yang
bervariasi secara terus menerus.

BAB III
KESIMPULAN
Pada awal perkembangan embrio pajanan hiperglikemia selama > 24 jam
bersifat toksis. Penemuan ini mungkin menjelaskan bahwa terdapat peluang lebih
rendah terjadinya tingkat implantasi dan terdapat peluang lebih tinggi terjadinya
kelainan kongenital dan keguguran yang tampak pada pasien diabetes, terutama
dengan kontrol diabetes yang buruk.
Proses yang mendasari gangguan pada awal perkembangan embrio
dengan pajanan hiperglikemia tersebut adalah pengurangan jumlah sel blastokista
terutama inner cell mass dengan cara menghambat proliferasi sel dan diferensiasi
sel tanpa peningkatan apoptosis dalam blastokista Namun, tidak terjadi gangguan
pertumbuhan trofoblas.

12

DAFTAR PUSTAKA
1.

Leese H. The Formation and Function of Oviduct Fluid. J Reprod Fert

1981;82:843-856.

2.

DAFNE Study Group. Training in Flexible, Intensive Insulin Management to

Enable Dietary Freedom in People With Type 1 Diabetes: Dose Adjustment
for Normal Eating (DAFNE) Randomised Controlled Trial. BMJ
2002;325:746-751.

3.

Pampfer S, de Hertogh R, Vanderheyden I, Michiels B, Vercheval M.

Decreased Inner Cell Mass Proportion in Blastocysts from Diabetic Rats.
Diabetes 1990;39:471-476.

4.

Vercheval M, De Hertogh R, Pampfer S, Vanderheyden I, Michiels B, De

Bernardi P, De Meyer R. Experimental Diabetes Impairs Rat Embryo
Development

During

The

Preimplantation

1990;33:187-191.

13

Period.

Diabetologia

5.

De Hertogh R, Vanderheyden I, Pampfer S, Robin D, Dufrasne E, Delcourt J.

Stimulatory and Inhibitory Effects of Glucose and Insulin on Rat Blastocyst
Development In Vitro. Diabetes 1991;a40:641-647.

6.

Moley KH, Vaughn WK, DeCherney AH, Diamond MP. Effect of Diabetes
Mellitus on Mouse Preimplantation Embryo Development. J Reprod Fertil
1991;93:325-332.

7.

Moley KH, Chi MM, Mueckler MM. Maternal Hyperglycemia Alters

Glucose Transport and Utilization In Mouse Preimplantation Embryos. Am J
Physiol1998;a275:E38-E47.

8.

Lea RG, McCraken JE, McIntyre SS, Smith W, Baird JD. Disturbed
Development of The Preimplantation Embryo in The Insulin-Dependent
Diabetic BB/E Rat. Diabetes1996;45:1463-1470.

9.

Pampfer S, Wuu YD, Vanderheyden I, De Hertogh R. In Vitro Study of The

Carry-Over Effect Associated With Early Diabetic Embryopathy in The Rat.
Diabetologia1994;a37:855-862.

10. Leunda-Casi A, De Hertogh R, Pampfer S. Decreased Expression of

Fibroblast Growth Factor-4 and Associated Dysregulation of Trophoblast
Differentiation in Mouse Blastocysts Exposed to High D-Glucose in Vitro.
Diabetologia 2001;44:1318-1325.
11. Zusman I, Yaffe P, Ornoy A. Effects of Metabolic Factors in The Diabetic
State of The In Vitro Development of Preimplantation Mouse Embryos.
Teratology1987;35:77-85.
12. Pampfer S, Moulaert B, Vanderheyden I, Wuu YD, De Hertogh R. Effect of
Tumor Necrosis Factor Alpha on Rat Blastocyst Growth and Glucose
Metabolism. J. Reprod Fert 1994;c101:199-206.
13. Pampfer S, Vanderheyden I, Wuu YD, Baufays L, Maillet O, DeHertogh R.
Possible Role for TNF-Alpha in Early Embryopathy Associated with
Maternal Diabetes in The Rat.Diabetes 1995;44:531-536.
14. Moley KH, Vaughn WK, Diamond MP. Manifestations of Diabetes Mellitus
on Mouse Preimplantation Development: Effect of Elevated Concentration of
Metabolic Intermediates. Hum Reprod 1994;9:113-121.

14

15. Wuu YD, Pampfer S, Vanderheyden I, Lee KH, De Hertogh R. Impact of

Tumor Necrosis Factor Alpha on Mouse Embryonic Stem Cells. Biol Reprod
1998;58:1416-1424.
16. Moley KH, Chi MM-Y, Kuudson CM, Karsmeyer SJ, Muekler MM.
Hyperglycemia Induces Apoptosis in Pre-implantation Embryos Through
Cell Death Affected Pathways. Nat Med 1998;b4:1421-1424.
17. Moley KH. Hyperglycemia and Apoptosis: Mechanisms for Congenital
Malformations and Pregnancy Loss in Diabetic Women. Trends Endocrinol
Metab2001;l2:78-82.
18. Hinck L, Van Der Smissen P, Heusterpreute M, Donnay I, De Hertogh R,
Pampfer

S.

Identification

of

Caspase-3

and

Caspase-Activated

Deoxyribonuclease in Rat Blastocysts and Their Implication in The

Induction of Chromatin Degradation (But Not Nuclear Fragmentation) by
High Glucose. Biol Reprod 2001;64:555-562.
19. Pampfer S, Cordi S, Vanderheyden I, Van Der Smissen P, Courtoy PJ, Van
Caurenberge A, Alexandre H, Donnay J, De Hertogh R. Expression and Role
of Bc1-2 in Rat Blastocysts Exposed to High D-Glucose. Diabetes
2001;50:143-149.
20. Jimenez A, Madrid-Bury N, Fernandez R, Perez-Garnelo S, Moreira P,
Pintado B, De La Fuente J, Gutierrez-Adan A. Hyperglycaemia-Induced
Apoptosis Affects Sex Ratio of Bovine and Murine Preimplantation
Embryos. Mol Rep Dev 2003;65:180-187.
21. Keim AL, Chi MM, Moley KH. Hyperglycemia-Induced Apoptotic Cell
Death in The Mouse Blastocyst Is Dependent on Expression of p53. Mol
Reprod Dev 2001;60:214-224.
22. Chi MMY, Hoehn A, Moley KH. Metabolic Changes in The Glucose Induced
Apoptotic Blastocyst Suggest Alterations in Mitochondrial Physiology. Am J
Physiol Endocinrol Metab 2002;283:E226-E232.

15