Anda di halaman 1dari 10

Percobaan IV

Penetapan Kadar Protein Secara Biuret dan Uji Protein


Tujuan
Mahasiswa dapat melakukan penetapan kadar protein dengan metode
Biuret
Dasar Teori
Penentuan

kadar

protein

secara

Biuret

berdasarkan

atas

pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang warnanya ungu.


Ini terjadi apabila protein bereaksi dengan tembaga dalam lingkungan
alkali.
Bahan
1. Reagen Biuret. Larutkan 1,5 g kupri sulfat (CuSO 4 5H2), Na-Ktartrat
dalam 500 ml air dalam labu takar 1 liter. Kemudian tambahkan 300
ml NaOH 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan air
sampai garis tanda. Larutan biru ini dapat disimpan lama. Apabila
pembuatannya kurang baik dapat terjadi endapan hitam atau merah.
Reagen yang demikian tidak boleh dipakai.
2. Larutan standar protein. Buatlah larutan serum albumin murni atau
kasein dalam air yang berkadar 10 mg/ml. Untuk mempermudah
larutnya aalbumin tambahkan beberapa tetes NaOH 3%.
Cara Kerja
Pipet ke dalam tabung reaksi 1 ml larutan yang mengandung 10
mg/ml. Tambahkan 4 ml reagen Biuret. Kocok dan diamkan selama 30
menit pada suhu kamar. Baca serapannya pada 540 nm. Untuk blanko
dipakai campuran 1 ml air dan 4 ml reagen Biuret yang juga didiamkan
selama 30 menit pada suhu kamar. Hukum Lambert-Beer berlaku untuk
larutan-larutan protein antara 1 dan 10 mg/ml. Buatlah kurva baku dan
tetaplah kadar larutan protein yang diberikan.
Untuk protein padat

Bahan yang akan dianalisis dilarutkan dahulu, misalnya dengan


alkali encer. Sesudah itu ditentukan

seperti pada cara di atas. Pada

protein yang sukar larut, seringkali diperlukan alkali 1 N, bahkan kadangkadang masih perlu dipanasi selama 10 menit atau lebih pada 100 oC.
Buatlah kurva baku dan tentukan kadar larutan protein yang diberikan.
Cara Kerja
1. Membuat larutan standar albumin dengan menimbang albumin
sebanyak 100 mg dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml, tambahkan
air suling sedikit untuk membasahi albumin (jangan dikocok untuk
menghindari pembuihan), kemudian tambah air suling sampai tanda.
2. Membuat kurva baku albumin dengan kadar 100-700 g/ml dengan
komposisi seperti pada tabel:
N
o.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Albumin (mL)
0,1
0,2
0,3
0,5
0,6
0,7
1 mL susu
putih/ putih
telur

Air
(mL)
0,9
0,8
0,7
0,5
0,4
0,3
1
-

Reagen Biuret
(mL)
4
4
4
4
4
4
4
4

Keteran
gan
Standar
Standar
Standar
Standar
Standar
Standar
Blanko
Sampel

Diamkan selama 30 menit diamati serapannya pada panjang gelombang


540 nm.
3. Penetapan kadar protein sampel (lihat tabel diatas) :
Sampel dapat terdiri atas : putih telur, air susu, perasan tumbuhan, dll.
Sampel dikerjakan sebagai berikut : 1 ml sampel ( hasil pengenceran
atau sampel asli) tambahkan 4 ml reagen Biuret, kocok dan biarkan
paling sedikit 30 menit pada suhu kamar. Baca/ukur serapannya pada
panjang gelombang 540 nm.
Reaksi Uji Protein
Tujuan

: Mahasiswa dapat melakukan pengujian/sifat-sifat protein

a. Pengendapan Protein oleh Garam Anorganik


Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein
ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi
karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi
kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk
mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah
air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang.
Bahan:
ammonium sulfat, pereaksi Millon (150 gr/l larutan merkuri sulfat
dalam 15% asam sulfat), pereaksi Biuret, susu
Cara Kerja:
1. Jenuhkan 10 ml larutan protein dengan ammonium sulfat, dengan
cara penambahan Amonium sulfat kristal sedikit demi sedikit, aduk
hingga larut. Tambah dan aduk lagi sehingga sedikit garam
ammonium yang tertinggal tidak larut lagi (terbentuk larutan lewat
jenuh). Saring.
2. Uji kelarutan endapan dalam pereaksi Millon dan pada filtratnya
tambahkan pereaksi Biuret.
Tabung
I (endapan)
II (filtrat)
b.

Pereaksi
Millon
Biuret

Hasil

Keterangan

Uji Koagulasi
Protein dengan penambahan asam atau pemanasan akan terjadi
koagulasi. Pada pH iso-elektrik (pH larutan tertentu biasanya berkisar
4 4,5 dimana protein mempunyai muatan positif dan negatif sama,
sehingga saling menetralkan) kelarutan protein sangat menurun atau
mengendap. Pada temperatur diatas 60oC kelarutan protein akan
berkurang (koagulasi) karena pada temperatur yang tinggi energi
kinetik molekul protein meningkat sehingga terjadi getaran yang
cukup kuat untuk merusak ikatan atau struktur sekunder, tertier dan
kuartener yang menyebabkan koagulasi.
Bahan:

Asam asetat 1M, pereaksi Millon; susu


Cara Kerja:
1. Ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml larutan protein
ditambahkan dua tetes asam asetat 1M.
2. Letakkan tabung dalam air mendidih selama lima menit.
3. Ambil endapan dan ujilah kelarutannya dalam air dan pereaksi
millon.
Tabung
I (endapan)
II (endapan)
c.

Pereaksi

Hasil

Keterangan

Air
Millon

Pengendapan dengan Alkohol


Protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Pelarut
organik akan mengubah (mengurangi) konstanta dielektrika dari air,
sehingga kelarutan protein berkurang, dan juga karena alkohol akan
berkompetisi dengan protein terhadap air.

Bahan:
HCl 0,1 M; NaOH 0,1 M; Buffer asesat 1M (pH 4,7); Etanol 95%, susu
Cara Kerja:
1. Sediakan 3 tabung reaksi dan isi masing- masing tabung reaksi dengan
5ml larutan protein.
2. Ke dalam tabung
I

: tambahkan 1ml HCl 0,1M dan 6ml etanol 95%

II

: 1ml NaOH 0,1M dan 6ml etanol 95%

III : 1ml Buffer asetat dan 6ml etanol 95%


3. Lihat tabung-tabung mana yang tidak larut.
Tabung

Pereaksi

Hasil

Keteranga
n

I (5 mL

1 mL HCL 0,1 N

protein)

6 mL etanol

II (5 mL

95%
1 mL NaOH 0,1

protein)

N
6 mL etanol

III (5 mL

95%
1 mL buffer

protein)

asetat
6 mL etanol
95%

d.

Denaturasi Protein
Denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen,
ikatan garam atau bila susunan ruang atau rantai polipetida suatu
molekul protein berubah. Dengan perkataan lain denaturasi adalah
terjadi kerusakan struktur sekunder, tertier dan kuartener, tetapi
struktur primer (ikatan peptida) masih utuh.

PERCOBAAN V
ASAM NUKLEAT (ISOLASI DAN ELEKTROFORESIS DNA)
PENDAHULUAN
Asam nukleat terdiri atas molekul DNA (Deoxyribose Nucleic Acid)
dan RNA (Ribose Nucleic Acid) yang berperan penting sebagai penentu
faktor

hereditas

yang

menentukan

metabolisme makhluk hidup.


utama, yaitu

struktur

protein

dan

proses

Molekul DNA disusun oleh 3 komponen

gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat, membentuk

rantai panjang yang disebut nukleotida.

Rantai DNA akan membentuk

ikatan rangkap heliks ganda (double helix) dengan pasangan rantai


antiparalelnya, dimana basa nitrogen dari kedua rantai polinukleotida
saling berpasangan dalam pasangan yang tetap (A-T dan G-C) melalui
ikatan hidrogen. Rantai DNA double helix yang panjang akan menata
dirinya sedemikian rupa sehingga membentuk kromosom. Kromosom ini
ditemukan di dalam nukleus, mitokondria, dan kloroplas.
Proses isolasi DNA membutuhkan beberapa tahapan mulai dari
penghancuran sel, ekstraksi, pemurnian dan presipitasi DNA. Tahapantahapan di atas melibatkan proses mekanik dan kimia. Proses mekanik
dilakukan pada tahap awal pengrusakan jaringan dan dinding sel
menggunakan homogenizer, mortar, dan sentrifus, sedangkan proses
kimiawi dilakukan dengan menambahkan zat-zat kimia tertentu yang
dapat merusak membran sel dan membran inti.
Secara

sederhana

isolasi

DNA

dapat

dilakukan

dengan

menggunakan deterjen. Struktur deterjen yang memiliki rantai hidrofobik


dan kepala hidrofil akan memudahkan berinteraksi dengan struktur
membran sel ataupun membran inti yang juga memiliki sifat sama dengan
deterjen. Interaksi yang terjadi akan mengganggu integritas membran
dan pada akhirnya merusak struktur membran sel. Dengan rusaknya
struktur membran, maka molekul atau komponen dari dalam sel akan
keluar, salah satunya adalah DNA.

Keberhasilan mengisolasi DNA/RNA dapat dimonitor dengan teknik


elektroforesis gel. Teknik analisis ini berguna untuk melihat ada/tidaknya
isolat

DNA

dan

untuk

mengetahui

ukuran

molekul

DNA.

Metode

elektroforesis gel dengan menggunakan agarosa akan memisahkan DNA


berdasarkan ukuran molekulnya dengan bantuan aliran listrik. Molekulmolekul DNA akan bermigrasi di dalam gel agarosa dari arah kutub listrik
negatif ke arah kutub positif. Kecepatan migrasi bergantung dari ukuran
molekul DNA sendiri, kekuatan buffer, konsentrasi gel agarosa, dan
besarnya tegangan listrik yang digunakan. Ketika fragmen-fragmen DNA
telah dipisahkan dengan gel agarosa, pewarnaan selanjutnya dilakukan
agar DNA dapat divisualisasi dengan UV. Metode pewarnaan yang umum
digunakan adalah menggunakan etidium bromide (EtBr). Perendaman gel
agarosa yang mengandung DNA ke dalam larutan EtBr akan menghasilkan
fluoresensi pada pita-pita DNA ketika disinari UV pada rentang 260-300
nm sebagai akibat dari fluoresensi EtBr.

Isolasi DNA Buah dengan Deterjen


Tujuan
Mahasiswa dapat mengisolasi DNA buah dengan menggunakan cara yang
mudah
Dasar
Sifat hidrofob dan hidrofil dari deterjen akan mudah berikatan dengan
struktur lipid dan protein dari membran sel dan inti, sehingga akan
merusak dan menghancurkan struktur membrane. Dengan demikian,
materi genetik DNA akan keluar dan dengan mudah dapat diekstraksi.
Bahan, Pereaksi dan Alat
1. Timbangan
2. Mikropipet
3. Sentrifus
4. Beaker Gelas
5. Blender (atau mortar dan pestel)
6. Spektrofotometer
7. Buah pisang
8. Sabun cair/deterjen
9. Etanol dingin
10. Kertas saring
11. Akuades
Cara Kerja
1. Preparasi buah pisang dilakukan dengan menghancurkan daging buah
pisang dengan mortar atau dengan menggunakan blender. Sebanyak
10 g dari sampel ini digunakan untuk proses ekstraksi DNA
2. Preparasi larutan deterjen dilakukan dengan mencampur sabun:air
(1:1, v/v) atau deterjen bubuk:air (1:1, b/v).
3. Ekstraksi DNA dilakukan dengan mencampur 10 g sampel buah pisang
dengan 10
mL larutan deterjen, diaduk, dan disaring untuk
memisahkan filtrat dari sisa organel sel padat.
4. Presipitasi DNA dilakukan dengan menambahkan etanol dingin
perlahan-lahan ke dalam filtrat hingga terbentuk endapan putih.
Kemudian distentrifus 7000 rpm selama 5 menit. Presipitat kemudian
dipisahkan dari supernatant dengan cara dekantasi. Presipitat DNA
yang diperoleh kemudian diresuspensi dengan 50 L akuadest
5. Analisis isolat DNA dilakukan dengan mengencerkan 2 L DNA ke
dalam 998 mL akuadest, kemudian diukur absorbansi dan konsentrasi
DNA nya menggunakan spektrofotometer UV khusus pengukuran
DNA/Protein

Elektroforesis DNA
Tujuan
Mahasiswa dapat memisahkan dan mengamati isolat DNA hasil isolasi
dengan elektroforesis
Dasar
Elektroforesis gel agarosa akan memisahkan molekul-molekul
berdasarkan ukuran molekulnya dengan bantuan arus listrik.

DNA

Bahan, Pereaksi dan Alat


1. Satu set alat elektroforesis DNA
2. Mikropipet
3. Hot Plate/Microwave
4. UV Iluminator
5. Botol larutan
6. Gelas ukur
7. Timbangan
8. Agarose
9. Buffer TAE
10. Loading Dye
11. DNA Ladder 1 kb
12. Sampel Isolat DNA buah (dari percobaan sebelumnya)
13. Larutan Etidium Bromida
Cara Kerja
1. Preparasi Gel Agarosa 0,8%
a. Pastikan memakai glove dan masker
b. Encerkan stok buffer TAE 50X menjadi buffer TAE 1X sebanyak 500
mL
c. Timbang 0,4 g agarosa dan tambahkan 50 mL buffer TAE 1X
d. Panaskan dengan hot plate (lebih bagus jika menggunakan
microwave) hingga agarosa larut sampai homogen
e. Biarkan sekitar 5-10 menit di suhu ruang (agar tidak terlalu panas)
sebelum gel agarosa dituang ke dalam cetakan gel.
f. Siapkan cetakan DNA dengan memberi perekat (lakban) pada kedua
sisi cetakan yang terbuka (berguna sebagai dinding agar gel
agarosa yang cair tidak tumpah).
g. Tuang gel agarosa ke dalam cetakan hingga batas ketinggian
tertentu dan segera pasang sisir untuk cetakan sumur (well) DNA.
Tunggu sekitar 30 menit atau sampai gel benar-benar dingin dan
padat.

h. Setelah dingin, lepaskan sisir beserta perekat. Masukan gel beserta


cetakannya ke dalam chamber elektroforesis.
i. Tuangkan ke dalam chamber buffer TAE 1X sampai batas ketinggian
tertentu atau minimal gel terendam hingga 2-5 mm.
2. Running DNA (Elektroforesis)
a. Pastikan memakai glove dan masker
b. Pipet 4 L loading dye ke atas parafilm dan campurkan dengan 10
L sampel DNA hingga warna biru merata.
c. Pipet campuran DNA dengan loading dye tersebut dan masukan ke
dalam sumur DNA pada gel agarosa.
d. Pipet pula 5 L DNA Ladder 1 kb dan tambahkan 2 L loading dye
seperti pada tahap 2a sebagai marker DNA
e. Tutup chamber elektroforesis dengan chamber penutup dan
hubungkan kabel ke power supply
f. Jalankan power supply, set tegangan 100V, waktu running 25 menit.
g. Tekan tombol start untuk memulai proses running electroforesis
3. Visualisasi DNA
a. Pastikan memakai glove dan masker
b. Setelah eletroforesis selesai, matikan power suplly dan buka
penutup chamber
c. Angkat gel agarosa beserta cetakannya
d. pisahkan gel dari cetakan
e. Masukkan gel ke dalam larutan EtBr dan rendam selama 5 menit
f. Angkat gel dan rendam dalam air bilasan selama 1 menit
g. Letakkan gel hasil pewarnaan di atas UV illuminator
h. Amati fluoresensi DNA dan rekam foto hasil electrophoresis
i. Setelah selesai, buang gel ke dalam wadah penampungan gel.
j. Hati-hati dalam melakukan proses pewarnaan dengan EtBr, karena
bahan tersebut bersifat karsinogenik.