Anda di halaman 1dari 10

BIOLOGI REPRODUKTIF DAN ENDOKRINOLOGI

Kalsitriol mempengaruhi transkripsi gen hCG dalam


sinsitiotrofoblas manusia yang dibiakan
Abstrak
Latarbelakang:
Dalam kehamilan, konsentrasi serum kalsitriol pada ibu meningkatkan tajam sebagai akibat dari
kontribusi renal dan plasental untuk memastikan suplai kalsium untuk janin. Mengingat bahwa
plasenta adalah lokasi untuk aktifasi vitamin D dan kefleksibelan dan potensi kalsitriol,
tampaknya hormone ini memiliki peran dalam perkembangan dan fisiologi janin/plasenta. Dalam
penelitian ini, kami meneliti fungsi kalsitriol pada sekresi gonadotropin korionik manusia (hCG)
dan ekspresi pada trofoblas yang dibiakan sebagaimana juga reseptor vitamin D (VDR) dan
imunolokalisasi CYP27BI pada plasental villi.
Metode: Pengukuran hCG dalam media biakan dilakukan dengan menggunakan penetapan kadar
imunologi. Studi ekspresi dilakukan dengan menggunakan PCR waktu nyata. Analisa CYP27B1
dan lokalisasi VDR pada slide plasenta dilakukan dengan imunohistokemistri. Signifikansi
statistik berasal dari ANOVA dengan menggunakan tes Tukey untuk perbandingan.
Hasil: Kalsitriol mengatur hCG tergantung pada waktu: pada 6 jam, sekosteroida merangsang
hCG, sedangkan inkubasi lebih lama (24 jam) menunjukan efek terbalik. Yang menarik, efek
stimulatori kalsitriol pada hCG disertai dengan penignkatan kandungan cAMP intrasel dan
diakhiri oleh pra-inkubasi sel dengan inhibitor A kinase protein selektif. Teknik imunohistokimia
menunjukan lokalisasi VDR yang berbeda dalam lapisan sinsitiotrofoblas atau dalam sel otot
halus vaskular tergantung pada epitope dan kenaikan antibodi (khususnya untuk wilayah
karboksi- atau aminoterminal). CYP27BI diimunolokalisasi dalam lapisan sinsitiotrofoblas
plasental villi.

Kesimpulan: Keberadaan dan lokasi enzim yang mengaktifkan vitamin D CYP27BI dan
reseptor spesifik untuk vitamin D ditunjukan pada bagian plasenta. Yang terakhir, bersamaan
dengan temuan yang mnunjukan efek spesifik fungsi kalsitriol melalui VDR dan cAMP/PKA
yang memberi sinyal jalur menuju ekspresi dan sekresi hCG mengindikasikan bahwa terdapat
sistem endokrin vitamin D yang berfungsi dalam plasenta dan berhasil mengidentifikasi kalsitriol
sebagai regulator autokrin hCG.
Latarbelakang
Vitamin D termetabolasi pada hormon steroid 1.25- dihidroksivitamin D atau kalsitriol yang
mengatur homeostasis kalsium, mengatur respon imun dan mendorong diferensiasi sel,
bersamaan dengan fungsi-fungsi lainnya. Kalsitriol, metabolit vitamin D yang paling aktif,
memberikan efek biologisnya dengan mengikat reseptor vitamin D (VDR) yang merupakan
faktor transkripsi teraktifasi ligan yang tidak lepas dari elemen respon vitamin D (VDRE) dalam
gen target dan juga dapat memunculkan respon cepat yang dihubungkan oleh reseptor
membrane. Plasenta adalah sumber dan target kalsitriol. Memiliki cara yang sama dengan proses
renal, produksi plasental kalsitriol terkatalsiasi oleh mitokondrial CYP27BI. Pada kejadian
reproduktif awal, kalsitriol tampaknya memunculkan efek biologis spesifik seperti regulasi
desidualisasi dan proses implantasi. Selain itu, kalsitriol juga mengatur ekspresi laktogen
plasenta dan sekresi progesterone dan estradiol dalam sinsitiotrofoblas manusia yang dibiakan.
Terkait molekul lainnya yang diatur oleh kalsitriol dalam plasenta, Evans menunjukan bahwa
kalsitriol berfungsis ecara autokrin/parakrin untuk mengatur respon imun yang diperoleh dan
pembawaan lahir, menurunkan sintesis sitokin seperti koloni granulositemakrofag yang
merangsang faktor 2, faktor nekrosis tumor dan interleukin 6 tetapi meningkatkan ekspresi
mRNA untuk katelisidin antimicrobial peptid. Karena korionik gonadotropin manusia (hCG)
adalah hormon yang sangat penting untuk kehamilan, tujuan dari penelitian saat ini adalah untuk
memperluas pengetahuan fungsi kalsitriol dalam plasenta, dengan memfokuskan efeknya
terhadap ekspresi hCG dan sekresi dalam sinsitiotroblas manusia yang dibiakan. Data yang
ditampilkan disini menunjukan sistem endokrin vitamin D dalam plasenta manusia dan
memperkirakan perannya dalam mengatur fisiologi plasenta.

Metode
Reagen
Media biakan, serum bovin fetal (FBS) dan Trizol berasal dari Invitrogen (NY, AS). Reaksi
TaqMan, pemeriksaan Taqman dan sistem RT transkriptor berasal dari Roche (Sains Terapan
Roche, IN, AS), kalsitriol (1,25-dihidroksikolekalsiferol) berasal dari donasi HoffmmannLaRoche Ltd (Basel, Swiss), 3-isobutil-1-metilksantin (IBMX), 8-Bromom cAMP (8-Br-cAMP),
H-89 dan enzim yang digunakan untuk biakan sel berasal dari Sigma-Aldrich (MO, AS).
Penetapan kadar imunologi untuk hCG berasal dari Imunometrics Ltd (London, Inggris).
Antibodi CYP27B1 (anti-murin 25-hidroksivitamin D-1-hidroksilase domba) berasal dari The
Binding Site (Birmingham, Inggris). Antibodi VDR (poliklonal anti-VDR N 20 sc-1009 dan antiVDR C-20 sc-1008 kelinci) dan antibodi kelinci anti-domba-tanaman horseradish peroksidase
dan tikus anti-kelinci lgG-HRP dibeli dari Santa Cruz Bioteknologi (CA, AS). DAB (3,3diaminobenzidin tetrahidroklorida) berasal dari Zymed Laboratories Inc (CA, AS).
Imunohistokimia
Penelitian ini disetujui oleh Komite Etika manusia Institusional (Rumah Sakit de GinecoObstetricia Luis Castelazo Ayala, IMSS, Meksiko) dan formulir persetujuan tertulis diperoleh
dari setiap donor plasenta. Masa plasenta (37-42 minggu gestasi) diperoleh dari kehamilan tanpa
komplikasi.
Jaringan plasenta segar dari 5 plasenta dimasukan dalam paraffin setelah fiksasi dalam 4%
paraformaldehide dalam 0,1 M dapar fosfat, pH 7,4. bagian serial (7m) diperoleh sesuai dengan
prosedur standar. Kaca slide diberi peroksida methanol-hidrogen untuk menghambat aktifitas
peroksidase endogen. Serum kelinci normal dan 1% BSA digunakan sebagai penghambat untuk
menurunkan sinyal non-spesifik. Kaca slide kemudian diinkubasi dengan antibodi promer (antiCYP27B1, anti-VDR-N dan anti-CDR-C) selama 45 menit pada temperature ruang dan
kemudian dicuci dan diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 25 menit lagi. Penodaan
dilakukan dengan menggunakan substrat DAB dan kromogen dibandingkan dengan hematoksilin
Mayer. Kekhususan pelabelanimunodiuji dengan menghilangkan antibodi primer,

Biakan sel trofoblas


Trofoblas dibiakan seperti dijelaskan sebelumnya [3,9,10]. Seingkatnya: Vilous sitotrofoblas
diperoleh dengan penyebaran enzim dan sel dipisahkan pada gradient Percoll kepadatan. Pada
plat trofoblas kemudian diberikan kepadatan 8 x 105 sel/ml dala mdia suplemen [(DMEM) 100
U/ml penisilin, 100 mg/ml streptomisin, 0,25 mg/ml Fungizona), yang mengandung 20% FBS
yang tidak aktif pada panas. Inkubasi dilakukan pada kelembaban 5% CO 2- 95% udara pada
37oC. Aspek morfologis sel diperiksa setiap hari, s ekresi hCG diukur dengan penentuan kadar
imunologi (EIA) dengan mengikuti instruksi produsen dan hasilnya dinormalkan dari total
kandungan protein. Proteinya ditentukan dengan menggunakan metode Bradford.
Efek kalsitriol pada sekresi hCG
Dua trofoblas yang dibiakan diinkubasi dengan diberikan konsentrasi berbeda kalsitriol atau
etanol sebagai wahana, dalam DMEM-F12 bebas serum selama 6 jam atau 24 jam. Eksperimen
lainnya dilakukan dengan menginkubasi sel dengan inhibitor kinase protein selektif A, sel lisis
dengan penyangga RIPA (9,1 mM dibasa sodium fosfat, 1,7 mM monobasa sodium fosfat, 150
mM NaCl, 1% Nonidet P-40, ),1% SDS, pH 7,4) digunakan untuk penetapan protein dan hCG
diukur dalam media biakan.
Efek Kalsitriol pada ekspresi hCG
Untuk penelitian ekspresi 3 x 106 sel diletakan pada plat dalam 25 cm 2 botol biakan sel dan
diberikan penanganan yang sama seperti disebutkan diatas. Total RNA diekstrak dengan
menggunakan Trizol dan 1g ditranskripsikan terbalik dengan menggunakan sistem transkriptor
RT. PCR waktu nyata dilakukan dengan menggunakan LightCycler 2.0 dari Roche (Roche
Diagnostics, Mannheim, Jerman), sesuai dengan protocol berikut: aktifasi polimerase DNA Taq
dan denaturasi DNA pada 95oC selama 10 menit, diikuti dengan proses 45 siklus amlifikasi yang
terdiri dari 10 detik pada 95oC, 30 detik pada 60oC an 1 detik pada 72oC. Pasangan primer
ditargetkan

pada

subunit

hCG

mRNA

dan

urutannya

sebagai

berikut:

GCTCACCCCAGCATCCTAT dan CAGCAGCAACAGCAGCAG. Gliseraldehida-3-fosfat


dehidrogenase gen housekeeping (GAPDH) juga digunakan sebagai kontrol internal dengan
menggunakan primer: AGCCACATCGCTGAGACAC dan GCCCAATACGACCAAATCC.

Ukuran amplikon hasilnya adalah 131 bp dan 66 bp dan pemeriksaan yang digunakan adalah #
79 dan # 60 (Peprustakaan penelitian universal manusia Roche) untuk hCG dan CAPDH.
Ekspresi CYP24A1 yang digunakan sebagai kontrol untuk efek kalsitriol dievaluasi dengan
menggunakan

primer

indera

dan

anti-indera:

CATCATGCCATCAAAACAA

dan

GCAGCTCGACTGGAGTGAC dan pemeriksaan # 88 dari perpustakaan penelitian universal


manusia.
Efek kalsitriol pada akumulasi cAMP
Sel diinkubasi dengan kalsitriol atau wahannya dalam DMEM-F12 dengan tambahan IBMX
(0,05 mM). Inkubasi dihentikan setelah 10 menit dengan koleksi media dan homogenisasi sel
dalam penyangga RIPA. Sampel kemudian dididihkan selama 5 menit untuk inaktivasi
fodfodiesterases dan cAMP intrasel diukur dengan radioimunoasai spesifik (RIA) seperti telah
dijelaskan sebelumnya. Hasilnya dinormalkan dari total kandungan protein dan diekspresikan
sebagai fmol cAMP/mg protein.
Analisa statistik
Data ditampilkan sebagai purata S.D. Signifikansi statistik diantara kelompok dibuat
denganANOVA satu arah dengan menggunakan tes TUKEY. Nilai P 0,05 dianggap signifikan
secara statistik.

Hasil
Studi imunohistokimia
Analisa bagian jaringan plasenta sekuensial menunjukan keberadaan imunoreaktif CYP27B1
dalam lapisan sinsitiotrofoblas (Gb. 1A). Pola penodaanimuno yang sama untuk VDR
divisualisasikan dengan menggunakan antibodi spesifik anti C-terminus, immunostaining juga
diidentifikasi dalam sel otot halus vaskular (VSMC, Gb, 1C). Yang menarik, penggunaan
antibodi spesifik anti N-terminus memperlihatkan immunostaining yang kuat pada VSMC dan
terlihat sinyal lemah pada lapisan sinsitiotrofoblas (Gb. 1E). Inkubasi kontrol tanpa antibodi
primer ditampilkan pada gambar 1B, D dan 1F. Hasil ini menunjukan keberadaan plasenta dua

komponen penting sistem endokrin vitamin D. Dengan memperhatikan data ini, kami mencari
penanda untuk fungsi plsenta. Karena biakan sel trofoblas terbukti menjadi model yang bagus
untuk mempelajari fisiologi plasenta dan hCG adalah penanda penting fungsionalitas plasenta,
kami memutuskan untuk menggunakan sistem ini untuk mengevaluasi aksi pengatur kalsitriol
pada level plasenta.
Efek kalsitriol pada hCG pada trofoblas yang dibiakan
Sitotrofoblas murni yang dibiakan akan membentuk sinsitia dengan cara yang tergantung pada
waktu. Viabilitas biakan sel dievaluasi dengan pengukuran hCG dengan atau tanpa 8-Br-cAMP,
sebuah analog untuk cAMP, faktor pengatur yang terkenal dari ekspresi hCG. Sekresi basa hCG
kedalam media biakan meningkat selama proses sitodiferensiasi dan sel yang dibiakan dengan
8-Br-cAMP mengeluarkan lebih banyak hCG dalam jumlah sigifikan dibandingkan dengan
kontrol (Gambar 2A). hCG mRNA meningkat dengan pola yang sama yang diamati dibawah
kondisi basa (Gb. 2B) dan dengan keberasaan 8-Br-cAMP ekspresi gen hCG tertinggi diamati
selama hari 2 yang mendahului sekresi hCG maksimal pada hari 3. Data ini selain evaluasi sel
morfologis, semakin menegaskan integritas fungsional siustem biakan primer.
Jika diberi kalsitriol, sekresi hCG meningkat segnifikan setelah 6 jam inkubasi (Gb. 3A).
kalsitriol juga mengatur hCG mRNA (Gb. 3B). karena hCG diatur oleh jalur cAMP/PKA dan
kalsitriol menyebabkan akumulasi cAMP, kami meneliti partisipasi pembawa pesan kedua ini
terhadap pengaturan hCG oleh kalsitriol. Untuk tujuan ini, cAMP diukur dalam sel terinkubasi
kalsitriol. Hasilnya menunjukan bahwa setelah 10 menit penanganan, sekosteroid menaikan
secara signifikan kandungan cAMP tergantung dosisnya (Gb. 4A). Prainkubasi sel dengan
penghambat selektif PKA (H-89) mengurangi ekspresi hCG dibawah level basa dan mencegah
protein yang bergantung pada kalsitriol dan hCG stimulasi gen yang terdeteksi pada 6 jam
periode inkubasi (Gb. 4B dan 4C). Hasil yang sama diperoleh dalam 72 jam biakan (Data tidak
ditampilkan).
Efek jangka panjang kalsitriol terhadap hCG juga telah dipelajari. Efek stimulatori yang diamati
pada 6 jam tidak lagi terlihat setelah 24 jam (data tidak ditampilkan) dan ketika sel diinkubasi
dengan keberadaan kalsitriol selama 2 hari berturu-turut, efeknya lebih bersifat menghambat

(Gb. 5A). Hambatan terlihat jelas pada level mRNA setelah penanganan 24 jam (Gb 5B) yang
terjadi sebelum respon protein hCG. Efek kalsitriol represif ini tidak dapat dihubungkan dengan
penurunan viabuilitas sel karena dibawah kondisi yang sama, kalsitriol mengatur ekspresi gen
CYP24A1 (Gb, 5C)
Pembahasan
Konsentrasi serum hCG aktif secara biologis tergantung pada tingkat sintesis subunit
spesifiknya; sedangkan pada level sel banyak faktor mempengaruhi produksi hCG dengan
berinteraksi dengan reseptro membrane spesifik pada trofoblas plasenta. Faktor yang sering
diteliti yang mengatur hCG adalah hormon yang melepaskan gonadotropin (GnRH), hCG sendiri
dan molekul-molekul lain yang mengaktifkan jalur transduksi sinyal bergantung cAMP. Tentu
saja baik gen hCG dan hCG terbentuk oleh cAMP. Dalam penelitian ini kami menunjukan
bahwa kalsitriol adalah faktor tambahan yang mengatur hCG dalam trofoblas manusia.
Sesungguhnya, kalsitriol mengatur hCG tergantung waktu, merangsang atau menghambat sekresi
dan ekspresi hormon. Efek stimulatori setelah 6 jam mungkin disebabkan, seperti ditunjukan
dalam penelitian ini, oleh penignkatan bergantung pada kalsitriol yang cepat . Asumsi ini
semakin ditegaskan oleh hasil dengan keberadaan H-89, penghambat selektif PKA. Tentu saja,
menghambat kaskade transduksi sinyal cAMP/PKA mengurangi kemampuan kalsitriol untuk
memunculkan induksi transkripsional gen hCG dan sekresi hCG kedalam media biakan.
Pembentukan cAMP yang cepat oleh kalsitriol sebelumnya telah dilaporkan untuk tipe sel
lainnya dan mungkin hasil dari interaksinya dengan membrane-VDR atau protein permukaan
lainnya. Selain itu, karena ditampilkan disini bahwa saluran ion kalsium berperan dalam sekresi
hCG bergantung pada GnRH, kalsitriol mungkin juga melepaskan simpanan hCG melalui entri
kalsium yang cepat kedalam sel. Penelitian lebih alnjut dibutuhkan untuk menjelaskan persoalan
ini.
Konsentrasi hCG juga diukur setelah 12, 24 dan 48 jam penanganan dengan kalsitriol tetapi
hasilnya yang dilaporkan dalam penelitian ini hanya yang berbeda secara signifikan ketika
dibandingkan dengan wahana sendiri. Efek stimulatori yang diamati pada 6 jam tidak lagi
terlihats etelah 12 atau 24 jam dan ketika sel diinkubasi dengan keberadaan kalsitriol selama 2

hari berturu-turut, efeknya agak bersifat menghambat. Hambatan terlihat jelas pada level mRNA
setelah penanganan 24 jam sebelum respon protein hCG. Data ini mungkin mencerminkan
situasi biologis yang sebenarnya. Tentu saja, hasil kami bahwa kalsitriol menghambat hCG sama
dengan data sebelumnya dari laboratorium ini dan laboratorium lainnya dimana kalsitriol serum
rendah dan level hCG serum tinggi ditemukan pada praeklampsia yang bersamaan dengan fakta
bahwa biokonversi [3H]25-hidroksivitamin D

menjadi [3H]1.25-dihidroksivitamin D secara

signifikan menurun pada plasenta praeklampsia, menunjukan efek regulatori langsung kalsitriol
pada produksi hCG. Terkait efek menghambat kalsitriol pada hCG, tampaknya jalur oksidasi
kalsitriol C23/C24 metabolik sekunder memainkan peran penting karena metabolit
trihidroksilase yang dihasilkannya dianggap tidak aktif secara biologis. Atau, karena kalsitriol
terbukti merangsang sekresi progesterone dan kemudian hormon ini menghambat sekresi hCG,
mekanisme ini bisa berperan dalam efek menghambat jangka panjang untuk plasenta. Pada kasus
papaun, apa yang ditampilkan oleh penelitian ini terkait efek mediasi genom kalsitriol pada hCG
menunjukan keberadaan wilayah regulatori yang bergantung pada VDR pada promoter hCG.
Kami menemukan lima dugaan lokasi pengikat heterodimer VDR/RXR dalam promoter gen
hCG yang mungkin berfungsi sebagai wilayah regulatori transkripsional yang bergantung pada
kalsitriol. Akan tetapi, keberaadaan tunggal VDRE dalam promoter hCG tidak cukup untuk
mengindikasikan fungsi transkripsional; sehingga evaluasi fungsional dugaan VDR masih
membutuhkan penelitian lebih jauh.
Pada perempuan yang tidak hamil, konsentrasi fisiologis kalsitriol berfluktuasi antara 40-100
pM. Dalam penelitian ini dosis kalsitriol sebesar: 100 pM, 1 nM dan 10 nM. Konsentrasi
terendah (100 pM) berada dalam jarak fisiologis level kalsitriol yang bersirkulasi diantara
perempuan hamil di Meksiko (127 pM dan 151 pM) seperti diamati sebelumnya. Dosis lainnya
yang diuji bersifat supra-fisiologi tetapi efek kalsitriol terhadap hCG terlihat mulai dengan
konsentrasi terendah.
Plasenta dianggap bukan hanya sebagai sumber tetapi juga sebagai target kalsitriol. Untuk
memperoleh pemahaman mengenai efek parakrin. Autokrin kalsitriol dalam plasenta, kami
meneliti imunolokalisasi VDR dan CYP27B1 dalam villi korionik plasenta. Terkait dengan

laporan sebelumnya, protein CYP27B1 berlokasi pada lapisan sinsitiotrofoblas yang menguatkan
bahwa fenotipe endokrin sel trofoblas memiliki peran penting untuk aktifasi vitamin D dalam
plasenta. Untuk menjawab dimana kalsitriol yang dihasilkan secara lokal berfungsi dalam
plasenta, kami mencaritahu protein VDR dalam bagian plasenta. Me nurut kami, ini adalah
laporan pertama yang menunjukan VDR imunoreaktif adalam lokasi berbeda-beda dalam villi
plasenta, karena ekspresi VDR biasanya ditemukan pada level mRNA dalam plasenta. Antibodi
menunjukan keberadaan VDR dalam sel plasenta endokrin dan VSMC yang berarti bahwa
kalsitriol berperan dalam mengatur produksi hormon dan pemodelan kembali vaskular melalui
VDR. Asumsi yang terakhir berasal dari penelitian sebelumnya yang menampilkan bahwa
kalsitriol berperan dalam vaskulatur yang mendorong pertumbuhan dan perpindahan VSMC.
Yang menarik antibodi C-terminus terus menodai lapisan sinsitiotrofoblas dan sedikit menodai
sel pembuluh plasenta disekitarnya, sedangkan antibodi n_terminus mendeteksi sinyal yang kuat
pada endothelial dan VSMC. Observasi ini mungkin emngindikasikan epitope yang berbeda
yang dikenali oleh antibodi tergantung pada posisi topology VDRnya. Tantangan disini adalah
untuk mendefinisikan respon VDR spesifik untuk struktur plasenta yang berbeda.
Kesimpulan
Ringkasnya, penelitian ini memperluas pengetahuan mengenai sistem endokrin vitamin D
plasenta dengan menunjukan efek fisiologis kalsitriol pada penanda fungsi plasenta biokomia
yang penting seperti hCG. Selain itu, ini adalah laporan pertama yang menunjukan VDR
imunoreaktif dalam lokasi yang berbeda pada vili plasenta manusia dan membuka kesempatan
untuk menjawab pertanyaan penelitian yang penting mengenai peran kalsitriol pada struktur
plasenta tertentu.
Kepentingan lain
Penulis menyatakan tidak ada kepentingan lain.
Kontribusi Penulis
Db melakukan analisa PCR waktu nyata, pengukuran hCG dan berpartisipasi dalam pendesainan
studi dan analisa statistik. EA berpartiispasi dalam desain studi, terutama studi molekul,

melakukan analisa PCR waktu nyata dan membantu menulis naskah. GH melakukan koleksi
plasenta, biakan sel primer trofoblas, ekstraksi RNA dan reaksi transkripsi terbalik. IM dan LG
bertugas untuk melakukan eksperimen terkait CAMP termasuk desain dan analisa hasilnya. AH
bertugas dalam interpretasi data dan terlibat dalam penyusunan naskah. FL bertugas untuk
mendesain studi, terlibat dalam penyusunan naskah dan melakukan revisi. AM bertugas
melakukan penelitian imunohistokimia dan membantu penulisan naskah. LD membantu
penelitian, desain dan koordinasi, menyusun naskah dan berperan aktif dalam prosedur
eksperimen. Semua penulis membaca dan menyetujui naskah terkahirnya.

10