Anda di halaman 1dari 10

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DASAR

KI-3261 METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK


Percobaan 8
INDUKSI

-GALAKTOSIDASE

Nama

: Nisrina Rizkia

NIM

: 10510002

Kelompok

:6

Tanggal Percobaan

: 04 April 2013

Tanggal Laporan
Asisten

: 11 April 2013
Praktikum : Ka Aisyah

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM


INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2013

INDUKSI

Tujuan
Menentukan aktivitas enzim

II

-GALAKTOSIDASE

-galaktosidase secara kolorimetri.

Dasar Teori
Enzim

-galaktosidase adalah enzim hidrolase yang berfungsi untuk

mempercepat reaksi konversi dari galaktosida menjadi galaktosa, seperti laktosa

menjadi monosakarida yaitu galaktosa dan glukosa. Sintesis

-galaktosidase

dikendalikan oleh sistem pengendalian ekspresi genetik yaitu lac operon. Operon
adalah unit DNA genomik yang terdiri dari kluster gen yang berfungsi di bawah
kontrol promotor atau suatu sinyal tunggal. Lac operon adalah operon yang
mengendalikan ekspresi gen-gen untuk transpor dan metabolisme laktosa.

Aktivitas

-galaktosidase dapat ditentukan secara kolorimetri untuk

mempelajari ekspresi gen pada sistem lac-operon. ONPG (orto-nitrofenil-

-D-

galaktopiranosida) digunakan sebagai substrat pengganti laktosa. ONPG adalah

senyawa yang tidak berwarna, adanya aktivitas

-galaktosidase ditunjukkan

dengan adanya warna kuning karena terbentuknya ONP (orto-nitrofenol) dan memiliki
serapan maksimum pada 420 nm.

III

Data Pengamatan
Pengukuran Optical Density (OD) pada

Sampel
NB
NB + Laktosa
NB + Glukosa + Laktosa
NB + Glukosa
NB + Sukrosa
NB + Maltosa
Absorban dari berbagai media

= 600 nm

Absorbansi
0.53
0.537
0.712
0.414
0.536
0.535

Absorban pada T tertentu (

Sampel
0
0.131
0.043
0.027
0.045
0.050
0.083

NB
NB + Laktosa
NB + Glukosa + Laktosa
NB + Glukosa
NB + Sukrosa
NB + Maltosa

IV

10
0.136
0.193
0.202
0.087
0.089
0.107

20
0.355
0.334
0.342
0.123
0.210
0.236

= 420 nm)
30
0.340
0.120
0.264
0.082
0.184
0.237

Perhitungan dan Pengolahan Data

Kurva Absorban Vs Waktu


0.4
NB
0.3

NB+laktosa
NB+glukosa+laktosa

Absorban 0.2

NB+glukosa
NB+sukrosa

0.1

NB+maltosa
0
0 10 20 30 40 50
t (menit)

Aktivitas enzim =

A 420
t inkubasi xVolume xOD 600

Misal tabung pertama untuk kultur NB dengan waktu inkubasi 10

40
0.287
0.162
0.379
0.169
0.268
0.136

Aktivitas enzim =

0.136
10 x 0.00167x 0.53

= 15.37 menit-1 L-1

Dengan cara yang sama dapat diperoleh hasil sebagai berikut :


Sampel
NB
NB + Laktosa
NB + Glukosa + Laktosa
NB + Glukosa
NB + Sukrosa
NB + Maltosa

0
0
0
0
0
0
0

Aktivitas Enzim (menit-1 L-1)


10
20
30
15.37
20.05
12.80
21.52
18.62
4.46
16.99
14.38
7.40
12.58
8.90
3.95
9.94
11.73
6.85
11.98
13.21
8.84

40
8.11
4.52
7.97
6.11
7.49
3.81

Aktivitas Enzim Beta-Galaktosidase


25

NB

20

NB+laktosa

15
Aktivitas enzim menit-1 L-1 10

NB+laktosa+glukosa
NB+glukosa

NB+sukrosa

0
0

NB+maltosa
50

t (menit)

Pembahasan
Operon adalah sekumpulan gen yang diapit oleh sepasang terminator dan promoter,

produk-produknya memiliki fungsi-fungsi yang berhubungan dan ditranskripsi bersama-sama


sebagai suatu kesatuan. Daerah operon adalah daerah yang berperan dalam regulasi ekspresi
gen. Contohnya saja operon lac yaitu operon yang mengendalikan kemampuan metabolism
laktosa pada bakteri E.Coli. Dalam operon lac terdapat tiga macam gen structural yang

mengkode protein yang berbeda yaitu gen Z untuk mengkode

-galaktosidase yang akan

menghidrolisis lakosa menjadi glukosa dan galaktosa, gen Y untuk mengkode permease yang
akan membawa laktosa ke dalam sel dan gen A untuk mengkode transasetilase yang akan

mentransfer gugus asetil dari acetyl-CoA ke

-galaktosidase. Masing-masing gen

structural tersebut mempunyai kodon inisiasi dan terminasi yang berbeda-beda, namun
ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter yang sama. Saat transkripsi, operon lac
menghasilkan satu mRNA yang membawa kode-kode genetik untuk tiga macam polipeptida
yang berbeda. Ketiga gen struktural tersebut diatur ekspresinya oleh satu promoter yang sama
(p). Operator adalah bagian dari promoter tempat penempelan protein repressor yang dikode
oleh gen I (Warianto, 2011). Operon lac dibutuhkan dalam transport dan metabolism dari
laktosa pada E.coli dan berbagai macam bakteri lainnya. Operon diregulasi oleh adanya
glukosa dan laktosa. Gen structural akan aktif apabila ada induksi dari laktosa. Bila tidak
adanya laktosa, gen lac I akan menghasilkan protein repressor yang mengikat operator lac dan
mencegah terjadinya transkripsi karena RNA polimerase tidak lagi mengikat. Akan tetapi, saat
aktossa ditambahkan, repressor lac I akan terlepas karena terikat pada alolaktosa lalu
transkripsi ketiga gen structural akan berjalan (Joung, 2000).
Aktivitas operon dikendalikan oleh system regulasi positif dan negative. Pengendalian
positif pada suatu operon adalah operon dapat diaktifkan oleh produk ekspresi gen regulator.
Sedangkan pengendalian negatif adalah operon dinonaktifkan oleh produk ekspresi gen
regulator. Terdapat dua macam produk gen regulator yaitu aktivator yang berperan dalam
pengendalian positif dan repressor yang berperan dalam pengendalian neagatif. Pengikatan
aktivator atau repressor pada promoter ditentukan oleh keberadaan suatu molekul efektor
yang biasanya merupakan molekul kecil. Molekul efektor yang mengaktifkan ekspresi suatu
gen disebut induser dan yang bersifat menekan ekspresi suatu gen disebut repressor. Pada
keadaan tidak ada laktosa, repressor lac akan berada dalam konfigurasi aktifnya. Sedangkan,
apabia terdapat laktosa, alolaktosa akan mengikatkan diri pada repressor lac dan mengubah
konformasinya, menghilangkan repressor untuk mengikatkan diri pada operator. Operator lac

akan menghasilkan mRNA untuk enzim-enzim jalur laktosa, hal tersebut dapat dilihat pada
gambar 1 dan 2.

Gambar 1. Pengaruh adanya laktosa

Enzim

Gambar 2. Pengaruh tidak adanya laktosa

-galaktosidase dapat disintesis dalam jumlah yang layak, apabila terdapat

laktosa dan rendahnya glukosa. E.coli dapat mengetahui konsentrasi glukosa dengan
mengandalkan interaksi antara protein pengatur alosteik dengan suatu molekul organik yang
berukuran kecil. Molekul kecil tersebut adalah AMP siklik (cAMP) dan akan berakumulasi bila
tidak ada glukosa. Protein yang mengatur hal tersebut adalah protein repressor cAMP (cAMP
reseptor protein atau CRP) yang merupakan aktivator transkripsi. Ketika cAMP terikat pada
CRP, protein akan berubah ke bentuk aktifnya dan mengikatkan diri pada tempat tertentu di
sebelah promoter lac. Penempelan CRP pada DNA membuat RNA polymerase mudah terikat
pada promoter dan memulai proses transkripsi operon. Apabila jumlah glukosa meningkat maka
cAMP akan menurun dan CRP akan lepas dari operon lac. Keadaan dari repressor lac akan
menentukan ada atau tidaknya transkripsi gen operon lac. Kondisi CRP akan mengontrol laju
transkripsi apabila opero bebas dari repressor.

Pada percobaan ini dilakukan penentuan aktivitas

-galaktosidase yang diinduksi oleh

berbagai jenis gula. Medium yang digunakan ditambahkan dengan berbagai jenis gula, dalam
praktikum kali ini adalah NB, NB + laktosa, NB + glukosa + laktosa, NB + glukosa, NB +
sukrosa dan NB + maltosa. Sebelumnya medium yang sudah ditambahkan berbagai jenis gula ini
disentrifugasi untuk mengendapkan bakteri dan memisahkannya dari media. Buffer Z untuk

mencuci sisa media yang masih ada, sentrifuga dilakukan beberapa kali agar bakteri dapat
terpisahkan dengan baik. Kloroform berfungsi untuk mengekstrak komponen sel yang sudah
tidak dibutuhkan. SDS untuk merusak membrane sel agar terjadi proses lisis sel. Setelah itu

diinkubasi pada suhu 37oC karena suhu optimum untuk kerja

ONPG (orthonitrofenil-

-galaktosidase. Penambahan

-galaktopiranosida) digunakan sebagai substrat. Lalu diinkubasi

untuk mengoptimumkan kerja enzim dan kemudian ditambahkan Na 2CO3, Na2CO3 bersifat basa
dan akan mengubah pH larutan, sehingga kerja enzim terganggu dan aktivitasnya akan menurun.
Penyimpanan dalam es pun akan membuat enzim tidak bekerja. Setelah itu disentrifugasi, dan
akan didapatkan fasa ONP hasil hidrolisis dan fasa organik (kloroform dan SDS). Kemudian
diukur absorban dari cairan tersebut dan jangan sampai fasa organik terambil dalam pengukuran.
Pada pengukuran untuk waktu nol menit, didapatkan absorbansi yang tidak nol untuk
semua tabung dengan berbagai media. Hal tersebut mungkin disebabkan oleh lamanya
penambahan Na2CO3 dan penyimpanan dalam es, dan enzim sudah menunjukkan aktivitasnya
tanpa adanya inkubasi terlebuh dahulu. Pada tabung pertama yang hanya berisi NB. Akibatnya
bakteri akan memiliki sedikit ATP namun molekul cAMP akan banyak. cAMP akan mengikat
protein CRP dan akan menginduksi pengikatan RNA polimerase. Proses transkripsi akan berjalan
dengan lancar, sehingga absorbannya semakin lama semakin meningkat, namun ternyata dari
data yang diperoleh ada penurunan nilai absorban. Pada tabung kedua, di mana medium
ditambahkan dengan laktosa seharusnya menunjukkan absorban yang paling tinggi di antara
yang lain karena laktosa berperan sebagai induser sehingga ONP lebih banyak terbentuk. ATP
yang dihasilkan sedikit dan jumlah cAMP cukup banyak dan dapat mengikat CRP dan
menginduksi RNA polimerase. Pada tabung ketiga, medium ditambahkan dengan glukosa dan
laktosa. Terdapat laktosa yang berperan sebagai induser namun karena adanya glukosa maka
jumlah ATP akan lebih banyak dibandingkan dengan hanya laktosa saja. Kompleks CRP-cAMP
hanya sedikit sehingga pengikatan RNA polymerase tidak diindukksi. Tanskripsi yang terjadi
akan mengalami penurunan dan ONP yang terbentuk akan menjadi sedikit. Pada tabung

keempat, gula yang ditambahkan adalah glukosa, glukosa sangat mudah untuk menghasilkan
ATP. Jumlah ATP akan banyak dan jumlah cAMP akan sedikit, sehingga pengikatan RNA
polymerase menurun dan transkripsi juga menurun. Repressor pun akan mengikat operator dan

mengganggu proses transkripsi

-galaktosidase. Pada tabung kelima digunakan sukrosa yang

merupakan disakarida sehingga ATP yang akan dihasilkan sedikit, kompleks cAMP-CRP akan
menjadi banyak sehingga pengikatan RNA polimerase terinduksi. Pada tabung keenam, gula
yang ditambahkan adalah maltose, maltose adalah disakarida dan sulit untuk menghasilkan ATP
dibandingkan dengan glukosa, sehingga jumpah cAMP cukup banyak, transkripsi akan
meningkat.

Dari hasil percobaan kali ini maka didapatkan beberapa aktivitas

-galaktosidase,

tabung dengan menggunakan laktosa memberikan aktivitas yang besar dan aktivitas paling kecil
didapatkan untuk tabung dengan penambahan glukosa terlihat pada grafik tren yang dihasilkan
terdapat penurunan aktivitas yang cukup signifikan. Pada percobaan kali ini tren data yang
didapatkan sangatlah buruk, terjadi naik turun absorban pada setiap tabung. Pada tabung pertama
tanpa inkubasi pun seharusnya absorban nya nol. Diantara semua tabung seharusnya tabung
dengan laktosa yang memiliki absorban paling besar yaitu tepatnya pada waktu inkubasi 40
menit. Namun, ternyata absorban terbesar diperoleh untuk glukosa dan laktosa pada menit ke 40.
Hal tersebut sangat jauh berbeda, beberapa kesalahan yang dimungkinkan terjadi adalah selang
waktu penambahan ONPG dan waktu penyetopan reaksi tidak tepat sehingga reaksi melebihi
atau kurang dari yang seharusnya serta kuvet yang digunakan sebaiknya adalah kuvet kuarsa
karena memilki kualitas yang lebih baik dibandingkan kuvet yang digunakan.
Selain operon lac terdapat juga operon triptofan, triptofan lac terdiri dari lima gen
strukturan yang diperlukan untuk konversi asam chorismic enjadi triptofan, lima gen structural
tersebut adalah antrhanilate syntetase (komponen I yang dikode oleh trpE dan komponen II yang
dikode oleh trpD), N-(5-phosphoribosyl)-anthranilate isomerase/Indole-3-glycerol phosphate

synthase yang disandikan oleh trpC, Tryptophan synthase (-subunit yang disandikan
oleh trpBI dan -subunit yang disandikan oleh trpA).

Gambar 3. Trp operon


VI

Kesimpulan
Sampel
NB
NB + Laktosa
NB + Glukosa + Laktosa
NB + Glukosa
NB + Sukrosa
NB + Maltosa

VII

0
0
0
0
0
0
0

Aktivitas Enzim (menit-1 L-1)


10
20
30
15.37
20.05
12.80
21.52
18.62
4.46
16.99
14.38
7.40
12.58
8.90
3.95
9.94
11.73
6.85
11.98
13.21
8.84

40
8.11
4.52
7.97
6.11
7.49
3.81

Daftar Pustaka
J.H. Miller in, Experiment in Molecular Genetics, 1972 Cold Spring Harbor
Laboratories p.352-355
Joung J, Ramm E, Pabo C (2000). A bacterial two-hybrid selection system for studying
protein-DNA and protein-protein interactions. Proc Natl Acad Sci USA 97
(13): 73827.
Warianto, Chaidar, 2011, Transkripsi pada Prokariotik, Universitas Airlangga.