Laporan HPLC

(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

Disusun Oleh:
Kelompok 1
Alexander Zulkarnain
Andrean

(061440411717)
(0614404111718)

Arrani Asma Firdausia

Desi Fitriyanti
Dicky Syaputra
Dinda Reskyanah Sakinah

(06144041
(061440411721)
(061440411722)
(061440411723)

Indah Amalia
Indah Dwi Lestari

(06144041
(06144041

KELAS: 2EGD
INSTRUKTUR:

Ir.K.A.Ridwan,M.T

JURUSAN TEKNIK KIMIA

POLITEKNIK NEGERI SRIWIJAYA

2015

I.TUJUAN
Menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi
Mengoperasikan alat kromatografi cair dengan baik dan benar
Menganalisa suatu senyawa kimia baik secara kuantitatif maupun
kualitatif dengan menggunakam alat kromatografi cair tekanan
tinggi
II. Alat Dan Bahan Yang Digunakan
Seperangkat alat HPLC atau KCKT
Kolom c-18
Syringe
Penyaring milipole
Neraca analitik
Labu tukar
Pipet volum
Corong gelas
Gelas kimia
Gelas pipa
II.Dasar Teori
1.1. Sejarah
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam
teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak
yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan
ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903,
mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom
yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk
melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada
waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk
memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai
penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.
Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan
suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir
tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar
kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan
Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik
sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel)
tidak hanya mengubah dengan cepat kroinatografi cair tetapi
Seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi
kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah
pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an
kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar,
pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala
prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin
banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu
teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography

(HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan
atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah
berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan
pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan
suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam
keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan
cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.
1.2. Kelebihan KCKT
Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT
termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak
cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika
dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979;
Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara
lain:
cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika
dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979;
Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara
lain:
II. JENIS-JENIS KROMA TOGRAFI
2.1. Kromatografi padatan cair (LSC)
Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar
seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah
satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikelpartikel micro or macro particulate or pellicular (berkulit tipis 37 -44 ).Sebagian
besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapa partikel-partikel microparticulate
lebih kecil dari 20 . Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat
yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama
sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer.
2.2. Kromatografi partisi
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat
bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya
sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), rasa diamnya
dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa
diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam
sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi
partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC)
Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah
dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung
inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded
Phase Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling
populer dari KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase
diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada
fase diam.
2.3. Kromatografi penukar ion (IEC)
Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan
tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari kopolimer
divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah. Asam sulfonat dan
amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya,
fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life
sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai

untuk keduanya kation dan anion.

2.4. Kromatografi eksklusi
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat
padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil
(porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan
Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum disebut permeasi
gel (GPC) dan filtrasi gel. Apapun namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang
biologi, Sephadex, suatu Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya
pengepak keras dan semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT.
Dextran gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau
2 atmosfer. Tenik ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan
biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.
2.5. Kromatografi pasangan ion (IPC)
Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT termasuk
baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970. Diterimanya IPC
sebagai metode baru KCKT merupakan hasil kerja Schill dan kawan-kawan dan dari
beberapa keuntungan yang unik. Kadang-kadang IPC disebut juga kromatografi
ekstraksi, kromatografi dengan suatu cairan penukar ion dan paired ion
chromatography (PIC). Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama.
Popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari sukanya
menangani sampel-sampel tertentu dengan metode-metode LC lainnya (seperti
senyawa yang sangat polar, senyawa yang terionisasi secara kompleks dan senyawa
basa kuat).
IPC dapat dilaksanakan dalam dua tipe yaitu fase normal dan fase balik. Fase diam dari
rase balik IPC dapat terdiri dari suatu pengepak silika yang disilanisasi
(misalnya C8 atau C18 Bonded Phase) atau dari suatu pengepak yang diperoleh
secara mekanik, fase organik yang tidak dapat bercampur dengan air seperti 1
pentanol. Fase diam yang dipakai adalah Cs atau CIS BPC Packing. Fase gerak terdiri
dari suatu larutan bufer (ditambah suatu kosolven organik seperti metanol atau
asetonitril untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion tanding,yang
muatannya berlawanan dengan molekul sampel.

Prinsip kerja instumentasi HPLC

HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran
komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen dalam sampel
berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya
adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang
biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe 2SiCl, dimana R adalah
rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur
komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada
kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
punsak-puncaknya terpisah.
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan
kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan menggunakan HPLC
dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya untuk menganalisis

cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa
organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang
mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik
didih yang sangat tinggi seperti polimer.
Cara kerja instumentasi HPLC
Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom kedetektor
dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan
cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran
karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang
kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu.
Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom
lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor
kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Komponen-komponen instrumentasi HPLC
1. Fasa Gerak
Fasa gerak dari HPLC merupakan zat cair yang disebut eluen atau pelarut. Dalam HPLC
fasa gerak selain berfungsi untuk membawa komponen-komponen campuran menuju ke
detektor, selain itu juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak
dalam HPLC merupakan salah satu faktor penetu keberhasilan proses pemisahan.
Persyaratan zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak sebagai berikut:
a) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis
b) Zat cair harus murni, untuk menghindari masuknya kotoran yang dapat mengganggu
interpretasi kromatogram
c) Zat cair harus jernih, untuk meghindari penyumbatan pada kolom
d) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun
e) Zat cair tidak kental dan harus sesuai dengan detektor
Fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikelpartikel kecil. Selain itu adanya gas dalam fasa gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya
gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama do pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap selama elusi) atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog
dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien diguakan untuk
meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran
polaritas yang luas.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan buffer dengan metanol atua campuran air dengan asetonitril. Untuk
pemisahan dengan fase normal, fasa gerak yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarutpelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding fase
terbalik.
2. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat dari
gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan campuran
menjadi komponen-komponen. Bergantung keperluannya kolom utama dapat digunakan
untuk analisis atau preparatif setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung
yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector selain kolom
utama dikenal pula kolom pengaman.
Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada keperluan, misalnya
dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion. Kolom utama untuk HPLC
biasanya berukuran panjang berkisar antara
5-30 cm dan diameter dalam berkisar 4,510 mm.
Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena letaknya sebelum sistem
pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm dengan diameter 4,6 mm biasanya
dipaking dengan partikel silika berukuran besar dari ukuran partikel kolom utama. Kolom
pengaman mempunyai dua fungsi yaitu: menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak
dan untuk menjenuhkan fasa gerak dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam
oleh aliran pelarut.
Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung
pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok

a) Kolom analitik
Garis tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan
pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya
10-30 cm.
b) Kolom preparatif
Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm.
3.Pompa

Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom
yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam metode ini sebagai
akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan sukar mengalir dalam kolom
yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar zat cair dapat melewati kolom
secara tepat maka dibutuhkan bantuan pompa yang bertekana tinggi. Pompa yang
digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan sebagai berikut :
a) Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi
b) Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
c) Bahan tahan korosi
d) Keluaran bebas pulse
Dikenal 3 jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan yaitu :
a) Pompa Reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara
gerakan piston maju mundur yang dijalankan oleh motor. Gerakan piston memberikan aliran
eluen yang konstan, memiliki volume internal kecil (35-400 mL) menghasilkan tekanan
tinggi (sampai 10.000 psi). Piston berupa batang gelas dan berkontak lengsung dengan
pelarut.
b) Pompa Displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) tersiri dari tabung yang dilengkapi
pendorong yang digerakkan oleh motor. Menghasilkan aliran yang cenderung tidak
tergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. Memiliki keterbatasan
kapasitas pelarut (

250 mL) dan tidak mudah untuk pergantian pelarut.

c) Pompa Pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa jenis ini murah, tetapi
memiliki keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) kecepatan alir
bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.
4. Injector Sample
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.
Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom) kromatografi
adalah penyuntik loop.

Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi penuh, tapi bila tidak diisi penuh akan
mengakibatkan lebih jeleknya presisi hasil eksperimen dan ketergantungan presisi tersebut
kepada bagaimana si-operator menggunakan penyuntik.
Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan (handle) penyuntik
diputar dari posisi load (pengisap) ke posisi inject (suntik). Karena sampel akan
mengalir ke saluran pembuangan. Hal yang terakhir ini tentunya tidak diinginkan, pegangan
penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam diinginkan. Pegangan
penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam kolom, antara posisi
pengisian (load) dan posisi penyuntikan (inject) berlangsung cepat.
Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya terletak pada
keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom. Masalahnya kebanyakan
memasukan cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karen itu
cuplikan yang dimasukkan harus sekecil beberapa puluh mikroliter. Beberapa teknik
pemasukan cuplikan kedalam sistem dapat diuraikan sebagai berikut :
a) Injeksi Syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang
tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi stringe ini sedikit lebih
baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.
b) Injeksi Stop Flow
Aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan
cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambung kembali kolom
maka pelarut dialirkan kembali. Untuk memasukkan cuplikan kedalam fasa gerak perlu dua
langkah : sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dan posisi load. Cuplikan
masih berada dalam loop ; kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi
injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan kedalam kolom (kran cuplikan).
c) Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk
memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu 2 langkah, yaitu: sejumlah volume
cuplikan disuntikan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop;
kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa
cuplikan ke dalam kolom.
5. Detektor
Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap
golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka terhadap

golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang digunakan dalam
KCKT adalah
a) Detektor Universal

Detektor Ultra Violet Visible (Sinar Tampak)

Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik.

Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga panjang gelombang

UV yang digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan yang diukur.
Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena sensitivitasnya
yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di analisis, dan
memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang pada panjang
gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm, dan ada yang panjang
gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm. Detektor dengan
panjang gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat untuk memilih panjang gelombang
secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri (allto zero). Detektor jenis ini juga ada yang
menggunakan drode erray (sebagai pengganti photo tube), sehingga dapat melakukan
pembacaan absorban yang kontinyu pada berbagai panjang gelombang.
Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis apapun, termasuk
pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan indeks bias karena
adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat tidak merusak (nondestruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10-6 g) dan umumnya digunakan dalam
pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak dapat dilakukan elusi bergradien. Detektor
ini digunakan dalam kromatografi eklusi dan dalam analisis karbohidrat.
Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks bias :
Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga homogen dan
bebaskan dari gas terlarutnya.
Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan sampai detektor
stabil.
Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka tempatkanlah
detektor indeks bias pada urutan terakhir.
Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam (inner
diameter) yang besar tapi pendek.
Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap.
Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.
Sel pembanding harus diisi dengan pelarut yang telah dilewatkan melalui kolom,
Detektor Spektrometer Massa
Detektor Spektrometer Inframerah

b) Detektor Selektif
Detektor Fluoresensi
Didasarkan kepada prinsip bahwa molekul-molekul tertentu dapat menyerap energi
pada panjang gelombang yang lebih pendek membentuk suatu keadaan tereksitasi dan
kemudian secara hampi bersamaan turun kembali ke keadaan dasar (ground state) dengan
memancarkan energi pada panjang gelombang yang lebih panjang.

Detektor Konduktivitas Listrik

Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri)

dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solutsolut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik.
Adapun persyaratan detektor yaitu: cukup sensitif, stabilitas, dan keterulangan tinggi, tidak
erusak cuplikan, respon linier terhadap solut, reliabilitas tinggi dan mudah digunakan.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :
a) Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprousibel
b) Mempunyia sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar sangat
kecil
c) Stabil dalam pengoperasiannya
d) Mempunyia sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita
e) Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas
f) Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak
6. Rekorder
Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa kumpulan
puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif
dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah
peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara
membandingkan waktu retensi (rt) analit atau sampel dengan waktu retensi standar.
Sedangkan analisis kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi
peak dengan metode standar kalibrasi.
Penentuan Kafein :
Kafein adalah suatu senyawa organik yang mempunyai nama lain yaitu kafein, tein,
atau 1,3,7-trimetilxantin. Kristal kafein dalam air berupa jarum-jarum bercahaya. Bila tidak
mengandung air, kafein meleleh pada suhu 234oC 239oC dan menyublim pada suhu yang
lebih rendah. Kafein mudah larut dalam air panas dan kloroform, tetapi sedikit larut dalam air
dingin dan alkohol (Abraham, 2010)

Kafeina[3][4], atau lebih populernya kafein, ialah senyawa alkaloid xantina berbentuk kristal
dan berasa pahit yang bekerja sebagai obat perangsang psikoaktif dan diuretik ringan[5].
Kafeina ditemukan oleh seorang kimiawan Jerman, Friedrich Ferdinand Runge, pada tahun
1819. Ia menciptakan istilah "kaffein" untuk merujuk pada senyawa kimia pada kopi.[6]
Kafeina juga disebut guaranina ketika ditemukan pada guarana, mateina ketika ditemukan
pada mate, dan teina ketika ditemukan pada teh. Semua istilah tersebut sama-sama merujuk
pada senyawa kimia yang sama. Kafeina dijumpai secara alami pada bahan pangan seperti
biji kopi, daun teh, buah kola, guarana, dan mat. Pada tumbuhan, ia berperan sebagai
pestisida alami yang melumpuhkan dan mematikan serangga-serangga tertentu yang
memakan tanaman tersebut. Ia umumnya dikonsumsi oleh manusia dengan mengekstraksinya
dari biji kopi dan daun teh. Kafeina merupakan obat perangsang sistem pusat saraf pada
manusia dan dapat mengusir rasa kantuk secara sementara. Minuman yang mengandung
kafeina, seperti kopi, teh, dan minuman ringan, sangat digemari. Kafeina merupakan zat
psikoaktif yang paling banyak dikonsumsi di dunia. Tidak seperti zat psikoaktif lainnya,
kafeina legal dan tidak diatur oleh hukum di hampir seluruh yuridiksi dunia. Di Amerika
Utara, 90% orang dewasa mengkonsumsi kafeina setiap hari (Anonim, 2010)
Kopi adalah sejenis minuman yang berasal dari proses pengolahan dan ekstraksi biji tanaman
kopi.[2] Kata kopi sendiri berasal dari bahasa Arab qahwah yang berarti kekuatan, karena
pada awalnya kopi digunakan sebagai makanan berenergi tinggi.[3] Kata qahwah kembali
mengalami perubahan menjadi kahveh yang berasal dari bahasa Turki dan kemudian berubah
lagi menjadi koffie dalam bahasa Belanda.[rujukan?] Penggunaan kata koffie segera diserap
ke dalam bahasa Indonesia menjadi kata kopi yang dikenal saat ini.[3] Secara umum, terdapat
dua jenis biji kopi, yaitu arabika (kualitas terbaik) dan robusta.[4] Sejarah mencatat bahwa
penemuan kopi sebagai minuman berkhasiat dan berenergi pertama kali ditemukan oleh
Bangsa Etiopia di benua Afrika sekitar 3000 tahun (1000 SM) yang lalu.[5] Kopi kemudian
terus berkembang hingga saat ini menjadi salah satu minuman paling populer di dunia yang
dikonsumsi oleh berbagai kalangan masyarakat.[rujukan?] Indonesia sendiri telah mampu
memproduksi lebih dari 400 ribu ton kopi per tahunnya.[6] Di samping rasa dan aromanya
yang menarik, kopi juga dapat menurunkan risiko terkena penyakit kanker, diabetes, batu
empedu, dan berbagai penyakit jantung (kardiovaskuler) (Anonim, 2010)
Kafein merupakan jenis alkaloid yang secara alamiah terdapat dalam biji kopi, daun teh, daun
mete, biji kola, biji coklat, dan beberapa minuman penyegar. Kafein memiliki berat molekul
194.19 dengan rumus kimia C8H10N8O2 dan pH 6.9 (larutan kafein 1% dalam air). Secara
ilmiah, efek langsung dari kafein terhadap kesehatan sebetulnya tidak ada, tetapi yang ada
adalah efek tak langsungnya seperti menstimulasi pernafasan dan jantung, serta memberikan
efek samping berupa rasa gelisah (neuroses), tidak dapat tidur (insomnia), dan denyut jantung
tak berarturan (tachycardia). Dari beberapa literatur, diketahui bahwa kopi dan teh banyak
mengandung kafein dibandingkan jenis tanaman lain, karena tanaman kopi dan teh
menghasilkan biji kopi dan daun teh dengan sangat cepat, sementara penghancurannya sangat
lambat (Hermanto, 2007)
Tapi, di balik kandungan kafein yang lumayan besar itu, kopi sebetulnya memiliki segudang
manfaat bagi manusia. Khasiat kopi yang sudah umum dikenal orang sejak dulu adalah
mengurangi rasa kantuk dan lelah. Kafein yang terkandung dalam kopi mampu merangsang
sistem saraf pusat, sehingga kita bisa berpikir cemerlang, tidak mengantuk, dan konsentrasi
kita terjaga. Ini karena saraf kita terstimulasi, terang Saptawati Bardosono, pakar gizi dari
Universitas Indonesia. Selain itu, senyawa kafein yang tergolong alkaloid itu sebetulnya juga
mampu meningkatkan kewaspadaan saraf motorik. Kafein pun menimbulkan perangsangan

pada sistem pernafasan dan sistem pembuluh darah dan jantung. Hasilnya, orang yang
meminum kopi akan mampu lebih berkonsentrasi dalam melakukan pekerjaannya. Selain itu,
orang akan merasa lebih segar setelah meminum kopi. Hal inilah yang membuat banyak
orang mengkonsumsi kopi di pagi hari. Namun, teori itu ditentang oleh Profesor Peter Rogers
dari Universitas Bristol, Inggris. Menurut penelitian yang dilakukannya, kafein yang
terkandung dalam kopi tersebut tidak akan akan memunculkan khasiat-khasiat itu bila orang
yang meminumnya sudah terbiasa dengan pengaruh kafein (Anonim, 2008).
Prosedur
A.Operasional Kromatografi Cair
Catatan : Jangan pernah membiarkan pompa beroperasi tanpa filter pelarut terendam dalam
pelarut
Pilih panjang gelombang UV-sinar tampak dan nyalakan detektor untuk standby. Setelah 1
menit nyalakan detektor ke posisi ON. Pengaturan 0,04AUFS akan cukup.
Jika pompa belum dinyalakan, pertama pilih solvent line yang diperlukan (solvent select dial)
dan keluarkan solvent line dengan gambar sekitar 20 mL pelarut keluar melalui flush outlet
(berada dibawah solvent select dial). Lakukan ini dengan menggunakan syringe, masukkan
dalam outlet, buka katup dan keluarkan solvent. Tutup katup kembali.
Pada saat pelarut telah terpilih dengan tepat, turn on pompa dan secara perlahan naikkan laju
aliran pada level yang diinginkan. Tunggu sekitar 15-20 detik antara tiap kenaikkan dalam
pengaturan aliran. Bila aliran telah di-set, tunggu paling tidak 15 menit agar kolom
menyesuaikan dengan pelarut yang baru sebelum menginjeksikan sampel.
Bila aliran pelarut diubah pada saat running, misal dari 0,8 ke 1,2 mL/menit, lakukan
pengaturan ke aliran yang baru dengan perlahan dan tunggu 5-10 menit hingga stabil.
Jika aliran pelarut harus dihentikan, kurangi thumbwheel setting dengan perlahan ke angka
nol, dan switch off pompa. Pada saat ini, pelarut dapat diubah ke pilihan selanjutnya.
Melakukan Injeksi : Semua volume injeksi yang akan dilakukan adalah 10L. Bilas syringe
beberapa kali dengan pelarut dan sampel sebelum mengambil 10L aliquot. Pastikan tidak
terdapat gelembung udara dalam tabung syringe yang mungkin masuk. Putar katup injeksi ke
load, putar retaining arm kebawah untuk melepas plug stopper dan cabut plug. Masukkan
jarum syringe ke dalam injection loop dan injeksikan larutan. Kembalikan plug, putar
retaining arm untuk mengencangkan plug, dan selesaikan injeksi dengan cara memutar katup
ke posisi inject. Pencatat (recorder) akan start secara otomatis.
Pengaturan recorder : Menggunakan Shimadzu recorder. Atur speed pada 5, dan attenuation
pada 3.
Shut-down procedure : Pada saat kromatogram terakhir telah terekam kolom sebaiknya
dikembalikan ke kondisi yang sesuai untuk storing, yang mana ini berarti kolom harus
disiram dengan 50/50 MeOH/air pada 1 mL/menit selama sekitar 20-30 menit dan kemudian
laju aliran dikembalikan ke nol. Maka ganti dengan pelarut ini dengan mengguankan
prosedur sebelumnya dan lakukan seperi diatas.

V.Data pengamat
No

Peak Name

RT (min)

Height (mAU)

Area mAU

cafein

4,64

115,656

10,964

Real Area
%
100.00

*Realding time 3/25/2015 15:04

*Run Time (min) 6.17
*Chanel uv_vis_1
VI. Analisa Percobaan
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul beerdasarkan perbedaaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (molekul) yang
berada pada larutan.molekul yang terlarut dalam fase gerak akan melewati kolom yang
merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan
cenderung bergerak ialah lambat di banding molekul yang berikatan lemah.
Setelah komponen telusuri dari kolom,komponen tersebut dengan analisis dengan
menggunakan detector atau dapat dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut. Senyawa-senyawa
dipisahkan berdasarkan karakter hidropobiknya. Pelarut harus dihawagaskan,prinsif kerja
kerja HPLC adalah dengan bantuan pompa fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom ke
detector.
Sampel yang di gunakan padapercobaan ialah kafein pada larutan.
Sampel dimasukan kedalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom
teerjadi pemisahaan komponenkomponen campuran,karena perbedaaan kekuatan interaksi
antara solute-solute terhadap fase diam. Solute-solut yang kurang kuat interaksinya dengan
fase diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya,solute-solut yang kuat berinteraksi
dengan fase diam akan keluar dari kolom lebih dahulu,dan di rekam dalam bentuk
kromotogram gas dengan computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja system HPLC
dan mengumpulkan serta pengelolah data hasil pengukuran HPlC
Cara kerja kerja,mula-mula solve diamil memalui pompa,solven ini dikemudian
masuk kedalam katup injeksi berputar,yang dipasang tepat pada sample loop dengan
pertolongan mikrosiring,sample dimasukan kedalam kolom . hasil pemisahan dideteksi oleeh
detector yang penampakannya di tunjukan oleh recoder.

Tekanan solve diatur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solve pada
tekanan kostan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah,yakni beberapa
militer/mnt.Recodermenghasilkan kromatografi zat-zat yang dipisakan dari suatu sampel.
Kelebihan HPLC (KCKT) di antaranya ialah ;

Percobaan dapat dilaksanakan dalam suhu kamar

Cepat dan mudah melaksanakannya
Peka,detector HPLC dapat divariasi dan unik
Bias dipakai berulang kali
Ideal untuk molekul besar dan ion
Mudah memperoleh cuplikan
Daya pisahnya baik
Dapat dihindari terjadi dekomposisi
HPLC juga dapat menganalisa senyawa yang tidak mudah menguap
dan termolabil.

VII. Kesimpulan
Kromatogram Ret,time (min) 4.640
Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolaran

Daftar Pustaka

Jobsheet.Kimia Analitik Instrumen.Politeknik Negeri Sriwijaya. Palembang;2015

http:// sumar handrayana/2016/kimia analitik II/Malang:JICA FMIPA UNM

Gambar Alat

Kolom C8