Relaxin Enhances S100A4 and Promotes Growth

Of Human Thyroid Carcinoma Cell Xenografts

A. LATAR BELAKANG
Karsinoma tiroid merupakan kanker yang paling umum dari sistem
endokrin. Disebagian besar negara-negara Barat, kanker tiroid lebih sering
terjadi pada wanita dibandingkan pria dan kanker tiroid memiliki peringkat
ketujuh dari semua kanker yang mempengaruhi perempuan. Meskipun
prognosis karsinoma tiroid berbeda seperti [karsinoma tiroid folikel (FTC) dan
karsinoma tiroid papiler (PTC)] yang lebih baik daripada kebanyakan kanker
lainnya, berkembangnya metastasis secara signifikan dapat mengurangi
tingkat kelangsungan hidup terutama pada pasien dengan FTC dan kanker
tiroid berdiferensiasi.
Sebelumnya telah ditunjukkan bahwa relaxin hormon polipeptida pada
manusia dengan karsinoma tiroid dalam kondisi tiroid tidak jinak. Relaxin
(RLN2) dapat meningkatkan motilitas sel karsinoma dan invasi secara in vitro
pada sel manusia karsinoma tiroid dimediasi oleh reseptor relaxin, reseptor
relaxin peptida 1(RXFP1). Selain itu, ditunjukkan bahwa dalam sel karsinoma
tiroid pada manusia, peningkatan migrasi melalui matriks elastin sebagai
hasil dari peningkatan produksi relaxin yang diinduksi dan sekresi dari
elastinolytic cathhepsin-L.
Kalsium mengikat protein kecil S100A4, yang juga dikenal sebagai
metastasin, metastasis dan prognosis yang jika diberikan akan berdampak
buruk pada pasien dengan karsinoma payudara, perut, kelenjar prostat,
kerongkongan,

sel kanker paru-paru tidak kecil ,usus besar, dan tiroid .

Protein S100 dikodekan dalam sebuah cluster gen pada kromosom 1q21 dan
telah terlibat seperti pertumbuhan, signaling, apoptosis, motilitas, dan
angiogenesis. S100A4 awalnya dikenal khusus sebagai protein Fibroblast dan
mengidentifikasi

fibroblas

atau

sel

epitel

dalam

transisi

epithelial-

mesenchymal. Dalam percobaan, stroma diaktifkan fibroblas dari kornea

ditampilkan untuk mengekspresikan S100A4. Intraseluler yang diidentifikasi
dapat mengikat S100A4, Nonmuscle myosin, p53, dan liprin- 1 dianggap
kausal terlibat meningkatkan kematian dan efek antiapoptotik dari S100A4.
Ekstraseluler S100A4 diyakini dapat membantu dalam metastasis tumor
dengan

menginduksi

angiogenesis

melalui

sekresi
stimulasi

matriks
motilitas

metaloproteinase,
sel

endotel,

mendorong
dan

dengan

meningkatkan pembentukan plasmin dengan mengikat reseptor Annexin

pada permukaan sel endotel II.

S100A4 ditunjukkan tidak bersifat

tumorigenic tetapi secara signifikan meningkatkan metastasis sel tumor

pada

model

tikus

transgenik.

Baru-baru

ini,

ekspresi

gen

S100A4

digambarkan sebagai penanda untuk prognosis buruk pada karsinoma tiroid

dan sebagai faktor prognostik yang berdiri sendiri untuk metastasis kelenjar
getah bening di microcarcinomas papiler. Dalam model tikus karsinoma tiroid
anaplastik, S100A4 ditunjukkan untuk menengahi pertumbuhan tumor dan
metastasis. Dalam studi ini, kami menunjukkan bahwa produksi S100A4
secara signifikan ditingkatkan dengan relaxin pada manusia dengan sel
karsinoma tiroid . Motilitas meningkatkan efek relaxin dan bergantung pada
S100A4 dalam sel karsinoma tiroid manusia. aktivitas proangiogenic dari
S100A4

memiliki potensi angiogenik dengan meningkatkan relaxin yang

ditentukan oleh in vitro assay angiogenesis dan peningkatan kepadatan

microvessel di xenograft sel FTC manusia dengan ekspresi konstitutif relaxin.
B. PRINSIP KERJA
Thyroid Carcinoma sel Baris dan transfectants Kultur Sel.
Tiroid manusia baris sel karsinoma FTC133, FTC236, FTC238, 8505-C,
C643, dan ML-1 yang disebarkan di media DMEM F12 / Ham (Invitrogen). BCPAP yang dibudidayakan di RPMI (Invitrogen) dan ditambah dengan 1.125
g / L natrium karbonat (Merck) dan 10% FCS (Biowest, Jerman). TT2609- C02
dikultur di RPMI dilengkapi dengan 1.125 g / L natrium karbonat, 20% FCS,
1% natrium piruvat (SigmaAldrich), dan 1% insulin-transferin-selentite
(Invitrogen).

Stabil

FTC133-Pires-EGFP-RLN2

dan

FTC133-pIRESEGFP

transfectans pengendalian vektor yang dijelaskan sebelumnya. C643pcDNA4 HisMax (C643-HisMax) dan C643- S100A4 di pcDNA4 HisMax (C643S100A4) transfectants stabil dipilih dan dikultur dengan 100 mg / mL Zeocin
(Invitrogen). Semua sel diinkubasi dalam 5% CO2 atmosfer dilembabkan
pada 37 C dan passaged setiap 3 sampai 4 menggunakan 0,5% Trypsin /
EDTA (Invitrogen).
Treatment relaxin.

Untuk

inkubasi

pada

manusia

menggunakan

rekombinan Relaxin2 (rhRLN2), sel-sel karsinoma tiroid dikultur dalam media

yang mengandung 1% FCS selama 24 jam sebelum pengobatan dengan 100
ng / mL rhRLN2 (Phoenix Farmasi) dalam 1% FCS pada waktu 24, 48, dan 72
jam. Media yang mengandung rhRLN2 berubah setiap hari. Sel yang dipanen
di Trizol untuk ekstraksi RNA atau 2 mengurangi penyangga Laemmli untuk
ekstraksi protein
Jaringan tiroid manusia. Jaringan tiroid manusia pada tiroid normal,
adenoma tiroid, gondok, dan karsinoma tiroid dikumpulkan dari pasien di

Departemen Bedah, Universitas Halle-Wittenberg, dengan reseksi bedah

untuk indikasi klinis. Penelitian ini telah disetujui oleh komite etika dari
Martin-Luther-Universitas, Fakultas Kedokteran. Semua pasien memberikan
persetujuan

tertulis.

Untuk

immunolocalization

protein

S100A4,

paraformaldehyde-tetap dan parafin yang tertanam pada jaringan pasien

yang digunakan seperti yang dijelaskan (Tabel 2). Untuk analisis Western blot
(Gbr. 2B), total 66 jaringan tiroid manusia digunakan, termasuk 8 jaringan
gondok, 8 adenoma, 20 jaringan karsinoma folikular (FTC), 19 jaringan
karsinoma papiler (PTC), dan 11 dibeda-bedakan jaringan karsinoma
[anaplastik (UTC)]. Untuk analisis transkripsi (Gambar. 2A), 58 jaringan tiroid
manusia digunakan, termasuk 11 gondok, 13 adenoma, 11 folikel (FTC), 12
papiler (PTC), dan 11 anaplastik (UTC) jaringan kanker tiroid. Empat utama
PTC sampel jaringan manusia yang didefinisikan stage metastasis

yang

dipilih untuk masing-masing kelompok pada Gambar. 2C.

Deteksi dan Lokalisasi S100A4 pada Manusia Thyroid Carcinomadi
sel Baris dan Jaringan. Ekstraksi RNA dan Transkripsi-PCR. total RNA
dari garis sel karsinoma tiroid dan jaringan tiroid diekstraksi dengan
menggunakan reagen Trizol (WKS) dan jumlah total RNA terisolasi diukur
dengan spektrofotometer (UV-1602, Shimadzu) pada 260 dan 280 nm. Total
RNA (1 mg) digunakan untuk sintesis cDNA menggunakan superscript
reverse transcriptase II dan 100 ng / mL primer acak 50 (Invitrogen). Untuk
amplifikasi

digunakan

S100A4,

RXFP1,

oligonukleotida spesifik (Metabion; Tabel 1) .

standar

untuk

analisis

PCR

semikuantitatif.

RLN2,

dan

18S,

primer

18S RNA berfungsi sebagai

Kondisi

terbalik

untuk

transkripsi-PCR (RT-PCR) yang dijelaskan sebelumnya (10). Jumlah tersebut

siklus dan suhu pendinginan yang spesifik untuk setiap primer (lihat Tabel 1).
Produk PCR dipisahkan pada gel agarosa 2%. Sebuah perangkat lunak Kodak
(Kodak Digital Ilmu 1D v.3.0.2., Eastman Kodak) digunakan untuk melakukan
kuantifikasi densitometri produk PCR tertentu menggunakan 18S produk PCR
sebagai standar internal

(untuk Gambar. 4C). Untuk kuantisasi, 1 uL

campuran reaksi reverse transcriptase ditambahkan ke campuran reaksi 25

uL terdiri dari 1 2 Keuntungan penyangga reaksi, 1,5 unit
Taq polimerase (CLONTECH), 0,2 SYBR Hijau (Biozym), 200 umol / L
masing-masing trifosfat deoksinukleotida, dan 0,5 umol / L masing-masing
primer yang terdaftar (Tabel 1). Sebuah kontrol negatif tanpa template yang
disertakan. Tes dilakukan dalam tiga ulangan dalam Rotor-Gene 2000 (LTF).
Denaturasi awal pada 95 C selama 300 s diikuti oleh 40 siklus dengan

denaturasi pada 95 C selama 15 s, pendinginan pada suhu 60 C selama

30 s, dan perpanjangan pada 72 C selama 20 s. Untuk memverifikasi
produk PCR tunggal, kurva mencair yang dihasilkan dan amplikon diklon dan
diurutkan bidirectionally. Intensitas fluoresensi dari untai ganda spesifik SYBR
Hijau, mencerminkan jumlah produk yang terbentuk PCR, dibacakan setelah
setiap langkah perpanjangan 82 C. Kuantisasi relatif ekspresi gen dilakukan
dengan software Rotor-Gene versi 4.6 dalam modus kuantisasi komparatif.
SD ditentukan dengan uji t.
Ekstraksi protein. Untuk ekstraksi protein total, sel-sel dan jaringan yang
segaris dalam 2 mengurangi penyangga Laemmli [125 mmol / L Tris-HCl
(pH 6,8; Fluka), 4% SDS (Sigma), 20% gliserol (Merck), 10% mercaptoethanol
(Sigma), dan 2% bromphenol biru (Serva)] mengandung koktail PI (Roche).
Untuk

fraksinasi

protein,

sel-sel

segaris

dalam buffer hipotonik

dan

sitoplasma dan protein nuklir diekstraksi secara terpisah (lihat Tambahan

Data). Untuk deteksi disekresikan S100A4, FTC133- RLN2 dan FTC133-EGFP
transfectants dikultur dalam medium dengan 1% janin bovine serum selama
72 jam. Supernatan kultur disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit
untuk pelet sel yang tersisa dan terkonsentrasi di centrifuge vakum
(Concentrator 5301, Eppendorf). Konsentrasi protein ditentukan dengan uji
Bradford (Bio-Rad). Supernatannya dicampur dengan 2 mengurangi
Laemmli-buffer (1: 1 vol / vol) dan 50 sampai 80 ug setiap pengukuran
digunakan untuk analisis Western blot.
Western Blot Analysis. Untuk mendeteksi S100A4 dan S100A6, 40 uL
ekstrak protein dipisahkan pada 12% SDS gel dan diblot ke membran
polyvinylidene difluorida (GE Healthcare). Setelah menghambat di 0,1% PBST dengan 3% bovine serum albumin (Sigma), membran diinkubasi semalam
pada suhu 4 C dengan 1: 500 dilusi baik poliklonal kelinci S100A4 Ab-8
antibodi atau antibodi S100A6 (kedua NeoMarkers). Setelah mencuci,
membran diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dengan horseradish
peroksidase terkonjugasi kambing anti-rabbit IgG antibodi sekunder (Santa
Cruz) diencerkan 1: 20.000. Pewarnaan spesifik divisualisasikan dengan
ditingkatkan chemiluminescence kit (Pierce). Untuk mendeteksi Xpress tag,
membran diperiksa semalam pada suhu 4 C dengan monoklonal AntiXpress Antibody (Invitrogen) diencerkan 1: 1.000. Horseradish peroksidaseconjugated

antibodi sekunder kambing-anti tikus (Santa Cruz) digunakan

pada 1: 20.000. Sitoplasma dan protein nuklir fraksi diverifikasi dengan

antibodi monoklonal tikus yang ditujukan terhadap -tubulin (sitosol;

Invitrogen) pada 1: 5.000 dan Histon H3 (nuklir; Chemicon) pada 1: 500,

masing-masing. -aktin (Sigma) dan -tubulin (Abcam) digunakan sebagai
beban kontrol. Imunohistokimia. Paraformaldehyde tetap dan bagian-parafin
tertanam pada jaringan manusia (5 m) pasien dengan tiroid normal; gondok;
adenoma; dan folikular, papiler, karsinoma tiroid berdiferensiasi dan (Tabel 2
di ref. 10) digunakan untuk lokalisasi seluler S100A4. Bagian diobati dengan
penyangga sitrat (pH 6.0) untuk pengambilan antigen dan diblokir di TBST
mengandung

1%

normal.antiserum

albumin
Kelinci

serum

sapi

poliklonal

dan

5%

S100A4

serum

(Ab-8,

kambing

NeoMarkers)

diaplikasikan pada 1: 200 semalam pada suhu 4 C. Kontrol negatif

dilakukan dengan menggunakan serum kelinci nonimmune pada 1: 200.
Kambing

AP-terkonjugasi

anti-kelinci

imunoglobulin

antibodi

sekunder

(Dianova) pada 1: 300 digunakan selama 1 jam pada suhu kamar dan
visualisasi yang spesifik mengikat dicapai dengan menggunakan kit APsubstrat (HistoMark Red, Kirkegaard & Perry Laboratories). Imunohistokimia.
Paraformaldehyde tetap dan bagian-parafin tertanam pada jaringan manusia
(5 m) pasien dengan tiroid normal; gondok; adenoma; dan folikular, papiler,
karsinoma tiroid berdiferensiasi dan (Tabel 2 di ref. 10) digunakan untuk
lokalisasi seluler S100A4. Bagian diobati dengan penyangga sitrat (pH 6.0)
untuk pengambilan antigen dan diblokir di TBST mengandung 1% albumin
serum sapi dan 5% serum kambing normal.antiserum Kelinci poliklonal
S100A4 (Ab-8, NeoMarkers) diaplikasikan pada 1: 200 semalam pada suhu 4

C.

Kontrol

negatif

dilakukan

dengan

menggunakan

serum

kelinci

nonimmune pada 1: 200. Kambing AP-terkonjugasi anti-kelinci imunoglobulin

antibodi sekunder (Dianova) pada 1: 300 digunakan selama 1 jam pada suhu
kamar dan visualisasi yang spesifik mengikat dicapai dengan menggunakan
kit AP-substrat (HistoMark Red, Kirkegaard & Perry Laboratories).
S100A4 pada Thyroid Carcinoma Sel Motilitas
Pembentukan transfectants Stabil C643 Sel dengan Ekspresi FullSize S100A4.

PCR amplifikasi ukuran penuh manusia S100A4 dilakukan

pada cDNA dari FTC 133 sel dengan primer berikut pengkodean situs NH2terminal BamHI diikuti dengan tag Xpress dan maju manusia S100A4 coding
urutan [FXpress-huS100A4-BamHI (5'-ATG GAT CCA TGG GTC TGT ACG ACG
ATG ACG ATA AGA

CCG GTG CGT GCC

CTC TGG AGA AG-3 ') dan

RhuS100A4-SalI (5'-ATG TCG ACT CAT TTC TTC CTG GGC TGC TTA TC-3')].
Produk PCR tunggal dipotong dari yang rendah titik lebur agarosa gel, resin
dimurnikan

(Promega)

dan

diligasi

di

pGEM-T

(Promega).

Konstruksi

dikonfirmasi oleh analisis urutan dari kedua situs, dipotong dengan BamHI
dan SalI, resin murni, dan dikloning ke pcDNA4 HisMaxC (Invitrogen). Sel
C643 transfected dengan vektor kosong dan vektor pcDNA4HisMaxCS100A4
(Tambahan Gambar. S3) menggunakan Lipofectamine 2000 kit sesuai dengan
protokol pabrikn(Invitrogen). Transfectants stabil dipilih dengan 100 mg / mL
Zeocin. Transfectants positif diidentifikasi dengan analisis Western dengan
antibodi monoklonal tikus anti-Xpress (Invitrogen) dan antibodi poliklonal
kelinci ke S100A4 (Abnova) seperti yang dijelaskan untuk analisis Western
Proliferasi Uji. Untuk menentukan perubahan dalam proliferasi sel, tes
MTT dilakukan pada C643-S100A4 transfectants dan kontrol masing-masing
(transfectants vektor kosong dan sel-sel tua). Sel berlapis pada 96- pelat baik
pada kepadatan 0,25, 0,5, dan 1 104 sel per sumur dalam 100 mL medium
kultur dan berbudaya selama 24 jam sebelum melakukan uji sesuai dengan
instruksi pabrik (Easy-untuk-Anda; Biomedica ).
Percobaan S100A4 siRNA. Sirna knockdown dari S100A4 di FTC133 dan
FTC238 tiroid sel karsinoma dilakukan oleh transfections

menggunakan

S100A4 kecil RNA campur (siRNA; antisense 5'-AG CUU GAA CUU GUC ACC
CTC-3 '; Ambion). Sel (8 104) yang diunggulkan pada pelat kultur enam
sumur. S100A4 siRNA dan kontrol nonsilencing siRNA (30, 50, dan 100 nmol /
L; Ambion) yang kompleks dengan SilentFect reagen (Bio-Rad) atau
Lipofectamine 2000 (Invitrogen) dalam serum bebas OptiMem menengah
dan sel pada 60% confluency digunakan untuk transfections. Nonsilencing
siRNA dan SilentFect atau Lipofectamine reagen saja menjabat sebagai
kontrol negatif. Protein diisolasi dengan Laemmli-buffer 24, 48, dan 72 jam
setelah transfeksi dan dianalisis dalam Western blot.
Uji Motilitas. Untuk menilai motilitas sel S100A4 siRNA knockdown, 24
Transwell ruang (Greiner) tes digunakan seperti yang dijelaskan sebelumnya
(10). FTC133 (1 104 sel) transfected dengan siRNA untuk S100A4 atau
kontrol siRNA (baik di 30 nmol / L) yang berlapis dalam 200 mL media di atas
8-pM pori filter dimasukkan(atas chamber). ruang rendah yang terkandung
500 mL medium kultur yang mengandung 1% FCS. Setelah 24 jam, sel-sel
yang telah bermigrasi ke bagian bawah filter yang bernoda dan dihitung
seperti yang dijelaskan sebelumnya (10). Untuk mengetahui pengaruh RLN2
pada motilitas C643 transfectants dengan ekspresi S100A4, rhRLN2 pada
100 ng / mL adalah ditambahkan ke bawah ruang dan sel motilitas stabil
C643-S100A4 dan transfectants stabil C643-mock diuji seperti dijelaskan di

atas. Semua eksperimen dilakukan setidaknya dalam tiga ulangan dan

dinyatakan sebagai nilai rata-rata SEM.
Peran Relaxin pada Pertumbuhan Tumor dan Angiogenesis
Pertumbuhan tumor pada Mencit Nude. Tikus laki-laki (NMRI), 10
sampai 15 g berat badan diperoleh dari Laboratorium Sentral Hewan dari
Sekolah Kedokteran dan dibiakkan dalam kondisi bebas patogen di bawah 12
/ 12- jam terang / gelap jadwal dan dilengkapi dengan standar diet.
Percobaan tikus telanjang telah disetujui oleh Komite Etika Hewan dari Martin
Luther-Universitas Halle-Wittenberg. Lima tikus pada 3 minggu usia yang
digunakan untuk FTC133-EGFP dan untuk masing-masing dua transfectants
FTC133-RLN2 (klon 4 dan 10). Sel-sel tumor disuntikkan S.C. pada 2 107
sel / mL dalam media tanpa janin sapi serum yang mengandung 1 mmol / L
natrium piruvat. Situs Injeksi diperiksa setiap hari; tumor diukur dua kali
seminggu; dan volume tumor yang ditentukan sesuai dengan pengukuran
caliper dan formula untuk menentukan volume ellipsoid. Mencit dikorbankan
ketika ukuran tumor melebihi 10% dari ukuran tubuh. Tumor primer
dikumpulkan dan tikus dibedah dan diperiksa secara visual untuk metastasis.
Jaringan tumor yang cryopreserved dan tetap di 4% paraformaldehyde untuk
embedding paraffin. H & E pewarnaan dan Imunodeteksi dari Ki67 dan CD31
dilakukan seperti dijelaskan di atas. Untuk penilaian kuantitatif proliferasi in
vivo, tiga tumor untuk setiap klon sel dinilai. Sel Ki67-positif dihitung dalam
tiga bagian masing-masing jaringan xenograft dan jumlah sel positif Ki67 per
area milimeter persegi ditentukan.
Pembentukan tabung Dalam uji vitro. Manusia pusar sel endotel vena
(HUVEC) yang dibeli dari BD Biosciences dan PromoCell, tumbuh pada cultur
termos dilapisi dengan 2% gelatin (Sigma), dan disebarkan di EGM-2 media
pertumbuhan sel endotel (Lonza). Untuk ini uji in vitro angiogenesis , HUVEC
digunakan pada bagian faktor-dikurangi Matrigel dibeli dari BD Biosciences
dan digunakan sesuai dengan instruksi pabriknya 6 sampai 8. Pertumbuhan.
Untuk menilai pembentukan tabung, 300 uL Matrigel digunakan per sumur
piring 24-baik. Setelah polimerisasi Matrigel, 5 104 / baik sel HUVEC yang
diunggulkan di atas Matrigel dalam volume total 500 mL media tanpa dan
dengan peptida berikut: 1 dan 0,5 mg / mL manusia rekombinan S100A4
(rhS100A4; Abnova), 100 ng / mL rhRLN2 (Phoenix), dan 10 nmol / L faktor
pertumbuhan endotel vaskular (BD Biosciences). Pembentukan pipa kapiler
seperti didokumentasikan setelah 18 jam dengan Mikroskop terbalik (Zeiss,

Axiovert 100). Daerah pipa kapiler yang dihitung dengan menggunakan

AxioVision 4,2 software dan ditampilkan sebagai persen dari total luas.
Analisis Statistik
Semua eksperimen dilakukan setidaknya dalam tiga ulangan dan data
dinyatakan sebagai mean SEM. Software Kodak (Kodak Digital Ilmu 1D
v.3.0.2.) Digunakan untuk melakukan densitometri semikuantitatif PCR dan
Western produk tertentu. Uji t dan satu arah software ANOVA digunakan
untuk menghitung untuk signifikansi statistik dengan P 0,05 dianggap
signifikan. Sebuah referensi untuk metode statistik yang digunakan dibuat di
setiap legenda gambar mana yang berlaku. Data dari karsinoma tiroid
jaringan dari pasien menggambarkan dalam kotak dan whisker diagram.
C. PEMBAHASAN
Monomer dan dimer S100A4 Terdeteksi di Manusia Thyroid
Carcinoma sel Baris dan Manusia Thyroid Carcinoma Jaringan. The
folikel manusia (FTC133, FTC-236, dan FTC- 238, ML-1), papiler (B-CPAP), dan
anaplastik (8505- C, C-643, 101-BHT) baris sel karsinoma tiroid semua
transkrip diungkapkan untuk S100A4 sebagaimana ditentukan oleh RTPCR
(Gbr. 1A). Baris sel kanker tiroid ini juga menyatakan transkrip untuk RLN2
(10) dan RXFP1 (Gbr. 1A), dengan pengecualian FTC133 sel yang tanpa RLN2.
Analisis Western digunakan untuk menentukan adanya S100A4 total lysates
protein. Ekspresi bentuk monomer 10-kDa dari S100A4 terdeteksi pada
FTC133, di ML-1, dan B-CPAP (Gambar. 1B). Garis lainnya tiroid manusia sel
karsinoma

diselidiki

(FTC236,

FTC238,

B-CPAP,

8505-C,

dan

C643)

menyatakan bentuk dimer 20-kDa dari S100A4 seperti yang ditunjukkan di

sini selama 8505-C dan B-CPAP (Gambar. 1C). S100A4 siRNA percobaan
knockdown menunjukkan bahwa SDS-tahan 20-kDa S100A4 protein band ini
memang menurunkan regulasi mengikuti 72 jam pengobatan siRNA seperti
yang ditunjukkan di sini FTC238 tiroid sel karsinoma (Gambar. 1D). Aktivitas
gen S100A4 dan kandungan protein meningkat pada jaringan karsinoma
tiroid (PTC, FTC, dan UTC) dibandingkan dengan gondok dan adenoma
jaringan, dan nilai rata-rata tertinggi terdeteksi pada karsinoma tiroid
berdiferensiasisampel jaringan (Gbr. 2A dan B) dengan signifikansi statistik
terdeteksi untuk nilai RNA saja (Tambahan Gambar. S1). Protein S100A4
diungkapkan dalam sel karsinoma tiroid dari semua jenis histologis diselidiki,
terutama lokal dalam sitoplasma dengan pewarnaan nuklir hanya sporadis
(Gambar. 3D-F). Selanjutnya, jaringan tumor primer PTC dengan getah
bening diketahui simpul metastasis, meskipun hanya beberapa jaringan
diselidiki, menunjukkan kecenderungan untuk konsentrasi S100A4 lebih

tinggi dari PTC tanpa metastasis nodal atau jauh, menunjukkan peran
S100A4 di fase awal invasi pada kanker tiroid (Gbr. 2C). Dalam spesimen
jaringan tiroid, kami terutama mendeteksi bentuk monomer dari S100A4.
Thyrocytes berasal dari jaringan manusia normal tiroid (Gambar. 3A),
jaringan gondok (Gambar. 3B), dan manusia jaringan adenoma tiroid
(Gambar. 3C) yang tanpa protein S100A4. Namun, sel-sel otot polos pada
dinding arteri dan vena pembuluh, diidentifikasi oleh immunoreaction positif
untuk aktin otot polos (Gambar. 3J), bernoda intens untuk immunoreactive
S100A4 (Gambar. 3B dan C).
RLN2 Peningkatan Ekspresi S100A4 di Manusia
Thyroid Carcinoma sel Baris dan S100A4 siRNA
Pengobatan Menghambat RLN2-Induced Motilitas Ditingkatkan
Semua klon transfectant stabil FTC133 dengan ekspresi relaksin (FTC133RLN2) ditampilkan ditandai regulasi S100A4 mRNA (data tidak ditampilkan)
dan

protein

(Gambar.

4A)

bila

dibandingkan

dengan

FTC133-EGFP

transfectants mock atau FTC133 untransfected. Baik folikuler manusia dan

tiroid anaplastik sel kanker FTC133 dan C-643, masing-masing, merespons
pengobatan

dengan

RLN2

rekombinan

manusia

(rhRLN2)

dengan

peningkatan S100A4 mRNA dan protein seperti yang ditunjukkan untuk

protein S100A4 di FTC133 (Gambar. 4B) dan transkrip S100A4 di C643
(Gambar. 4C). Untuk menentukan fungsi biologis S100A4 untuk motilitas sel
kanker tiroid manusia, kami melakukan knockdown siRNA spesifik S100A4
pada manusia
tiroid garis sel karsinoma FTC133 diikuti oleh tes motilitas. Ekspresi band
monomer S100A4 di FTC133 berkurang ke tingkat yang hampir tidak
terdeteksi 72
jam setelah siRNA transfeksi bila dibandingkan dengan nonsilencing
kontrol siRNA (Gambar. 5A). SiRNA knockdown adalah khusus untuk S100A4
karena ekspresi protein EF-tangan kalsium mengikat secara struktural terkait
S100A6 tidak terpengaruh (Tambahan Gambar. S2). Selanjutnya, kami
meneliti motilitas sel kanker tiroid ini S100A4 siRNA dirawat di-filter
berdasarkan tes motilitas di hadapan dan tidak adanya rhRLN2. Kami
sebelumnya telah menunjukkan bahwa RLN2 meningkatkan motilitas sel dan
invasi sel karsinoma tiroid manusia (10). The S100A4 siRNA knockdown di
FTC133 sel menghasilkan sedikit berkurang dibandingkan dengan motilitas
FTC133

sel

diperlakukan

dengan

nonsilencing

siRNA

(Gambar.

5B).

Selanjutnya, S100A4 siRNA-diperlakukan FTC133 terkena rhRLN2 (100 ng /

mL) selama 24 dan 48 jam tidak lagi mampu merespon dengan peningkatan

motilitas (Gambar. 5B), menunjukkan bahwa S100A4 dimediasi ini respon

migrasi disebabkan downstream RLN2-RXFP1 signaling . Untuk menyelidiki
apakah

eksogen

S100A4

dapat

melewati

efek

RLN2-RXFP1-diinduksi

meningkat motilitas, kami diblokir RLN2-RXFP1 sinyal melalui RXFP1 siRNA

knockdown di induk FTC133 sel (Tambahan Gambar. S5). Seperti yang
diharapkan, RXFP1 knockdown mencegah peningkatan motilitas RLN2diinduksi, tapi eksogen rhS100A4 mampu menyelamatkan fenotipe RXFP1
dan peningkatan motilitas (Gambar. 5C).
S100A4 Peningkatan Sel Motilitas C643-S100A4
Anaplastik tiroid transfectants
Kami menghasilkan C643-S100A4 transfectants stabil yang diungkapkan
Xpress-tag S100A4 manusia (lihat Gambar Tambahan S3;.. Gambar 6A) untuk
mengetahui pengaruh peningkatan lebih lanjut dalam S100A4 pada motilitas
garis sel UTC manusia C643. Semua stabil transfectants C643-S100A4
menunjukkan peningkatan motilitas sel bila dibandingkan dengan kontrol
C643-C643 HisMax atau sel induk (Gambar. 6B). Ekspresi S100A4 tidak
meningkatkan proliferasi sel di C643- S100A4 transfectants (Gambar. 6C).
Dengan demikian, meningkatkan tingkat sel protein S100A4 di C643 lebih
ditingkatkan motilitas sel kanker tiroid anaplastik ini. Walaupun pengobatan
rhRLN2 (100 ng / mL) menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam
motilitas sel tiruan C643 dan C643-HisMax, transfectants C643-S100A4 gagal
menanggapi eksogen rhRLN2 dengan tingkat motilitas yang lebih tinggi
(Gambar.

6D),

bertepatan

menunjukkan

dengan

bahwa

potensi

tingkat

migrasi

transfectants.
RLN2 Meningkatkan Pertumbuhan
Xenograft pada

meningkat

maksimal

dari

dari

S100A4

C643-S100A4

dan Vaskularisasi dari Tumor

Tikus Nude. Percobaan xenotransplant dilakukan untuk

mengetahui kemampuan FTC133-RLN2 transfectantssecara stabil untuk

menghasilkan tumor pada tikus. Keduanya FTC133-RLN2 klon yang diuji
menghasilkan

pertumbuhan

xenografts

besar,

sedangkan

peningkatan

protein fluorescent hijau (EGFP) klon hanya menghasilkan tumor nodular

padat kecil (Gambar. 7A). 4 tikus kloning pembawa FTC133-RLN2 terpaksa
dikorbankan 3,5 minggu setelah

injeksi sub cutan dan

10 tikus kloning

dikorbankan setelah 5 minggu diinokulasi dengan FTC133-RLN2 ketika tumor

melebihi 10% dari berat badan mereka. Analisis histologis mengungkapkan
sel tumor diatur melaui RLN2 xenografts akan tetapi massa sel tumor padat
dalam xenografts EGFP. Proliferasi penanda Ki67 itu immunolocalized di
sekeliling jaringan xenotransplant menampilkan beberapa FTC 133-RLN2

transfectants menjalani pembelahan mitosis (Gambar. 7B, c). Sebaliknya,

FTC133-EGFP

hanya

menunjukkan

terisolasi

Ki67-Sel-sel

yang

positif

(Gambar. 7B, d). Kuantifikasi sel Ki67-positif menunjukkan peningkatan

proliferasi sel FTC133-RLN2 in vivo (Gambar. 7C).
Pada penampilan kasar, tumor FTC133-RLN2
beberapa

pembuluh

darah

kecil

dan

menunjukkan

peningkatan

adanya

vaskularisasi

ini

dikonfirmasi oleh deteksi CD31 immunoreactive pada lapisan endotel

pembuluh darah kecil (Tambahan Gambar. S4A dan B). Ketika antibodi primer
digantikan oleh serum nonimmune, ada immunostaining tertentu terdeteksi
(Tambahan Gambar. S4, sisipan). Penilaian kuantitatif kepadatan microvessel
di bagian tumor berturut-turut mengungkapkan sejumlah signifikan lebih
tinggi dari pembuluh darah pada tumor FTC133- RLN2 dibandingkan dengan
tumor FTC133-EGFP FTC133-EGFP (Gambar. 8A). Pemeriksaan rinci dari
bangkai tidak mengungkapkan metastasis lokal atau jauh di salah satu tikus
telanjang dengan xenotransplants.
Disekresikan S100A4 Menstimulasi in vitro Angiogenesis dari
HUVEC .

Untuk mengetahui peran potensi angiogenetic ekstraseluler

S100A4 pada jaringan xenograft,

diuji FTC133- EGFP dan FTC133-RLN2

transfectants karena kemampuan nya untuk mensekresikan S100A4 ke

dalam medium kultur. Supernatan terkonsentrasi dari FTC133-EGFP dan
FTC133-RLN2

transfectants

terkandung

disekresikan

10-kDa

S100A4

monomer seperti yang ditunjukkan untuk FTC133-EGFP dan FTC133-RLN2

kloning 10 (Gambar. 8B). Untuk memberikan bukti lebih lanjut untuk peran
S100A4

peningkatan

vaskularisasi

dan

tumor

pertumbuhan,

kami

menggunakan sel manusia rekombinan S100A4, rhRLN2, dan HUVEC endotel

dalam

in

vitro

uji

angiogenesis.

100A4

mampu

mempromosikan

pembentukan tabung kapiler seperti pada Matrigel (Gambar. 8C). Potensi

angiogenetic

serupa

diamati

dengan

rhRLN2

(Gambar.

8C).

Tingkat

pembentukan pipa kapiler seperti yang disebabkan oleh S100A4 dan RLN2
adalah sebanding dengan faktor angiogenik dikenal pertumbuhan endotel
vaskular faktor A digunakan sebagai kontrol positif (Gambar. 8C).
Diskusi
Hormon polipeptida H2-relaxin (RNL2) meningkat pada karsinoma manusia
dan berhubungan dengan peningkatan kapasitas migrasi sel karsinoma
payudara, prostat, dan tiroid.

RLN2 menunjukkan bahwa peningkatan

motilitas pergerakan sel dan invasi matriks sel karsinoma tiroid manusia dan
tindakan ini membutuhkan RXPF1 sinyal fungsional. Namun, mekanisme

seluler mediasi ini peningkatan motilitas tidak sepenuhnya dipahami. hanya

ditunjukkan

bahwa

RLN2

menginduksi

aktivitas

gen

S100A4

dan

meningkatkan kandungan protein dalam sel karsinoma tiroid manusia. Kami

menunjukkan bahwa RLN2 secara eksklusif dinyatakan dalam jaringan
kanker tiroid tetapi tidak dalam kelenjar tiroid normal atau dalam jaringan
penyakit tiroid jinak. Menggunakan sampel tiroid manusiadengan jaringan
yang

sama

yang

digunakan

dalam

penelitian

kami

sebelumnya

menunjukkan bahwa sel-sel tiroid folikuler Nonkarsinogenik dari tiroid normal

jaringan, gondok, dan jaringan adenoma tiroid jinak itu tanpa S100A4.
Sebaliknya, thyrocytes neoplastik RLN2-immunopositive dari folikel, papiler,
karsinoma tiroid dan jaringan anaplastik coexpressed protein S100A4.
Sebelumnya, S100A4 dilaporkan untuk hadir dalam thyrocytes neoplastik
dari PTC dan FTC tapi lebih sedikit atau tidak ada dalam UTC. PCR dan
analisis Western Data semikuantitatif kami menunjukkan ekspresi S100A4
kuat di semua jaringan kanker tiroid dan jaringan penyakit tiroid normal dan
tidak berbahaya. Dalam jaringan yang terakhir, kami immunolocalized
Ekspresi S100A4 yang kuat secara eksklusif dalam sel-sel otot polos yang
melapisi arteri dan pembuluh darah vena. Ekspresi S100A4 dalam sel otot
polos arteri dan vena sebelumnya ditampilkan. Selain itu, sel-sel kekebalan
dari sistem kekebalan tubuh bawaan, seperti makrofag, sel mast, dan
neutrofil, mengungkapkan S100A4.
Kehadiran S100A4 diidentifikasi sebagai penanda untuk prognosis buruk
pada pasien dengan kanker payudara (13) dan terkait dengan metastasis
kelenjar getah bening pada pasien dengan PTC (35). Dalam penelitian ini,
PTC primer dengan getah bening simpul metastasis ditampilkan tingkat yang
lebih tinggi dari protein S100A4. Meskipun ukuran sampel yang kecil,
kecenderungan ini mungkin menunjukkan bahwa kehadiran ekspresi S100A4
yang kuat adalah prediktif parameter untuk awal metastasis kelenjar getah
bening di SD PTC. Mirip dengan laporan sebelumnya pada jaringan PTC
manusia (35), kami menemukan S100A4 akan terutama terletak di dalam
sitosol dengan pewarnaan inti hanya tersebar di tumor tunggal Sel-sel dari
ketiga subtipe karsinoma dipelajari. Kami mendeteksi 10-kDa monomer dan /
atau dimer 20-kDa S100A4 bentuk dalam jaringan kanker tiroid manusia dan
sel baris. Pembentukan SDS-tahan S100A4 dimer dan S100A4 oligomer yang
dijelaskan sebelumnya (43, 44) tapi peran fungsional oligomer SDS-tahan
yang kuat dari S100A4 masih belum diketahui. Kami mengidentifikasi S100A4
sebagai target molekul baru dari RLN2-RXFP1 sinyal. Baru-baru ini, kami

menunjukkan S100A4 ke akan menurunkan regulasi di MDA-MB-231-RLN2

transfectants (45). Dalam sel karsinoma tiroid manusia, RLN2 memiliki
berlawanan Efek dan aktivitas gen S100A4 nyata diregulasi dan tingkat
protein, efek-jenis tertentu sel menyarankan dari RLN2 regulasi S100A4.
Beberapa mekanisme telah telah dijelaskan sebelumnya untuk terlibat dalam
regulasi ekspresi gen S100A4. Metilasi DNA pada pertama intron dari S100A4
ditunjukkan untuk mengontrol ekspresi gen pada tikus baris sel karsinoma
payudara (46). Di MDA-MB- 435 sel kanker payudara manusia, integrin 64dimediasi aktivasi NFAT meregulasi aktivitas gen S100A4 dan beberapa NFAT
situs konsensus mengikat di S100A4 yang promotor diidentifikasi (43).
Luciferase S100A4 promotor konstruksi menunjukkan regulasi promotor
S100A4 manusia melalui aktivasi ErbB2 dalam sel medulloblastomaline (47).
Mekanisme regulasi di tiroid manusia
sel karsinoma belum teridentifikasi belum. S100A4
mungkin menengahi beberapa efek tumor-mempromosikan
RLN2 pada karsinoma tiroid manusia pada motilitas dan matriks
invasi (10). S100A4 knockdown oleh interferensi siRNA
mengurangi motilitas sel dalam FTC133 transfectants dan eksogen
relaxin tidak mampu untuk meningkatkan motilitas sel di S100A4
siRNA-diperlakukan FTC133 sel. Memang, transfectants stabil
dari C643 sel karsinoma tiroid dengan ekspresi konstitutif
dari S100A4 menunjukkan peningkatan motilitas sel dan
tidak mampu merespon relaxin dengan peningkatan motilitas,
menyarankan
bahwa dalam model sel ini, S100A4 tingkat protein yang
rate limiting untuk C643 motilitas. RXFP1 siRNA knockdown
di FTC133 dicegah RLN2-diinduksi peningkatan motilitas,
tapi S100A4 eksogen masih bisa memperoleh promigratory sebuah
respon, menunjukkan S100A4 untuk bertindak hilir
RLN2-RXFP1 sinyal untuk meningkatkan motilitas sel. FTC133-RLN2
transfectants yang sangat tumorigenic pada tikus telanjang, menghasilkan
cepat tumbuh dan xenografts besar dibandingkan dengan klon mengejek.
Meskipun tingkat tinggi RLN2 dan S100A4, tidak ada tikus menyimpan klon
FTC133-RLN2 menunjukkan metastasis makroskopik terlihat setelah 5
minggu pertumbuhan tumor lokal. S.C. suntikan sel tumor telah disarankan
untuk tidak permisif metastasis
Pertumbuhan melainkan mendorong pertumbuhan lokal dari xenograft.
Selain itu, pertumbuhan tumor yang cepat diamati dengan baik
Klon FTC133-RLN2 mungkin tidak diperbolehkan cukup waktu
untuk tumor untuk menghasilkan metastasis jauh pada tikus telanjang.
Salah satu ciri khas adalah peningkatan jumlah microvessels
dalam xenografts FTC133-RLN2, menunjukkan bahwa
RLN2 dan / atau S100A4 disekresikan oleh sel-sel tumor tiroid
dapat meningkatkan pertumbuhan tumor vivo dengan mempromosikan
tumor

angiogenesis. S100A4 ditunjukkan untuk memfasilitasi invasi tersebut

sel-sel endothelial di Matrigel dengan merangsang produksi
dan sekresi ekstraseluler matriks-merendahkan
enzim seperti matriks metalloproteinase 13 (kolagenase
3; ref. 23, 48, 49). Peningkatan motilitas sel endotel dan
angiogenesis tergantung pada kehadiran oligomer
ekstraseluler S100A4 (24, 50) . FTC133-xenograft terkandung
tingkat tinggi S100A4 dan kami analisis in vitro
mengungkapkan bahwa S100A4 yang disekresikan oleh FTC133-RLN2
transfectants dan kontrol vektor FTC133-EGFP, sedangkan
RLN2 yang disekresikan hanya dengan transfectants FTC133-RLN2
(10). Keduanya rhRLN2 dan rhS100A4 mampu menginduksi
pembentukan pipa kapiler seperti sel HUVEC in vitro. terpencil
Sel HUVEC dilaporkan untuk merespon relaxin
dengan peningkatan produksi oksida nitrat sintase II
dan peningkatan generasi oksida nitrat (51). Relaxin juga
terbukti menginduksi faktor pertumbuhan endotel vaskular dan
ekspresi procollagenase dalam sel endometrium manusia
dan untuk merangsang pembentukan pembuluh darah di endometrium
primata
(52, 53). Di sini, kami menunjukkan untuk pertama kalinya
Efek angiogenetic langsung RLN2 dengan mempromosikan endotel
pembentukan tabung HUVEC oleh RLN2. Dengan demikian, RLN2
dapat bertindak angiogenik oleh efek langsung pada sel endotel
dan melalui peningkatan S100A4 tingkat protein transmembran yang
reseptor reseptor untuk produk akhir glikasi lanjut
ditunjukkan menjadi reseptor untuk protein S100
(54-56), berpotensi termasuk S100A4 (55-57). receptor
untuk produk akhir glikasi lanjut protein dinyatakan
di HUVEC sel (58, 59), yang melibatkan disekresikan S100A4
sebagai algojo parakrin baru RLN2 tindakan dalam tiroid
karsinoma angiogenesis. Sebagai kesimpulan, kami mengidentifikasi
S100A4 sebagai target molekul baru
untuk RLN2-RXFP1 sinyal pada karsinoma tiroid manusia
sel. S100A4 dimediasi motilitas-enhancing
efek relaxin dan dipromosikan angiogenesis pada karsinoma tiroid
tumor xenograft. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk
memperjelas peran bentuk monomer dan dimer dari
S100A4 dan efek yang mungkin dari kompartementalisasi seluler
dari S100A4 pada tiroid fungsi sel karsinoma.
D. DAFTAR PUSTAKA