Disagregasi dan Invasi Karsinoma Ovarium Spheroids

Asites
Abstrak
Background: Asitesberatseringberkembangdalamstadiumlanjutkankerovarium,yang
terdiridariselseltumorsajadanselseltumoragregat,atauspheroids.Spheroidstelahumum
digunakansebagaimodeltumoruntukmempelajarikhasiatobat(drugefficacy),dantelah
menunjukkan resistensi terhadap beberapa kemoterapi dan radiasi. Namun, sedikit yang
mengetahuimengenaikemampuanmelekatatauinvasifdarispheroids.danapakahkomponen
selulartertentudariasitesdapatberkontribusiuntukpenyebarankankerovarium.Disini,kami
mengujikemampuaninvasifspheroidsasitesdaritujuhpasienkarsinomaovariumdansatu
pasienprimaryperitonealcarcinoma(PPC).
Methods: Spheroidsasitesdiisolasidaripasien,dimurnikan,dananalisisimunohistokimia
yangdilakukanolehahlipatologiuntukmenegakkandiagnosa.Uji invitro yangdirancang
untukmengukurdisagregasispheroidpadaberbagaimatriksekstraselulardanpenyebarandan
invasi menuju sel human mesothelial cell monolayers yang normal. Proliferasii sel dan
viabilitas/kelangsunganhidupditentukanpadasetiapujidansignifikasistatistikdilakukan
olehstudent'sttest
Results:Spheroidsdarikeseluruhansampelasitespasiendisagreagasipadakomponenmatrix
ekstraseluler, dengan spheorids PPC yang mampu melakukan disagregasi lengkap pada
kolagentipeI.Selainitu,semuasampelspheroidasitesdisagregasipadahumanmesothelial
cellmonolayersyanghidup,biasanyatanpamenginvasimereka.Namun,spheroidasitesPPC
dansatusampelspheroidasites karsinomaovariumkadangkadangmembentuk foci yang
invasifdimesothelialcellmonolayers,sugestifdarifenotipyanglebihinvasif.
Conclusion:Kamimelakukanpercobaaninvitromenggunakanspheroidsasitesyangmeniru
penyebaran dari kanke ovarium in vivo. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa studi
sistematis daripada selular konten asites diperlukan untuk memahami biologi karsinoma
povarium.

LatarBelakang
Kankerovariumadalahkankeryangpalingmematikandaripadasistemreproduksi
wanita. disamping dekade penelitian, tingkat kelangsungan hidup jangka panjang
untukpenyakitinitidakbaik/buruk.denganhanyak25%daripasienyangterdiagnosa
kankerovariumdenganstadiumIIIatauIVyangbertahanhiduplebihdarilimatahun.
Biasanya,75%daripasientelahmemasukistadiumlanjutpadasaatdiagnosisawal,
halinidikarenakantidakadanyagejaladankurangnyametodeyangdapatdiandalkan
untukmendeteksipenyakitinipadastadiumawal(1).
Kankerovariummenyebarketikaselseltumorlepasdaripermukaanovariummenuju
ronggaperitoneal.Seltumordapatmensekresikanfaktorpermeabilitasvaskulardan
blokdrainaselimfatik,menyebabkanakumulasidaripadacairanasites(25).seltumor
ovariumterkelupas kedalamasitesdandapatmenggunakancairansebagaisarana
untuk benih pada rongga peritoneum, melekat ke sel mesotelial yang menyusun
peritoneumdanorganorgannya.Setelahmelekat,seltumorkemudianmenginvasi,
membentuk/membangun tumor di lokasi sekunder tanpa perlu melalui pembuluh
darah.Didalamasites,selkarsinoma ovariumyangtidakmelekat kemesotelium
dapatberaggregasi,membentukspheroids.
Disampingasitesyangspontanpadapasienkankerovarium,spheroiddapatdibuat
secara in vitrodariberbagaijenisselyangberbedauntukdigunakansebagaimodel
tumortigadimensi.Penelitiantelahmenunjukkanbahwaspheroidcenderunguntuk
resistenterhadapbeberapakemoterapidanradiasiterapi.Namun,beberapapenelitian
telah mengkarakteristikkan kemampuan melekat dan invasif daripada spheroids,
khususnyapadakankerovarium,menyebabkankontribusiterhadappenyebaranyang
tidakdiketahui.Disampingperanyangbelumdiketahui,adapenelitianpadaselyang
diisolasidarikarsinomaovarium.Namun,penelitiansebelumnyadenganseltumor
yangdiinjeksikanpadamodelmurinetelahmenunjukkanseltumorasceticyangdapat
menembuspermukaanperitoneal(1417).Padamanusia,belumditentukanapakah
sel mengambang bebas di asites dapat distimulasi menjadi invasif, atau hanya
beberapayangberpotensialmenjadimetastatik.
Karenasifatmultiseluleragregat,tidaklayakuntukmenggunakanteknikujistandar
untuk menghitung jumlah sel spheroid yang menyebar dan menginvasi. Karena
spheroidasitespadapasienterdapatberbagaiukuran,prelabelingspheroidbaiksecara
flouresenatauradioaktiftidakdapatmembedakanantaraspheroidyangsangatbesar
dengan beberapa spheroid yang lebih kecil, karena keduanya dapat menghasilkan
hasilyangsamanamuntidakmemberikaninfomasimengenaijumlahspheroidyang
adaatau informasimengenai morfologiseperti perubahandaripada ukuran.Untuk
alasan ini, kami telah membuat uji spheroid yang mana penghitungan spheroid

dilakukansecaramanualdansecaradigitalpadasaatplatingdandilakukanlagisetiap
titik waktu berikutnya, untuk menghitung jumlah pasti dari adhesi, migrasi, dan
invasi.Ujibaruinimemungkinkangenerasidaridataspheroidkuanitatif,dancukup
fleksibeluntukdimodifikasiuntuklebihdekatmenirulingunganperitoneal.
Cairan asites karsinoma ovarium diketahu mengandung campuran kompleks dari
faktorsekresiyangdapatmempengaruhilingkunganselulardariseltumordansel
mesotelial daripada peritoneum. Molekul matrix ekstraselular yang disekresikan,
sitokin, protease, kemokin, protease, faktor permeabilitas vascular, dan asam
lisofosfatidisemuaterdeteksidicairaasites,dansebagianbesardarimolekulinitelah
menunjukkanuntukmeningkatkanpertumbuhandariseltumor(1821).Mengingat
penyebaranyangunikdarikarsinomaovarium,pemahamanperandaricontentselular
asites yang relative, keterbatasan pengetahuan mengenai biologi spheroid,
pemahamanlebihsecarakomprehensifmengenaimekanismepenyebarankarsinoma
ovariumadalahkrusial.
Padapenelitiansebelumnya,kamimendemonstrasikanspheroidyangdiisolasidari
asitespadapasienkarsinomaovariumataudibuatdariNIH:OVCAR5humanovarian
carcinomacelllinedapatmelekatkekomponenECMdanmonolayerselmesotelial
langsung(22,23).KamijugamenunjukkanbahwaNIH:OVCAR5spheroidmampu
untukdisgregasisecaralengkappadakolagentipeI,dandapatmenginvasimonolayer
sel mesotelial secara langsung melalui interaksi 1 integrin dan produksi dari
protease, menghasilkan invasi foci 200fold lebih besar dari ukuran awal dalam
seminggu(24).Padapenelitianini,kamiterusmemantaukemampuandarispheroid
yang berkontribusi dalam penyebaran karsinoma ovarium dengan pemeriksaan
penyebaraandaninvasidarisampelspheroidasitespasieninvitro.

Metode
Materials
Kolage tipe IV dari tikus Engelbreh HolmSwarm (EHS) dibeli dari Trevigen
(Gaithersburg, MD). Kolagen tipe I dari plasenta manusia dibeli dari Southern
Biotech(Birmingham,AL).LaminintikusEHSdibelidariInvitrogen(Carlsbad,CA).
Humanplasmafibronectin,dimurnikansepertiyangdijelaskan,disediakanolehDr.
JamesMcCarthy,UniversityofMinnesota(25). Humanumbilicalcordhyaluronan
dibelidariSigmaChemicalCo.(St.Louis,MO). Bovineserumalbumin dibelidari
PierceBiotechnology(Rockford,IL).
Antibodi

Monoklnonal antibody CD 15 (mAb) MMA, CA125 mAb OV185:1, dan

CD45mAbLCAdibelidariVentanaMedicalSystems(Tucson,AZ).B72.3
mAb dibeli dari Signet Laboratories, Inc. (Dedham, MA). Polyclonal

antibodies against CEA and a mAb against Ber EP4 dibeli dari
DakoCytomation (Carpinteria, CA). Polyclonal antibody against calretinin
dibelidariZymedLaboratories(SouthSanFrancisco,CA).
KulturSel

HumanperitonealmesothelialcelllineLP9dibelidariCoriellCellRepository
(Camden,NJ),dandijagadenganrasio1:1padamediaM199danMCDB110,
disupplementasidengan15% fetalbovineserum (FBS),2mM glutamine,5
ng/ml EGF, 0.4 g/ml hydrocortisone, and50 U/ml penicillin/streptomycin.
Selsel dikultur dengan tempat/botol kultur jaringan dengan 5% CO2
kelembabandandiincubatorpadasuhu37C.
PemurnihanSelKarsinomaOvariumprimer

Sampelcairanasitesdiambildari7pasienyangterdiagnosakarsinomaovarium
stadium III atau IV, dan satu pasien dengan karsinoma peritoneum primer
(PPC) yang diambil melalui fasilitas dari University of Minnesota Cancer
CenterTissueProcurementdenganizinUniversityofMinnesotaInstitutional
ReviewBoard. Semuapasienadalahpasienbarubarusajaterdiagnosa, dan
belumditerapidengankemoterapiyangdisesuaikanpadasampel,sebagaimana
ditentukan oleh rekam medik. Sel tumor asites dan spheroid dikumpulan
dengansentrifugasi100gselama10menit.Eritrositlisisdenganmelarutkan
selseldalamlisisbuffer(10nMpotassiumbicarbonate,155mMammonium
chloride,0.1mMEDTA,pH7.4)selama5menit.Sisaseldikumpulkandengan
sentrifugasi100gselama10menit,kemudiandilapisiatasFicollPaquePlus
(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden) dandisentrifugasilagipada400g
selama15menit.Seltumordihilangkan/dihapuspadabagianatasdarilapisan
FicolldandicucidiRPMImedia1640.Aliquotspadaseltumor(1107sell/
ml)weresuspendedin10%DMSOand90%FBS,dadisimpandalamnitrogen
cair.Jumlahsampelpasienyangdigunakandalampenelitianinisesuaidengaan
jumahpasienpadapublikasikamisebelumnya(23).
Imunohistokimia

VerifikasiImunohistokimiadilakukanpadasemuasampelasitesyangditerima.
Immunohistochemical verification was performed on all ascites samples
received.Briefly,paraffinblocksweremadefromthrombinclotsofovarian
carcinoma patient ascites cells following purification. Thrombin clots were
preparedbyadding23loftheascitescellpelletto100lofhumanplasma
and50lthrombin(SigmaChemicalCo).Thethrombinclotswerefixedwith
10% formal dehyde in PBS, and were paraffinembedded by the Fairview
UniversityMedicalCenterPathologyLaboratory.45micronsectionswere
stained with a panel of antibod ies against ovarian carcinoma (CA125),
epithelialcells(BerEp4,CD15,B72.3,CEA),mesothelialcells(calretinin),

andinflammatorycells(CD45)onanautomatedimmunostainer(Benchmark,
VentanaMedicalSystems).Apathologistevaluatedeachsampleandverified
thepresenceof90%tumorcellsinallcases.
IsolasidariSpheroid

Untukmemisahkanspheroiddariseltumorkankerovarium, aliquot darisel

tumorasitesInordertoseparatethespheroidsfromthesingleovariancancer
tumor cells, an aliquot of ascites tumor cells dicairkan dan dibilas dengan
media,kemudiandifiltrasimelaluia22Mcellstrainercapdipasangditbung
5ml(Becton Dickinson,FranklinLakes,NJ.)Spheroiddipertahankandalam
filter yang dibilas lembut ke dalam tabung koleksi, disentrifugasi, dan di
resuspensi di media RPMI untuk konsentrasi yang diinginkan. Kami
mendefinisikanspheroidsebagaiselaggregasiberdiametersekitar30100M.
Biasanya,tidakmungkinuntukmemvisualisasisatuseldariberikutnyadalam
aggregasi ini, dan ketika dipotong, mereka padat diseluruhnya (no hollow
centers).Sementarajumlahpastidariselspheroidbervariasi,merekaberkisar
antara1020selhinggalebihdariseratusseldalamkomposisi.
UjiSpheroidDisaggregasi

96 piring/plate dilapisi semalam pada suhu 37C degan 5 g/ ml laminin,

fibronektin,kolagentipeI,kolagentipeIV,hyaluronan,danBSAdalamPBS.
Sumur/tempatitukembudiandiblokselama1jamdengan2mg/mlBSAdalam
PBS dan dibilas dua kali dengan PBS. Konsentrasi 5 10 spheroid
ditambahkan pada setiap sumur/tempat yang dilapisi. Dari penelitian
sebelumnya, kami menentukan bahwa 1 jam merupakan waktu yang sesuai
untukspheroiduntukmemulaimelekatpadamatriksECM(23,34).Demikian,
kamimenetapkant=0sebagai1jamdariawalplating/penempatan,jadiketika
piring/tempat tidak diganggu, spheroid tidak bergerak dari lokasi pada saat
awalplating/penempatan.Spheroidsecaradigitaldifotopadat=0,diinkubasi
padasuhu37Cselama24jam,dankemudiandifotokembali.Untukmelacak
masingmasingspheroiddariwaktukewaktu,petasumur/tempatdiciptakan
pada t = 0. Refrensi peta dan waktu sebelum titik foto memperbolehkan
masingmasingspheroiduntukdilacakselamapengujiantersebut.Pikseldari
area/lokasidarispheroidpadatitikwaktubersamaanditentukanmenggunakan
Adobe Photoshop. Lokasi/area keseluruhan dari spheroid disaggregasi
ditambahlokasi/areapadaselyangtersebardisekitaryangpalingmungkin
berasaldarisphrenoiddisaggregasi.Spheroiddisaggregasiditentukansebagai
perubahanfolddiareapikseldaripadaspheroiddari024jam.Ujiiniterbatas
pada24jam,spheroidtidakakanberkembangjikamelewati24jamtanpasera.
Nilai menunjukkan pengingkatan persen rerata pada area spheroid dari tiga
percobaanyangberbeda.
PengujianPenyebarandanInvasiSpheroid

untuk menilai invasi, sel mesotelial manusia LP9 pada 35,000

sel/sumur(tempat)ditambahkanke96piring/plateanddibiarkantumbuhuntuk
konfluens selama 96 jam, lalusecara halus dibilas denganRPMI. Spheroid
asites disuspensi di media yang lengkap untuk mendapatkan 5 10
spheroid/ml,dan1mldaripadasuspenseditambahkankesetiapmonlayersel
mesotelial. Spheroid secara digital difoto 1 jamsetelah plating/penempatan,
danlaludiinkubasipadasuhu37C.spheroiddifotokembalipadatitikwaktu,
1, 4, dan 7 hari. Media yang terpakai digantikan setiap tiga hari untuk
mencegah sumur/tempat menjadi terlalu asam. Dua per tigadari media
dikeluarkandariatasdaripadasumurtanpaagitasi(agitating)monolayersel
mesotelialdandigantikandenganmediayangbaru.Perawatandilakukanuntuk
menghindarigangguandarisumur/tempat,danmerekadiinspeksisecarahati
hatisebelumdansetelahpergantianmediauntukmemastikanspheroidtidaklah
hilang. Untuk mencari maingmasing spheroid setiap waktu, peta dari
sumur/tempatdibuatpadat=0.Refrensipetadanwaktusebelumtitikfoto
memperbolehkan masingmasing spheroid untuk dilacak selama pengujian
tersebut.Penyebaranspheroiddidefinisikansebagaidisaggregasispheroiddan
menyebar di atas monolayer sel mesotelial tanpa membentuk invasif foci.
Invasispheroiddidefinisikansebagaipembentukandariprolifersifocidaripada
sel kanker ovarium dalam bidang yang sama sebagai monolayer sel
mesotelial, ,daripada itu monolayer sel mesotelial di dorong kesamping (ke
luar)sementaraspheroiddisaggregasiberproliferasidantumbuhscaralateral.
Visualisasidariinvasididapatkandenganmikroskopcahayatanpabutuhdari
pemisahan label pada sel, sebagai invasi dari sel sel kanker ovarium yang
beradadalamtempatyangsamadarifokus,astheinvadingovariancancer
cellswerewithinthesameplaneoffocsebagailapisantunggalselmesotelial,
sedangkan sel yang melapisi tapi tidak menginvasi lapisan tunggal muncul
sebagai sel padat yang sedikit keluar dari focus. Penyebaran dan invasi
spheroid, keduanya dihitung dengan perubahan fold di tempat/area, Both
spheroiddisseminationandinvasionwerequantifiedbycalculatingthefold
changeinarea,ditentukandenganpembagianpikseltempat/areadarispheroid
setiap titik waktu dengan area/tempat piksel spheroid pada t = 0. Data
mewakilkanratarataperubahanfolddiarea/tempatdari50100spheroid
standar error, dari totalempatpenelitian yang berbeda pada masingmasing
sampelpasien.
Cell proliferation and viability

Ascites spheroid and mesothelial cell monolayer viability and proliferation

weredeterminedusingaWST1assay(RocheAppliedScience,Indianapolis,
IN.)WST1isatetrazoliumsaltcleavedtoformaformazandyebymito
chondrial dehydrogenase activity. Approximately 2050 Detection Kit
(BioVision,MountainView,CA.)Followingmanufacturer'sinstructions,cells
werelabeledwithAnnexinVFITCandpropidiumiodide,andwereobserved
onaNikonEclipseE200microscopeusingFITCandrhodaminefilters(Nikon,

Kanagawa, Japan.) Apop tosis appeared as a halo of green at the plasma

membrane,witharedstainthroughoutthenucleus.Cellsundergoing apoptosis
stainedgreenintheplasmamembranebutshowednopropidiumiodidestaining.
Statistical analysis

Thestudent'sttestwasperformedasatestofsignificancewiththeuseof
MicrosoftExcel2002(MicrosoftCo.,Redmond,WA).Pvaluesof<0.05
wereconsideredtoindicatestatisticallysignificantdifferences.

Results
Ascites spheroids disaggregate on ECM components

SpheroidswereisolatedfromtheascitesofsevenpatientswithstageIIIandIV
ovarian carcinoma and one patient with primary peritoneal carcinoma. A
pathologistevaluatedthesamplesbyimmunohistochemistrypriortousein
assays to verify that each sample matched its diagnosis. Diagnosis, initial
CA125levels,treatment,familycancerhistoryandsurvivaldatafortheeight
patients are included in Table 1. In a previous study from our lab, the
adhesivityofthesesameeightpatientascitessampleswastestedonvarious
ECMcomponentsandlivehumanmesothelialcellmonolayers[23].Here,
theseascitesspheroidsamplesweretestedfortheirabilitytodisaggregateon
ECMcomponents.Indisaggregation,thespheroidstransformfromathree
dimensionalcellclustertoaflatplaque,asthecellsmigrateoutofthespheroid
anddismantletheircellcellcontactstoadheretoandspreadontheECM.510
ascitesspheroidsweresuspendedinRPMIandaddedtoeachwellofa96well
plate(Fig.1)coatedwith5g/mloflaminin(blackbars),fibronectin(striped
bars), type I collagen (white bars), type IV collagen (light gray bars),
hyaluronan(stippledbars),orBSA(darkgraybars)for24hours.Thespheroids
werephotographedatthetimeofplating(t=0)andagainat24hours.Thefold
changeinareawascalculatedbydividingthepixelareaofthespheroidat24
hours by the pixel area at t = 0. Any fold change in area beyond 1 was
considered to be significant. In general, ascites spheroids tendedto slightly
disaggregateonallECMcomponents,formingalooserspheroidwhosecells
didnotusuallyflattenorspreadtoformamonolayer(Fig.2,toppanel).The
resultingspheroidsurfaceareaafter24hourstypicallyincreased3050%,
withdisaggregationpreferentiallyoccurringontypeIVcollagenandtypeI
collagen. However, individual ascites sphe roid samples sometimes
demonstratedagreaterabilitytospreadoverall,orspreadeffectivelyonlyon
specificECMcomponents.Forexample,whilespheroidsfrompatients3and8
increasedinsurfacearea60%after24hoursonallECMcomponentstested,
sample3preferredtypeIVcollagenandhyaluronan,nearlydoublinginsize
(Fig.1).TypeIVcollagenalsoelicitedaneardoublinginsizefromsample8,
asdidfibronectinandtypeIcollagen.Samples6and9bothshowedabouta

40%increaseinsize,withsample6spreadingbestonlaminin,whilesample9
spreadsimilarlyontypeIcollagen,typeIVcollagen,andfibronectin(Fig.1).
Sample 4, the primary peritoneal car cinoma, exhibited the most dramatic
increaseinspreading,asitdisaggregatedextensivelyontypeIcollagenmore
thananyotherascitesspheroidsamplestested(Fig.1).Samples2,5,and10
showedanaverageoflessthan30%spreadingonallECMcomponents,with
fewexceptions(Fig.1).
Insomecases,individualspheroidsexhibiteddisaggregationpropertiesthat
differedfromthemajorityofspheroidsinapatient'ssample.Thus,evenwhen
amajorityofapatient'sspheroidsdisaggregatedonmostECMmolecules,
some of the patient's spheroids would not disaggre gate or spread. For
instance, most of the spheroids from patient 4 demonstrated extensive
disaggregation on type I collagen (Fig. 2, middle panel), however some
spheroidsfromthispatientdidnotdisaggregateontypeIcollagenatall.Even
withinthesamewell,individualspheroidsfromthesamepatientbehavedquite
differentlyinresponsetoECMcomponents.Asanexample,Figure2(bottom
panel) shows two spheroids from patient 3 plated on type I collagen. The
spheroidontheleftcompletelydisaggregated,whilethespheroidontheright
inthesamewelldidnotdisaggregateatall.Samplesthatspread2foldormore
on any ECM component constituted less than 10% of the total number of
spheroidstestedforeachpatientsample.
SpheroidproliferationonECMcomponentswastestedbythecellproliferation
agentWST1(Fig.3.)WST1readingsofascitessampleswerecomparedat0
and24hours,andalsotocontrolwellswithnospheroidsadded.Mostsphe
roidsdidnotappreciablyproliferateover24hours.However,theamountof
significantproliferation(pvalues<0.05)seenforindividualpatientsamples
sometimescorrelatedtotheECMcomponentsuponwhichtheyspreadthe
most.Forexample,patientsamples2,6,8,and10showedsomeproliferation
ontheECMcomponentsonwhichtheymosteffectivelydisaggregated.Sample
3showeda correlationonlyonhyaluronan, andsample 9onlyontype IV
collagen and BSA. In contrast, sample 4 proliferated on fibronectin and
hyaluronaneventhoughspheroidsfromthispatientspreadextensivelyontype
Icollagen.Sample5showednoproliferationonanyECMcomponenttested.
Takingintoaccountthelowlevelsorlackofproliferationobserved,thesedata
suggestthatthemajorityofcellscomprisingpatientascitesspheroidstendto
disaggregateandspreadratherthanproliferateonmostECMcomponentsina
periodoftimelimitedto24hours.
Penyebaran spheroid asites pada monolayer sel mesotelial

Sebagianbesartempatterserigdarimetastasisdikarsinomaovariumadalah
peritoneum,yangdilapisiolehmonolayerselmesotelial.Untukmenyelidiki
kemampuandarispheroidkarsinomaovariumuntukmenginvasiselmesotelial,
uji/pemeriksaaninvasidilakukandengansToinvestigatetheabilityofovarian

carci noma spheroids to invade mesothelial cells, invasion assays were

performedwithascitesspheroidsfromeightpatients.510ascitesspheroids
wereaddedtoeachwellofa96wellplatecontaininglive,confluenthuman
mes othelial cell monolayers, and were incubated for 7 days. The ascites
spheroidswerephotographedatthetimeofplating(t=0)andagainatdays1,
4,and7(Figs.4and5).Disaggregationandinvasionwasmeasuredasthefold
changeinpixelareaateachtimepointrelativetothepixelareaatt=0.
Frequently,theareaofdisseminationwasvisibleasadarkdiscolorationacross
the top of the monolayer. Upon inspection at a higher magnification, this
discolorationwasdeterminedtobethedisseminationofindividualtumorcells
fromthedisaggregatedspheroid.Inmostcases,theareasofdisseminationdid
notsignificantlyincreasewhenassayswereextendedto10days.
In general, the ascites spheroids initially increased in size, and then
disaggregatedonthemesothelialcellmonolayersoveraperiodofsevendays.
Typically, the spheroids did not fully disaggregate in the first 24 hours,
althoughtheirsizeincreased,suggestingeitherproliferationorlooseningof
intercellular contacts. WST1 assays of ascites spheroid proliferation on
mesothelialmonolayers,however,wereunabletoconclusivelydemonstrate
spheroidproliferation(datanotshown),suggestingthattheenlargedspheroid
areas were due to partial disaggrega tion. By day 4 nearly 50% of the
spheroidsdisaggregatedandspreadtooccupyasurfaceareathatwasdouble
theirinitialsize,andhadmorethantripledinsizebyday7(Figs.4and5).
About50%ofthespheroidstestedoverthecourseoftheassaysimplyenlarged
withoutdisaggregating,demonstratingtypicallya2foldchangeinsizeat
most.Themajorityofdisseminatedspheroidsspreadbetween2foldand4.9
fold by day 7 (Fig. 6.) In general, only 515% of the spheroids displayed
disseminatedareasgreaterthan5fold.Patientsample4showedthegreatest
amountofdisseminationontopofthemesothelialcellmonolayers,withmore
than30%ofthespheroidsshowingachangegreaterthan5fold,and5%ofthe
spheroidsexhibitingchangesgreaterthan11fold(Fig.6).Incontrast,the
majorityofascitesspheroidsfrompatients8and9disaggregatedandspread
lessthan5fold,withonly25%ofspheroidsspreadingmorethan5fold(Fig.
6).Datawasstatisticallysignificant(pvalue<0.05)forallpatientsamplesat
alltimepoints,withtheexceptionsofpatientsamples8and10atday1.
Previousstudieshavesuggestedthattheconditionofthemesotheliummay
affecttumorcellinvasion[26].Itwasoftennotedduringourassaysthatthe
morphologyofthemesothelialcellmonolayersurroundingtheareaofascites
spheroidattachmentaltered,growinglessconfluentandrevealingbarepatches
oftissuecultureplastic(Fig.7).Thisoccurredforabout25%ofthespheroids
trackedinourassays.However,thesesparseareastypicallyfilledinagainby
day7,suggestiveofmesothelialcellproliferation.Proliferationassayswith
WST1 showed that the mesothelial cells, when cultured alone, indeed

proliferateupto7days,implyingthattheymaybeabletorepopulatesparse
areasduringthecourseoftheassay.
To test their viability, ascites spheroids and mesothelial monolayers were
stained with an Annexin VFITC kit (Fig. 8.) Cells undergoing apoptosis
stainedgreenwithAnnexinVFITC,whilecellsthathadalreadyapoptosed
stainedredwithpropidiumiodide,andsometimesshowedafaintgreenhaloof
AnnexinVFITC.Ingeneral,thepatientascitesspheroidsremainedalivefor
thedurationoftheassaysasevidencedbylackofAnnexinVandpropidium
iodide staining, although occasional apopto sis was observed for some
individual cells comprising the spheroids. Representative examples from
patientsample3demonstratetheapoptosisseeninsomeindividualcellsofthe
ascitesspheroidsandsingletumorcells(Fig.8,middlecolumn)butoverall
thespheroidsremainedalivethroughouttheassay(Fig8,rightcolumn.)Little
apoptosisoccurredinmesothelialcellmonolayersover7days(Fig8,left
column.)
Despite their ability to attach and spread across the mes othelial cell
monolayers,itwasraretoseefociofinvasionformorextensiveproliferation
of the ascites spheroid cells. However, we did note ascites spheroids that
deviatedinbehavior.Specifically,about15%oftheascitesspheroidsfrom
samples4and5disaggregated,invaded,andappearedtohaveproliferatedin
themesothelialcellmonolayers(patientsample5showninFig.9).Invasive
ascitesspheroidsconstitutedabout5%ofthetotalnumberofspheroidstested
inpatientsamples,butnevertheless,thesedatasuggesttheascitesmaycontain
subclonesofspheroidswithaninvasivepotential.

Diskusi
Penyebaran karsinoma ovarium terjadi melalui pelepasan sel tumor primer
dengan persebaran berikutnya di cavum peritoneal, diikuti invasi dan
proliferasiditempatsekunder.Karenaimplantasiperitonealyangtersebardan
penyakit yang berkembang dapat terjadi tanpa penyebaran hematogen,
sehinggamenentukanpotensiinvasifdarikontenselularasistesmerupakanhal
yangkrusial.Padapenelitiansebelumnyadilabkami,kamimendemonstrasi
bahwa spheroid terbentuk dari NIH:OVCAR5 salah satu macam dari sel
karsinomaovariumdapatmelekatdanmendisagregasikankomponenmatriks
ekstraselular, melekat pada sel mesotalial yang sehat, dan secara ekstensif
menginvasi masuk ke sel mesotalial monolayer tersebut. Pada eksperimen
berikutnya,denganmenggunakanasitesspheroiddaripasienyangmengidap
kankerovariummenghasilkanhasilyangsamadenganhasilpadapenelitianlab
kamisebelumnya.
Dalampenelitianini,kamimenemukankemampuandari8sampelspheroid
asites pasien untuk mendisagregasikan komponen matriks ekstraselular dan

menyerang monolayer sel mesothelial. Spheroids asites pasien biasanya

menunjukkanbeberapadisagregasi,denganselselyangbermigrasikeluardari
spheroid ketika ditempatkan pada berbagai komponen komponen ECM.
Sebagianbesarspheroidsasitesmeningkatdidaerahpermukaanpadasemua
komponenECMyangdiuji.Dalampenelitiankamisebelumnya,NIH:roids
OVCAR5spheroidsepenuhnyateragregasipadakolagentipeI,menunjukkan
peningkatan6kalilipatluaspermukaanlebihdari24jam.Disini,tidakada
satupundarilimakomponenECMdiujidiinduksidisagregasiyangluas(yaitu
perubahanlebihdari2kalilipatpadaukuran).Selainitu,diagregasiterlihat
pada komponen ECM biasanya tidak disertai dengan proliferasi berlimpah,
meskipunproliferasisampelpasientertentukadangkadangtampakberkorelasi
dengankomponenECMyangmenyebarpalingefektif.
Sedangkantingkatdisagregasipadaasitesspheroidpasienyangditampilkandi
sini adalah tidak seekstensif NIH: spheroids OVCAR5, ada beberapa
kemungkinan yang ada untuk menjelaskan perbedaan ini. Pertama, NIH:
OVCAR5 spheroids terbentuk secara in vitro selama 48 jam, sementara
spheroids asites mungkin telah terbentuk untuk jangka waktu yang panjang
secara in vivo. Dengan demikian, spheroids pasien dapat mengembangkan
koneksiselselsecaraekstensifyangmenghambatkemampuanmerekauntuk
mendisagregasi. Karena proses isolasi spheroid asites dan tes berikutnya
memerlukan pipetting yang sering, penyaringan, dan sentrifugasi, setiap
spheroids yang akan mendisagregasi terhadap stimulasi mekanik akan
dihilangkan dari kelompok sampel kami, hanya menyisakan spheroids yang
tahanterhadapgangguanmekanisdanyangteragregasikuat.Adakemungkinan
bahwakontakkontakmemfasilitasikohesiagregatyangkuatdapatdiartikan
bahwa hal tersebut adalah suatu penurunan kemampuan untuk
mendisagregasikan pada permukaan ECM. Penelitian ini telah
mengidentifikasi cadherin, desmosom, tight junction, gap junction, dan
berbagai komponen ECM termasuk laminin, fibronektin, kolagen, dan
glycosaminoglyterkumpuldalamkontakselselspheroids,apapunyangdapat
menghalangi kemampuan mereka untuk mendisagregasi pada permukaan
ekstraseluler.PenelitiansebelumnyatelahmenunjukkanbahwaNIH:OVCAR5
spheroidsyangdilakukanbersamaolehfibronektinberinteraksidengan 5 1
integrin. Selain itu, spheroids pasien dapat menggabungkan molekul seperti
protein ECM dari cairan asites yang memungkinkan mereka untuk melekat
bersamasamalebiheratataumembentukmatriksyangmenghalangireseptor
yangdiperlukanuntukmemediasimigrasi.
Menariknya,beberapaspheroidsterdapatdalamsampelpasiendidisagregasi
cukupdrastis pada komponen ECM tertentu. Spheroids asites dari pasien 4
seringmenunjukkandisagregasilengkapkolagentipeI.Namun,tidaksetiap
spheroid dari pasien ini terdisagregasi. Bahkan, spheroids berlapis
menunjukkankemampuandisagregasiyangberbeda.Responvariabelterhadap

komponen ECM ini menunjukkan bahwa beberapa spheroids dalam ascites

dapat mengembangkan fenotipe metastasis yang melemahkan kemampuan
merekauntukmeresponmolekuldalamlingkunganmereka.Hasilinimungkin
mencerminkanheterogenitasseringterlihatpadatumorpadat,dimanahanya
beberapasubclonesseltumormampubermetastasis.
Penelitian sebelumnya dari laboratorium kami menunjukkan bahwa NIH:
OVCAR5 spheroids bisa menyerang sel hidup mesothelial monolayer,
membangunfokusinvasiyangmeningkatdalamukuranhingga200kalilipat
dalamseminggu.Disini,spheroidsascitesdaridelapansampelpasienyang
diuji mampu mendisagregasi sel hidup mesothelial monolayer atau ECM
merekayangterpapar,biasanyatanpaaktifmenyerang.Halinimiripdengan
situasi di vivo, di mana selsel tumor secara luas menyebar ke seluruh
peritoneum tanpa bukti menyerang pada saat operasi pertama. Hal ini
menunjukkanbahwasecara invitro modelkita secaraakuratmenirudalam
kondisi vivo. Namun, beberapa spheroids asites mampu menyerang dan
berproliferasi dalam dalam monolayer sel mesothelial, juga menunjukkan
bahwasebagiandarispheroidsdiasitesmungkinmerupakanancamaninvasif.
Pada sampel pasien yang menunjukkan fenotipe yang lebih invasif dalam
penelitiankami,tidaksetiapspheroidmampudisaggregatingdanmenyerang.
Spheroids asites berlapis dalam sumuran/tempat(well) yang sama tidak
menunjukkan sifat invasif sama meskipun berbagi lingkungan yang sama.
Bahkan, hanya beberapa spheroids didirikan fokus invasi. Data ini
menunjukkan bahwa perilaku invasif dari spheroids ascites tidak hanya
diinduksiolehspheroidslingkunganmikro,tapikemungkinanmengandalkan
perbedaan fisiologis di spheroids karakteristik invasif. Hal ini secara luas
diketahuibahwatumoryangheterogen,danselseltumordapatsangatberbeda
dalampotensimetastatikmereka,sehinggahanyabeberapaseldalamtumor
primerakanbermetastasis.Daridatayangdisajikandisini,jelasbahwakondisi
yangsamamungkinberlakuuntukspheroidsdalamefusikarsinomaovarium.
Penelitianlebihlanjutdimanaselselkarsinomaovariuminvasifasitesdan
noninvasif yang terisolasi memungkinkan untuk penentuan karakteristik
khususdariselselmetastatik.
AplikasiWST1untukdiseminasidaninvasitestidakmemungkinkanuntuk
menerapkanpenentuanyangakandibuatberdasarkanspheroidproliferasipada
selmesothelial.Berdasarkandesainpenyebarandaninvasiuji,jumlahselsel
mesothelialyangterakumulasimelebihispheroidsdisetiapsumur.Ketikakami
menambahkanspheroidsdalamjumlahyangbanyakkemasingmasing(100
1000 spheroids dalam upaya untuk mengukur proliferasi spheroids, kami
mengamati dampak negatif pada kelangsungan hidup sel mesothelial. Ada
kemungkinanbahwahanyabeberapaspheroidspersampelmungkinsignifikan
proliferatif.Karenahanya5%daritotalspheroidsmampuinvasi,akansulit
untuk mendeteksi spheroid yang berproliferasi baik dalam WST1 assay.

Sementaraspheroidsmungkintidaksecarasubstansialberproliferasi,mereka
dapatterushidupselamatessepertiyangditunjukkanolehkurangnyaAnnexin
V dan perwarnaan propidium iodida. Beberapa sel individu dari spheroids
mengalami apoptosis, tetapi sebagian besar spheroids tetap hidup. Ketika
awalnyapulihdaripasien,beberapaselyangterdiridarispheroidssudahmati
untukalasanyangtidakdiketahui.Adakemungkinanbahwasalahsatuwaktu
pembekuandanprosespencairanmenyebabkankerusakanpadabeberapasel.
Namun, perwarnaan tripan biru spheroids selama kultur mengungkapkan
bahwa sebagian besar selsel spheroids masih hidup. Jadi, saat banyak
spheroids mungkin tidak berproliferasi secara aktif di monolayer sel
mesothelial, kelangsunganhidup mereka sendirimasih akanmemungkinkan
penyebaran dari mesothelium, yang pada akhirnya dapat mengakibatkan
pengembangansubkloneyanginvasif.
Menariknya, sampel spheroid asites yang ke4 dan ke5 menunjukkan
karakteristik yang paling invasif secara in vitro, berhubungan dengan
kelangsungan hidup pasien yang singkat yaitu 16 dan 17 bulan, masing
masing.Perludicatatbahwapasienke4,satusatunyasampeldaripasienyang
dikulturkan dengan kanker peritoneal primer (PPC), menunjukkan beberapa
karakteristik yang paling invasif dari setiap spheroids diuji. PPC diduga
memilikikesamaanbiologisepertikankerovarium,danpenyakityangsering
dianggapsama.Halinimenstimulasiuntukberspekulasidaribuktikamidalam
penelitian ini bahwa PPC asites spheroids mungkin lebih invasif daripada
spheroidskarsinomaovarium,meskipunpenelitianselanjutnyadengansampel
pasien tambahan akan diperlukan untuk mengidentifikasi perbedaan yang
signifikandalaminvasiduakankerini.
Dalam tes invasi kami, kadang tercatat bahwa pertemuan monolayer sel
mesothelialterganggu.Halinibiasanyaterjadidiareasekitarterdapatspheroid
yangmelekat,menjuruskanuntukberspekulasiapakahadafaktorfaktoryang
spheroidskeluarkanatauinduksi,sepertiprotease,yangmungkinmenyebabkan
terjadinyaefekini.Karenaefekiniseringmenghilangpadahariketujuh,ada
kemungkinanbahwaituadalahefeksementaraterhentiseiringpadahilangnya
selspheroid,yangmemungkinkanselselmesothelialberproliferasididaerah
yang rusak. Memang, kedua matriks metalloproteinase dan aktivator
plasminogen telah diidentifikasi pada kanker ovarium. Menariknya, mirip
denganpengamataninvitrokami,padabeberapapasienkarsinomaovarium,
peritoneal mesothelium berfungsi sebagai nonperekat, pelindung bisa
berubah, menyebabkan penebalan, vaskularisasi, edema, hiperplasia, dan
fibrosis.Sementarapenyebabnyamasihbelumbisaditentukan,mesothelium
dapatmeningkatkaninvasiselkarsinomaasitesovariumdenganmemaparkan
dasar matriks ke sel sel tumor dimana sel tersebut dapat melekat. Untuk
mendukunghalini,penelitiantelahmenunjukkanbahwaselseltumorovarium
sering melekat pada ruang antara selsel mesothelial dimana terdapat ECM

yang terpapar, kemudian mengarah ke pengelupasan sel mesothelial dan

pembentukanfociinvasif.Sementarasalahsatuketerbatasanpenelitiankami
adalah hal tersebut tidak menunjukkan apakah invasi karena mesothelial
kematianselataupengelupasan,pengamatankamidenganpewarnaanAnnexin
V menunjukkan bahwa selsel mesothelial bertahan hidup selama tes
dilakukan,bahkanketikamelakukankontakdenganselseltumor.

Kesimpulan
Perubahanyangterjadipadaseladalahhalyangesensialuntukperkembangan
karsinoma ovarium masih belum diketahui. Masih minim yang mengerti
mengenaiselasitestumordankarakteristikyangdiperlukanuntukmendorong
pertumbuhaninvasifmereka,bahkanselseliniseringdianggapsebagainon
metastatikagakmeresahkan.Kamimenunjukkanbahwasamplespheroidasites
yangtidakdikulturdari pasienkarsinomaovariumdankarsinomaperitoneal
primer dapat mendisagregasikan komponen ECM dan sel mesothelial
monolayerpadamanusia,dankadangkadangmampumenginvasi.Berdasarkan
data kami, konten biologi dari ascites selular harus diselidiki untuk
mengembangkan pemahaman yang lebih komprehensif tentang penyebaran
karsinomaovarium.