DIAGNOSIS PENYAKIT

VIRUS
BAHAN AJAR
MIKROBIOLOGI VETERINER
OLEH
G NGURAH K MAHARDIKA

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS UDAYANA
BUKIT JIMBARAN
2004

KENAPA PERLU DIAGNOSIS YANG BENAR DAN

TEPAT?

Penyakit eksotik
Penyakit zoonosis
Sertifikasi status bebas penyakit tertentu
Keperluan Inseminasi Buatan, Transfer
Embryo, transfusi darah
Program pengendalian test and slaughter
Investigasi Kesmavet
Managemen Klinik

DASAR-DASAR DIAGNOSIS
Klinis
Epidemiologi
Patologi Anatomi

DIAGNOSE SEMENTARA
Di Lapangan

pengambilan sampel

Di Laboratorium

ISOLASI DAN PROPAGASI

biakan sel
telur bertunas
hewan percobaan

Lesi Histopatologi

Deteksi Virus

Deteksi
Protein
Virus

POSTULAT
KOCH*

Deteksi genom Deteksi Antibodi

DIAGNOSE DIFINITIV

*Keraguan & Penyakit Baru

Epidemiologi
Epidemi=wabah
Ilmu tentang wabah
Geografi
Musim
Spesies
Umur
Kelamin
Morbitas, mortalitas, dan case fatality rate

Pengambilan Spesimen
Tepat Spesimen

sesuai gejala klinis

sesuai perubahan PA
sesuai pathogenesis penyakit yang diduga

Tepat Waktu

Pada fase akut

Tepat pengiriman

Dalam transport medium

Es/es kering
Tertutup rapat
Berlabel
Disertai data penyakit, diagnosis sementara
Ijin pengiriman (Luar Negeri)

Transport medium
Larutan fisiologis
PBS, NaCl 0,9%, Media Biakan Sel

Antibiotika (Penisilin dan

streptomisin)
Antijamur
+/- Gliserol (terutama untuk
transportasi jarak jauh tanpa kondisi
dingin)

MACAM SPESIMEN
Gejala

Spesimen

Pernafasan
Pencernaan
Kelamin
Mata
Kulit
Syaraf Pusat

Nekropsi/ Biopsi

Usapan Hidung, Kerongkongan, aspirasi naso-faring

Feses
Usapan kelamin
Usapan Konjungtiva
Kerokan Kulit, Epitil, Usapan kapas
Cairan serebrospinal, feses, usapan hidung (tergantung
penyakit)
Usapan hidung & feses (tergantung penyakit), darah
dalam antikoagulan
Potongan organ yang sesuai

Semua Penyakit

Darah tanpa antikoagulan ---- serum

Sistemik

BERBAGAI METODE DIAGNOSTIK VIRUS

METODE

isolasi virus

KEUNGGULAN

mikroskup elektron
Serologi (deteksi
Protein)
Pelacak DNA/RNA

Histopatologi

Deteksi Ab

KEJELEKAN

sensitif, bahan baku

kajian lebih lanjut

cepat, deteksi virus

yang sulit ditumbuhkan
cepat, peka, informasi
serotipe, KIT

cepat, peka, untuk

semua
virus

cepat, mudah, tersedia

berguna untuk wabah

lambat, sering sulit

mahal, tak tersedia

tidak untuk semua virus

sulit interpretasi
tak selalu tersedia
kontaminasi DNA tinggi
terbatas untuk virus
tertentu dg perubahan
khas
Lambat, sulit interpretasi

ISOLASI VIRUS
spesimen
Tujuan:
1. Memisahkan
suatu virus
dari agen
yang lain
2. Memperbany
ak virus
3. Identifikasi
awal

suspensi

Fisik-Kimiawi
-

Secara Aseptis

Penggerusan

Pencairan-pembekuan
berulang

Larutan isotonis
berpenyangga

Sentrifugasi Ultra
Sentrifugasi

Ultrafiltrasi

Penambahan Antibiotika
sprektrum luas

Biakan sel
Penambahan Agen Anti Jamur
dan anti mikoplasma
telur bertunas Pengamatan
Klinis,
hewan lab
Patologis,
Mikroskopis,

Panen dan Identifikasi

DETEKSI VIRION

Elektronmikroskup
Imunoelektronmikroskup

Gambar Elektron Mikroskopis berbagai virus

Gambar Elektron Mikroskopis berbagai virus

Panel Contoh
Imuno-Elektron
Mikroskopi
LD

Infeksi Virus Hepatitis C

pada biakan sel (Barba
dkk. 1997)
sel terinfeksi yang
direaksikan dengan
serum negatif (E) dan
serum positif VHC (F)

LD

Perhatikan N : inti sel, ER

retikulum endoplasmik, M
mitokondria; LD lipid droplet

DETEKSI PROTEIN VIRUS

ELISA
Enzim linked Immunosorbent assay
IMUNOFLUORESENS
Fluorescence Antibody Test (FAT)

WESTERN BLOT
Hambatan hemaglutinasi (HI)
Uji Fiksasi Komplemen
Uji Netralisasi
Agar Gel Precipitation Assay
Dll.

PENGUKURAN ANTIBODI
Serum tunggal
Penyakit baru
Penyakit endemik --- deteksi IgM

Sera sepasang
Serum fase akut dan fase kesembuhan (24 minggu)
Terjadi peningkatan antibodi yang
signifikan

DETEKSI DNA/RNA
PCR (polymerase chain
reaction)
Amplifikasi (perbanyakan) DNA
secara invitro (dlam tabung
reaksi)

RT - PCR (Reverse
Transcriptase PCR) untuk
virus RNA

Histopatologi (Lesi Patognomonik)

Contoh pada Rabies

INTERPRETASI
Kesesuaian Klinis, epidemiologi,
Patologi & Diagnosis lab
Sering keliru
banyak infeksi sub-klinis
Dalam hal ragu-ragu --- Postulat Koch
Agen dapat ditumbuhkan
Isolat dapat menimbulkan penyakit yang
sama pada infeksi percobaan
Agen dapat diisolasi kembali dari infeksi
percobaan

KEAMANAN LAB
Biosafety Level 1
Biosafety Level 2
Biosafety Level 3
Propagasi penyakit
zoonosis pada hewan
percobaan

Biosafety Level 4
Eksperimen infeksi
penyakit zoonosis yang
berbahaya

ELISA

ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Uji serologi dalam cairan dimana antigen
atau antibodi dilapiskan pada lubang
plastik (microplate), dan antigen atau
antibodi yang menempel dilacak dengan
antibodi lain yang berpenanda enzim
Kepekatan warna diukur dengan alat ELISA
READER

Skema Prosedur ELISA indirek untuk pemeriksaan

antibodi terhadap HIV

Baca (optical density)

Kromogen/substrat
Cuci
Anti Ig-Human dilabel
enzim
Cuci
Serum pasien
Cuci
Protein-protein virus
HIV dilapiskan pada
microplate polysterene

Contoh Microplate
ELISA

Western Blot
Deteksi antigen atau antibodi dimana
antigen dielektroforesis dalam media
poliakrilamid dan kemudian
dipindahkan ke permukaan membran
nitroselulosa, ikatan antigen-antibodi
dilacak dengan entibodi lain yang
berpenanda enzim

Contoh WB

Western Blot HIV

Lane 1, HIV+ serum (positive
control)
Lane 2, HIV- serum (negative
control)
Lane A, Patient A
Lane B, Patient B
Lane C, Patient C

FAT
Fluorescence Antibody Test
Uji serologi untuk deteksi antigen
atau antibodi dengan menggunakan
antibodi lain yang berpenanda FITC
(fluorescence Iso-Thio-Cyanate)
Signal dilihat dibawah mikroskup UV
Digunakan untuk deteksi rabies baku

FAT: Skema Mikroskup

Skema FAT

FAT direk

FAT indirek

Mikroskup fluoresens

Slides are read under a fluorescence

microscope in a dark room

 FAT direk dari

preparat sentuh
otak anjing
penderita rabies
Positif (atas)
dan negatif
(bawah).

FAT biakan sel terinfeksi Spuma Virus.

Perhatikan juga intensitas signal dan
bentukan sinsitia

Complement Fixation
Methodology

Ag mixed with test serum to be assayed for Ab

Standard amount of complement is added

Erythrocytes coated with Abs is added
Amount of erythrocyte lysis is determined

No Ag

Ag
Ag
Ag

Patients
serum

IMUNOHISTOKIMIA

Fiksasi jaringan pada glas obyek

Antigen un-masking
Ensimatis
Microwave
Autoklaf atau pressure cooker
Blocking
Penambahan antibodi terhadap Ag yang dicari
Berlabel enzim (direk)
Tak berlabel (indirek)
Penambahan antispesies Ab (indirek)
Substrat
Background staining
Pengamatan dengan mikroskup cahaya

Contoh Imunohistokimia
Badan Inklusi
pada
intrasitoplasmik
pada sel Syaraf
tertular Rabies
(Negri bodies).

Agar Gel Precipitation Test

(AGPT)

Agar Gel Immunodiffusion assay

Uji Hambatan Hemaglutinasi

(Hemaglutination inhibition/HI)
Aktif
Virus yang mempunyai
hemaglutinin
Influenza, Newcastle Disease/ND,
Parvovirus

Pasif
Didahului dengan uji HA
(hemaglutination assay)

Uji Hemaglutinasi (HA)

Uji Hemaglutinasi
(HA)

Virus yang
Mempunyai
hemaglutinin

Sel Darah Merah

Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI)

Antibodi
Virus yang
Mempunyai
hemaglutinin

Sel Darah Merah

Contoh Mikroplate uji HI dengan 4 Serum (S1 S4)

Virus 4 unit HA yang digunakan diperlihatkan dibagian b

Uji Netralisasi
Sel Sehat
Embryo
Sehat
Hewan Sehat
Biakan Sel
Telur Bertunas
Hewan Lab

Virus tidak
dapat
direisolasi
Sel Sakit/Mati
Embryo Sakit/Mati
Hewan Sakit/Mati
Virus dapat

Uji Netralisasi Enterovirus Babi pada biakan sel ginjal babi.

A. Virus ditambahkan dengan antibodi positif sebelum
diinokulasikan pada biakan sel
B. Virus ditambahkan dengan antibodi negatif

SKEMA PCR (Animasi)

Komponen PCR
DNA target
Primer (Oligonukleotida pendek, komplementer dg target) dalam konsentrasi
berlebihan
dNTP (dA, dC, dG, dTTP)
Mg2+
Enzim Polimerase DNA Taq-polymerase

Contoh Hasil PCR

RT-PCR
Target RNA dikopi menjadi cDNA dengan
menggunakan primer dan enzim reverse
transkriptase, setelah itu baru PCR

RT-PCR pada Rabies