Anda di halaman 1dari 2

Isolasi DNA kromosom dilakukan menggunakan metode lysis alkali (Wang).

1. Kultur semalam bakteri dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara


memindahkan satu koloni bakteri ke media LB cair. Inkubasi dilakukan
di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu
37oC selama 16 jam (semalam).
2. Sebanyak 3 ml kultur hasil inkubasi 16 jam diambil dan dimasukkan ke
dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan
kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
3. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri,
kemudian pellet diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dengan cara
vortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
4. Supernatan dibuang kembali dan pellet diresuspensi dengan 200 l
lisozim dengan cara vortex dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama
satu jam.
5. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi satu jam ditambah 200 l buffer
lisis, diresuspensi dengan cara dibolak-balik.
6. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah 100 l CI dan 100 l
fenol dingin, diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi
kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.
7. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan ke tabung
mikrosentrifuga dan diperkirakan besar volemenya.
8. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah CI sebanyak 1x volume
supernatan, diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi
kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.
9. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan kembali ke tabung
mikrosentrifuga yang baru dan diperkirakan besar volemenya.
10.
Supernatan tersebut ditambah Na asetat dan etanol absolut
masing-masing sebanyak 0,1 volume supernatan dan 2x volume
supernatan.
11.
Campuran larutan tersebut diresuspensi dan dilakukan inkubasi
pada suhu -20 0C selama 2 jam.
12.
Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam disentrifugasi
kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.

13.

Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung

ditambahkan 500 l etanol 70%, diresuspensi dengan cara dibolakbalik dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13.000 rpm pada
suhu 4 0C selama 10 menit.
14.
Supernatan dibuang kembali, tabung dikeringkan, ditambah 50
l TE dan diresuspensi dengan cara dibolak-balik. Suspensi yang
diperoleh adalah suspensi DNA kromosom bakteri.

http://02bios2unsoed.wordpress.com/tentang/acara-praktikum/2-isolasidna/21-isolasi-dna-kromosom-bakteri/