Validasi dan

Verifikasi

Metode Analisis

Kuliah Anfar II, FFUA, 2012

Prof. Dr.rer.nat. Mochammad Yuwono, MS. Apt
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
yuwono05@yahoo.com

TUJUAN MATA KULIAH VALIDASI METODE

Setelah Kuliah
1

Pokok Bahasan
Definisi, acuan dan
klasifikasi validasi metode;
Tahapan validasi metode
analisis; Macam-macam
parameter validasi, rumus,
cara uji dan kriteria
penerimaan validasi
metode
2

Mahasiswa memahami
prinsip dasar validasi
metode dan mampu
melakukan validasi
metode analisis

y
t
e
Saf

Ef fi c a

cy

y
t
i
l
a
Qu

Quality is important in every product or

service, but it is vital in medicines as it
involves life.

Validasi
Validasi Proses
3

Validasi Metode Analisis

Produksi Obat, Makanan, Kosmetik

Raw Materials

d
e
t
a s
d
i
s
l
e
a
c
V ro
P

Specification
Testing

In Process
Control

Product
Specification
Testing

Validated Analytical Method

4

Analysis of Pharmaceutical Products

Physical testing

n
a
d

Active Pharmaceutical Ingredient (API)

Pharmaceutical Products
Intermediates,
5
Packaging materials

ca
i
t
aly

d
o
th
e
M

li
a
V
Checks Identity
Purity
Strength

Other characteristics

Prosedur Analisis

Pe
ng
em
ba
ng
an

et
od
e

Va
lid
as
i/V
er
Laboratory
Laboratory
ifi
ka
si
Quality Assurance:
m
et
ISO/IEC 17025:2008
od
e
GLP

Sampel

Preparasi
Preparasi Sampel
Sampel dan
dan Analisis
Analisis Lab
Lab

Penyediaan bahan dan

Kualifikasi alat/instrumen

Analisis
Analisis Data &
Laporan
Laporan Hasil
Hasil

Metode Analisis Kimia

Metode Analisis Klasik

Spot test
Volumetri/Titrasi (menggunakan indikator)

Metode Instrumental
Spektrometri (UV-Vis, IR, AAS,
ICP)
Elektrokimia (Potentiometri, ISE dll)
X-ray
Hyphenated Instruments
MS, NMR GC-MS
GC-FTIR/MS

Metode Pemisahan
Kromatografi (HPLC,
GC, TLC dll)

LC-MS/MS

LC-NMR

Metode Analisis
Pengembangan

D
&
R
)
v
e
d
n
A
(
QC

Optimasi

Revalidasi

Pre-validasi

Validasi

Implementasi
(rutin)

Metode Standar
Metode yang dikembangkan dan
ditetapkan oleh suatu organisasi atau
badan standardisasi nasional suatu
negara
Metode standar diterima secara luas
Contoh metode standar:
ISO; ASTM (American Society for Testing
Material); BSN (Badan Standardisasi
Nasional)

Metode Resmi
Dipublikasi atau ditetapkan oleh
lembaga/pemerintah negara tertentu
Wajib digunakan oleh organisasi
pemerintah atau swasta untuk
kesesuaian dengan peraturan/standar
Dirumuskan dan ditetapkan oleh suatu
komisi atau badan hukum
Contoh: Farmakope (USP, BP, FI)

Kenapa perlu validasi metode?

1. Agar dihasilkan data yang ajeg dan
terpercaya
2. Untuk memenuhi persyaratan
GLP
cGMP
ISO 17025
FDA dll.
.Menjamin mutu produk Dapat
diterima oleh badan internasional
11

Definisi Validasi Metode (USP)

Validation of an analytical method
is the process by which it is
established, by laboratories
studies, that the performance
characteristics of the method meet
the requirements for the intended
analytical applications.

12

Terminologi

Validasi
Metode

Verifikasi
Metode

Kualifikasi
Instrumen

Suatu proses (percobaan

laboratorium)
Untuk membuktikan bahwa
karakteristik kinerja metode
analisis telah memenuhi
persyaratan yang telah
ditetapkan
sebelumnya
Suatu proses (percobaan
laboratorium)
Untuk membuktikan bahwa
laboratorium mampu
menggunakan metode analisis
baku/standar pada kondisi
nyata di laboratoriumnya
Kualifikasi instrumen:
DQ, IQ, OQ dan PQ

Metode
Metode baku/Standar
baku/Standar
Compendial
Compendial Method
Method

Verifikasi
Verifikasi

(USP,
(USP,FI,
FI,AOAC,
AOAC, ISO
ISO dll.)
dll.)

Metode
Metodetidak
tidakbaku
baku
Metode
Metodepengembangan
pengembangan
Metode
Metodebaku
bakuyang
yang
dimodifikasi
dimodifikasi

Metode
Metodebaku
bakuyang
yang
digunakan
digunakan di
di luar
luar
lingkup
lingkup

Validasi
Validasi

(ISO 17025.2005, butir 5.4.5.1)

Validasi metode analisis adalah suatu
proses ilmiah yang dilakukan untuk
membuktikan bahwa karakteristik
kinerja metode analisis telah
memenuhi persyaratan yang sesuai
dengan tujuan pengunaannya.
konfirmasi melalui pengujian dan
pengadaan bukti yang objektif
bahwa persyaratan tertentu untuk
suatu maksud khusus dipenuhi.

Verifikasi Metode
Adopsi metode baku/standar
Untuk membuktikan bahwa suatu laboratorium
mampu melakukan analisis di laboratoriumnya
untuk menunjukkan bahwa kinerja metode
dapat ditiru atau diulang oleh laboratorium yang
bersangkutan dengan hasil yang sama

Panduan validasi metode analisis

ICH Q2A : Text on validation of analytical
Procedure
ICH Q2B Validation of analytical procedures
methodology
FDA-CDER (Center for Drug Evaluation and Research)
a. Reviewer guidance validation of
chromatographic methods
b.
Submitting sample and analytical data for
method validation
c. Analytical procedure and method validation
for human studies
d. Bioanalytical method validation for human
studies
USP: Validation of compendial method

Contoh Acuan Verifikasi Metode

Kategori Metode Analisis

I

Penetapan kadar komponen utama

dalam bahan baku obat atau bahan
aktif dalam sediaan farmasi

Kategori
II
Metode Analisis
(USP)
III
IV

Penetapan cemaran atau hasil

Degradasi
Penetapan kuantitatif (II a)
dan uji batas/kualitatif (II b)
Penetapan karakteristik
sediaan (disolusi, pelepasan
obat, dll)

Metode analisis untuk identifikasi

23

Prosedur analisis
Pengambilan
Sampel

Preparasi Sampel

Analisis

Evaluasi data dan

pelaporan hasil
24

Validasi
melibatkan
keseluruhan
prosedur
analisis
(mulai dari pengambilan sampel sampai
pelaporan hasil

Tahapan Validasi Metode

Literature search
Telaah karakteristik Analit
Penyiapan bahan dan alat

Permintaan
Validasi

Validasi
Metode

Penyerahan
dokumen

Penyusunan Laporan
Validasi

Pengembangan/
optimasi Metode

Pembuatan
protokol Validasi

Percobaan
laboratorium sesuai
protokol validasi

Analisis Data

Protokol Validasi/Verifikasi
Metodologi atau prosedur bagaimana
percobaan atau pengujian parameter validasi
direncanakan
Disusun secara rinci
Penting dibuat sebelum pelaksanaan uji
parameter validasi
Pelaksanaan validasi metode menjadi terarah
dan sistematis
Disusun dalam format yang telah ditetapkan

Contoh Isi Protokol Validasi/Verifikasi

Cover

Halaman Pengesahan
Ruang lingkup
Tujuan
Bahan dan Alat
Aspek Keamanan lab
Prosedur percobaan
akurasi
presisi dll.

Kriteria keberterimaan
Daftar Rujukan

Karakteristik kinerja metode

USP and ICH
Presisi

Akurasi

Validasi
Metrode

Batas Deteksi
Batas Kuantitasi
Selektivitas/Spesifisitas
Linearitas
Rentang

Robustness/Ruggedness
System Suitability Test
28

Akurasi dan Presisi Metode

Akurasi rendah
Presisi tinggi

Akurasi tinggi
Presisi tinggi

29

Akurasi tinggi
Presisi rendah

Akurasi rendah
Presisi rendah

Karakteristik kinerja metode

(parameter validasi/verifikasi)
yang dibuktikan harus
berdasarkan pada tujuan
kegunaan dan kategori metode
tersebut.

USP Data Elements Required For Assay Validation

Analytical
Performan
ce
Parameter

Assay Category 2
Assay
Category 1

Quantitati
ve

Limit Tests

Assay
Category
3

Accuracy

Yes

Yes

Precision

Yes

Yes

No

Yes

Specificity

Yes

Yes

Yes

LOD

No

No

Yes

LOQ

No

Yes

No

Linearity

Yes

Yes

No

Range

Yes

Yes

Ruggednes
s

Yes

Yes

Yes

Yes

* May be required, depending on the nature of the specific test.

31

ICH Validation Characteristics

Type of
Analytical
Procedure

Impurity testing
Identificatio
n

Assay

Quantitativ
e

Limit Tests

No

Yes

No

Yes

No

Yes

No

Yes

Interm.
Prec.

No

Yes

No

Yes

Specificity

Yes

Yes

Yes

Yes

LOD

No

No

Yes

No

LOQ

No

Yes

No

No

Linearity

No

Yes

32
No

Yes

Accuracy
Precision
Repeatabilit
y

Kategori Analisis

1. Confirmation of Identity,
a method that ensures a material is what it purports to be or confirms
the detection of the target analyte.

2. Quantifying an analyte at a low concentration.

3. Determining if an analyte is present above or below a
4. specified, low concentration (often called a Limit Test). The
specified concentration is close to the LOQ.

4. Quantifying an analyte at a high concentration.

5. Determining if an analyte is present above or below a
specified, high concentration (often called a Limit Test).
The specified concentration is substantially above the LOQ.
6.

Qualitative test.

Percobaan Laboratorium pada Validasi Metode

Uji Selektivitas/
Spesifisitas
Uji terhadap
senyawa
pengganggu
dari matriks,
cemaran, hasil
degradasi

Linearitas/
Rentang; LOD
dan LOQ

Presisi dan
Akurasi

Ketegaran
(Robustness/
Ruggedness)

Selektivitas vs. Spesifisitas

USP dan ICH menggunakan istilah

Specificity
IUPAC dan AOAC menggunakan
istilah Selectivity
AOAC: Specificity highest selectivity
38

Specificity (ICH/USP)
Specificity (USP/ICH):
The ability to assess unequivocally the
analyte in the presence of components to
expected to be present, such as impurities,
degradation products, and matrix
components.

Selectivity describes the ability of an

analytical method to differentiate various
substances in a sample.
39

Kuliah

Spesifik dan Selektif

Selektif:
Mampu membedakan antara
senyawa analit dengan
derivat/degradan/ metabolit atau
senyawa pengganggu lainnya

Spesifik:
Mampu mengenal respons untuk
analit tunggal/murni
40

Spesifisitas/Selektivitas:
Jika tersedia zat hasil degradasi:
Suntikkan:
Blanko sampel/Placebo (Sampel minus analit)
Zat Hasil degradasi (degradants)
Zat yang memiliki struktur mirip (Related
substances
Zat metabolit (untuk bioanalisis)
41

Spesifisitas/Selektivitas:
Blanko sampel/Placebo
tidak menghasilkan
peak/noda dengan
waktu retensi/Rf yang
sama dengan analit
Peak/noda analit
terpisah dari peak/noda
lainnya
(Rs 1,5)
42

42

Placebo

Sampel

(Rs 1,5)

Meloxicam dalam tablet (spektrofotometri UV/Vis)

Specificity/Selectivity:
Jika tidak tersedia zat hasil degradasi (Degradants)

Lakukan forced degradation studies

(studi degradasi paksa)
Sampel disimpan pada suhu/kelembaban
tertentu atau penambahan oksidator
Bandingkan profil pemisahan peak
sebelum dan sesudah perlakuan
45

Forced Degradation Studies

Heat

Temperature (50 - 60 oC)

Humidity

Kelembaban (70 to 80%)

Acid Hydrolysis HCl 0.1 N

Base Hydrolysis NaOH 0.1 N
Oxidation

H2O2 (3 to 30%)

Light

UV/Vis

46

Spesifisitas: Uji kemurnian analit

Menggunakan Detektor Diode array
Teknik Spiking
Peak hasil spiking menunjukkan satu
peak/noda dan memiliki tR/Rf sama

Pada TLC
menggunakan sistem pengembang berbedabeda

GC-MS
LC-MS; LC-MS/MS

Contoh studi degradasi paksa (HPLC-DAD)

PENETAPAN
KADAR
PAROXETINE
DALAM SEDIAAN
TABLET

Overlay spectra UV - analit

Hasil Degradasi terhadap tablet paroxetine 20 mg

* RRT, relative retention time.

Condition
Acid 0.1 N HC1, 80C
Base 0.1 , 80C
Hydrogen peroxide 0.3%,
80C

Time
(h)
50
50
2

%
Recovery

RRT* of degradation
products

98.0
96.5
73.0

None detected
1.65
0.19, 0.22, 0.23, 0.27

Heat dry, 80C

Heat wet, 80C
Light dry, 1000 foot candles

72
72
144

99.2
96.2
99.5

0.31, 0.35, 0.39, 0.43

0.45, 0.49, 0.52, 0.55
0.59, 0.63, 0.71, 0.76
1.13, 1.36, 1.64
None detected
1.65
None detected

Light wet, 1000 foot candles

144

80.3

0.17, 0.20, 0.23, 0.42

0.44, 0.55, 0.82, 0.88
1.13, 1.60

Spot Identity test: TLC

Scan spektra in situ UV/Vis analit dan zat
standar Evaluasi korelasinya r > 0.999

[mv]

51

[nm]

Linearitas (Linearity)

Respon alat

Kemampuan suatu
metode untuk
menunjukkan
hubungan secara
langsung atau
proporsional antara
respons detektor
dengan perubahan
konsentrasi analit.

52

Linieritas
Melalui analisis statistik
Linear Regression (y = mx + b)
Correlation Coefficient (r),
y-intercept (b), slope (m),
residual sum of squares

(x

x )( yi y )

{( xi x ) 2 ( y 1 y ) 2 }1/ 2

Disarankan menggunakan minimum 5

macam konsentrasi analit
Disarankan terhadap sampel yang independen,
bukan dari sampel hasil pengenceran
Dapat digunakan larutan baku hasil pengenceran
dan/atau larutan spike
53

Evaluasi terhadap Linieritas

Relative process standard deviation
(Vxo)
Mandel test
Residual test
ANOVA-linearity testing
RSD of the Plot of response factor Vs.
concentration
Xp value- Funks et al.
r value
Homogeneity of the linear-curve
54

Evaluasi Linieritas
V XO
S XO

S xo
100%
X

S
Y where SY
b

X P 2 S XO .ttable .

y i

N 2

Y Y
1
1 2P
N
b .QXX

, y a bxi

with

1
X2
YP a SY . ttable .
1
N
Q XX
QXX X i

X
i

, t student t factor for f N - 2

and p 0.05

Sy/x = simpangan baku residu dari regresi

linear
55

Vxo = <2-5%

Koefisien korelasi
Nilai r ternyata TIDAK menjamin
linieritas respons dan konsentrasi
Kurva non linier dapat memiliki r
yang tinggi
Korelasi linier jika rhitung > rtabel. Harga r
tergantung jumlah konsentrasi. Contoh n = 5
rtabel = 0,878; n = 10 r tabel = 0,632

r membuktikan linieritas jika rentang

tidak terlalu lebar dan r 0,999

Residual dan Least square

Makin kecil atau makin besar konsentrasi deviasi makin besar

dikuadratkan dan diminimasi Least square
Oleh karena itu, respons harus memiliki varians yang sama (Homogeneity of
variance = homoscedasticity)

Persamaan garis regresi

koefisien korelasi r 0,999
Persamaan garis melewati titik 0,0
Intersep tidak berbeda secara bermakna dengan nol
lakukan uji t
Slope berbeda secara bermakna dengan harga nol
lakukan uji t

Respons faktor = y/x

Uji Homogenitas
digunakan untuk mengetahui
homogenitas varian pada persamaan
garis regresi
Uji F menguji homogenitas batas
atas dan bawah
Uji Cochran dan uji Barlett menguji
keseluruhan titik pada rentang
persamaan garis

61

Rentang (Range)

Interval antara konsentrasi terbesar

dan terkecil dari analit dalam
sampel
Memenuhi syarat dalam hal presisi,
akurasi dan linieritas

62

Contoh soal
Kadar Vitamin B2

Area Vitamin B2

(g/mL)
0,50

10,85673

1,01

16,84920

2,03

35,91708

5,08

83,20131

10,16

161,14166

20,32

322,53513

40,64

629,94366

r hitung = ????
Persamaan garis regresi : ????
Vx0 = ????

Minimum Specified Range:

For Drug Substance & Drug product Assay
80 to 120% of test Concentration

For Content Uniformity Assay

70 to 130% of test Concentration

For Dissolution Test Method

+/- 20% over entire Specification Range

For Impurity Assays

From Reporting Level to 120% of Impurity
Specification for Impurity Assays

64

Uji Homogenitas kurva kalibrasi

65

Batas Deteksi

Batas Deteksi?

Batas Deteksi:
Konsentrasi terendah analit
dalam sampel yang masih
dapat terdeteksi

Detection Limit
(DL)
Lowest amount of
analyte in a sample
that can be detected
but not necessarily
quantitated.
Estimated by Signal to
Noise Ratio of 3:1.

67

Quantitation Limit
(QL)

Lowest amount of
analyte in a sample
that can be quantified
with suitable accuracy
and precision.

Estimated by Signal to
Noise Ratio of 10:1.

Detection Limit (DL) and Quantitation Limit (QL)

1. Based in Visual Evaluations
. Used for non-instrumental methods
2. Based on Signal-to Noise-Ratio
- 3:1 for Detection Limit
. 10:1 for Quantitation Limit
3. Based on Standard Deviation of the Response
and the Slope
menggunakan sampel konsentrasi rendah
68

Based on Signal-to Noise-Ratio

70

Based on the Standard Deviation of the

Response and the Slope

where
= the standard deviation of the response
( SD of blank samples or SD of intercepts of
regression line)

S = the slope of the calibration curve

71

Akurasi
Biasanya dinyatakan dalam persen
perolehan kembali (% recovery)
Dapat dilakukan melalui pebandingan hasil
analisis antara metode yang divalidasi
dengan metode standar uji t harus
tidak berbeda makna
Dapat dilakukan metode adisi standar
terhadap blanko atau sampel.

72

Akurasi
Persen perolehan kembali (% recovery)

Kadar yang diperoleh

% Re c
x100%
Kadar sesungguhnya
Persyaratan untuk assay validation = 98-102%
Dianjurkan menggunakan tiga macam konsentrasi
masing-masing 3 kali replikasi
Adisi standar pada blanko/plasebo

73

KURVA AKURASI menurut Funk

et. al.

- Untuk

mengetahui ada atau tidaknya kesalahan sistematis,

Dibuat kurva regresi antara Xf (konsentrasi analit hasil
analisis) terhadap Xc (konsentrasi nominal analit)
Xf = af + bf. Xc
- Dihitung confidence range (Cr) dari intercept {VB(af)} dan
slope {VB(bf)} dari recovery Pada p = 0.05
Cr bf = bf

1 Xc 2
Cr af = af ttable . Syf .

N Qxx

t = Student-t-factor f = N-2, P = 95 74
%.

ttable.Syf
Qxx

Syf =

2
[X
if
(a
f
+
b
f
X
i
)]

N-2

M. Yuwono & G. Indrayanto, Validation method of Chromatography Methods of

Analysis, Profiles of Drugs Substances, Excipients and Related Methodology,
Vol. 32, Elsevier Academic Press, San Diego, New York, Boston, London,
Sydney, Tokyo, Toronto. In Press (2005)

75

Analyte recovery at different concentration

Analyte Ingred.
(%)

Analyte
ratio

Unit

Mean recovery (%)

100

100 %

98-102

10

10-1

10 %

98-102

10-2

1%

97-103

0.1

10-3

0.1%

95-105

0.01

10-4

100 ppm

90-107

0.001

10-5

10 ppm

80-110

0.0001

10-6

1 ppm

80-110

0.00001

10-7

100 ppb

80-110

0.000001

10-8

10 ppb

60-115

0.0000001

10-9

1 ppb

40-120

AOAC manual for the Peer-Verified Methods program

76

Hitung berapa % recovery?

% Bahan Aktif
terhadap klaim label
dalam Tablet

Berat yang
ditimbang (mg)

Berat tablet yang

ditemukan (mg)

50

10,02
10,02
10,02
20,04
20,04
20,04
30,05
30,05
30,05

9,98
9,99
9,98
19,99
19,99
19,99
29,97
29,96
22,99

100

150

Presisi
Kedekatan dari suatu seri pengukuran yang
diperoleh dari sampel yang homogen
Dalam bentuk RSD (relative standard
deviation)
Meliputi:
- Repeatability
- Intermediate Precision
- Reproducibility

78

Repeatability
Kondisi sama pada interval waktu
yang singkat
Satu larutan uji disuntikkan berkalikali pada hari yang sama, alat yang
sama, analisis serta kondisi lain yang
sama.
Disebut juga Intra-assay precision

79

Intermediate Precision

Disebut juga within-laboratory variations.

Berbeda hari, atau analis, atau instrument
(dalam satu laboratorium)
Sebagai bagian Ruggedness menurut USP

80

Reproducibility

Repeatability test at different labs.

Berbeda analis atau instrument dari
laboratorium yang berbeda

81

Uji Presisi :
Dianjurkan menggunakan 3 macam
konsentrasi berbeda, misal 80, 100 dan 120 %
dari konsentrasi target
Masing-masing konsentrasi dilakukan 3
replikasi
Dianjurkan juga dilakukan pada hari yang
berbeda dan analisis yang berbeda
Kriteria penerimaan: tergantung kategori
analisis atau konsentrasi analit
Contoh: RSD < 2% (kategori I)

82

Analyte concentration vs precision

Analyte %

Analyte ratio

Unit

RSD (%)

100

100 %

1.3

10

10-1

10 %

2.7

10-2

1%

2.8

0.1

10-3

0.1%

3.7

0.01

10-4

100 ppm

5.3

0.001

10-5

10 ppm

7.3

0.0001

10-6

1 ppm

11

0.00001

10-7

100 ppb

15

0.000001

10-8

10 ppb

21

0.0000001

10-9

1 ppb

30

AOAC manual for the Peer-Verified Methods program

83

Kurva Horwitz
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log C)
C adalah konsentrasi (fraksi desimal)
Misalnya : Untuk kadar C = 100%
maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log 1) = 2%
HORRAT = SBRobs/SBRcalc

Hitung presisinya
Replikasi

Kadar Paroxetine Kadar Paroxetine

(mg/tablet)
(mg/tablet)
(Analis I)
(Analis II)

19,93

19,89

20,03

19,82

19,91

19,91

19,86

19,93

20,02

19,92

19,79

19,90

Robustness
Definition: Capacity to remain unaffected by
small variations in method parameters
Determination: Comparison results under
differing conditions with precision under
normal conditions
Variations may include: stability of analytical
solution, variation of pH in a mobile phase,
different column (lot/supplier), temperature,
flow rate.
86

Ruggedness
degree of reproducibility of test results
obtained by the analysis of same samples
under a variety of conditions,
such as different laboratories, analysts,
instruments, different lot of reagents,
days etc.

87

Re-Validation
When sponsors make changes in the
analytical procedure, drug substance, drug
product, the changes, may necessitate
revalidation of the analytical procedures.
The degree of revalidation depends on the
nature of the change.

88

Terima Kasih!