BAB I

SPEKTROSKOPI FLUOROMETRI

A. Latar Belakang
Spektroskopi adalah ilmu yang mempelajari materi dan atributnya
berdasarkan cahaya, partikel yang dipancarkan, diserap atau dipantulkan oleh
materi tersebut. Pada abad pertengahan 19 kimiawan Jerman Robert Wilhelm
Bunsen (1811-1899) dan fisikawan Jerman Gustav Robert Kirchhoff (18241887) berkerjasama mengembangkan spektrometer, mereka menemukan
unsur yaitu rubidium dan cesium. Spektroskopi ng banyak berperan penting
dalam penemuan gas mulia.
Spektrofotometri adalah ilmu yang mempelajari tentang penggunaan
spektrofotometer.

Spektriofotometer

adalah

alat

yang

terdiri

dari

spektrofotometer dan fotometer. Spektofotometer adalah alat yang digunakan

untuk mengukur energi secara relative jika energi tersebut ditransmisikan,
direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang.
Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang
gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya
yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi.
Metode dengan bantuan spektrometer adalah spektroskopi. Spektometer
terdiri dari sumber sinar, prisma, sel sampel, detektor dan pencatat. Fungsi
prisma adalah untuk memisahkan sinar polimkromatis di sumber cahaya
menjadi sinar monokromatis. Dalam spektrometer modern, sinar yang datang
pada sampel diubah panjang gelombangnya secara kontinyu. Hasil percobaan
diungkapkan dalam spektrum dengan absisnya menyatakan panjang
gelombang (atau bilangan gelombang atau frekuensi) sinar datang dan
ordinatnya menyatakan energi yang diserap sampel. Radiasi cahaya atau

elektromagnet dapat dianggap menyerupai gelombang. Beberapa sifat fisika

cahaya paling baik diterangkan dengan ciri gelombangnya, sedangkan sifat
lain diterangkan dengan sifat partikel. Jadi cahaya dapat bersifat ganda.
Diagram suatu gelombang yang ditandai dengan cirri yang penting dapat
dilihat dalam gambar berikut :

= panjang gelombang, yaitu jarak yang ditempuh oleh gelombang selama

satu siklus (Cycle), dengan satuan : satuan panjang/ siklus A = amplitude
gelombang, yaitu perpindahan maksimum dari poros horizontal, satuan :
satuan panjang T = periode, waktu yang dibutuhkan untuk satu siklus
sempurna, satuan : detik/ siklus = frekuensi osilasi, jumlah siklus dalam
tiap detik, satuan : siklus/detik atau Hertz.

BAB II
A. Teori Spektroskopi Fluorometri
Fluoresensi adalah proses pemancaran radiasi cahaya oleh suatu materi
setelah tereksitasi oleh berkas cahaya berenergi tinggi. Emisi cahaya terjadi
karena proses absorbsi cahaya oleh atom yang mengakibatkan keadaan atom
tereksitasi. Keadaan atom yang tereksitasi akan kembali keadaan semula
dengan melepaskan energi yang berupa cahaya (de-eksitasi). Fluoresensi
merupakan proses perpindahan tingkat energi dari keadaan atom tereksitasi
(S1 atau S2) menuju ke keadaan stabil (ground states). Proses fluoresensi
berlangsung kurang lebih 1 nano detik sedangkan proses fosforesensi
berlangung lebih lama, sekitar 1 sampai dengan 1000 mili detik.
Teknik analisis spektrofluorometri adalah termasuk salah satu tenik analisis
instrumental disamping teknik kromatografi dan elektroanalisis kimia. Teknik
tersebut memanfaatkan fenomena interaksi materi dengan gelombang
elektromagnetik seperti sinar-x, ultraviolet, cahaya tampak dan inframerah.
Fenomena interaksi bersifat spesifik baik absorpsi maupun emisi. Interaksi
tersebut menghasilkan signal-signal yang disadap sebagai alat analisis
kualitatif dan kuantitatif. Contoh teknik spektroflourometri absorpsi adalah
UV/VIS, inframerah (FT-IR) dan absorpsi atom (AAS). Sedang contoh
spektrofluorometri emisi adalah spektrofluorometri nyala dan inductively
coupled plasma (ICP), yang merupakan alat ampuh dalam analisis logam.
Masih banyak teknik lain yang didasarkan pada hamburan atau difraksi
cahaya seperti turbidimetri dan sinar-x.

B.

Prinsip Dasar Spektroskopi Flourmetri

Prinsip-prinsip umum dapat diilustrasikan dengan diagram Jablonski (Veberg,
2006), seperti yang ditunjukkan pada Gambar di bawah. Menurut diagram
Jablonski energi emisi lebih rendah dibandingkandengan eksitasi. Ini berarti
bahwa emisi fluoresensi yang lebih tinggi terjadi pada panjang gelombang
dari penyerapan (eksitasi). Perbedaan antara eksitasi dan panjang gelombang
emisi dikenal sebagai pergeseran Stoke.

Langkah pertama (i) adalah eksitasi, di mana cahaya diserap oleh

molekul,yang ditransfer ke keadaan tereksitasi secara elektronik yang berarti
bahwa sebuahelektron bergerak dari keadaan dasar singlet, S0, ke keadaan
singlet tereksitasiS1. Inidiikuti dengan relaksasi getaran atau konversi
internal (ii), dimana molekul inimengalami transisi dari elektronik atas ke
yang lebih rendahS 1, tanpa radiasiapapun. Akhirnya, emisi terjadi (iii),
biasanya 10 - 8 detik setelah eksitasi, ketika kembali elektron kekeadaan
dasar lebih stabil, S0, memancarkan cahaya pada panjanggelombang yang
sesuaidengan perbedaan energi antara kedua negara elektronik.

Dalam molekul, masing-masing kondisi elektronik memiliki beberapa

kondisibagian getaran terkait. Dalam keadaan dasar, hampir semua molekul
menempatitingkat vibrasi terendah. Dengan eksitasi dengan sinar UV atau
terlihat, adalahmungkin untuk mempromosikan molekul yang tertarik ke
salah satu tingkat getaranbeberapa tingkat tereksitasi secara elektronik yang
diberikan. Ini berarti bahwa emisifluoresensi tidak hanya terjadi pada satu
panjang gelombang tunggal, melainkanmelalui distribusi panjang gelombang
yang sesuai untuk transisi vibrasi beberapasebagai komponen dari transisi
elektronik tunggal. Inilah sebabnya mengapa eksitasidan spektrum emisi
diperoleh

untuk

menggambarkan

secara

rinci

karakteristik molekul

fluoresensi
1. Luminesensi.
Yaitu emisi fotons dari keadaan tereksitasi elektronik. Terdapat dua tipe si
antara lain : a. Relaksasi dari keadaan eksitasi singlet excited. b. Relaksasi
dari keadaan eksitasi triplet.
2. Keadaan singlet dan triplet stated.
Yaitu keadaan dasar dua elektron perorbital. Keadaan eksitasi singlet :
elektron pada orbital tinggi memiliki arah spin berlawanan relative
terhadap elektron dalam orbital lebih rendah.
Keadaan eksitasi triplet : elektron valence tereksitasi secara spontan
berbalik arah spinnya. Proses ini disebut intersystem crossing. Elektron
dalam kedua orbital sekarang memiliki arah spin yang sama.
3. Jenis emisi

Dimana fluoresensi kembali dari keadaan eksitasi singlet ke keadaan dasar,

tidak memerlukan perubahan arah spin. Fosforesensi yaitu kembali dari
keadaan eksitasi triplet ke keadaan dasar, elektron perlu perubahan arah
spin. Laju emisi fluoresensi beberapa tingkat lebih cepat dari pada
fosforesensi.
Proses fluorosensi dalam keadaan tereksitasi, elektron akan di promosikan
ke orbital anti-bonding menjadikan atom dalam ikatan kurang kuat terikat
sehingga bergeser ke kanan kurva energi potensial S1 akibatnya elektron
terpromosikan ke level energi vibrational eksitasi S1 lebih tinggi dari pada
level vibrational dalam keadaan dasar. Deteksi vibrational berlangsung
lewat tabrakan intermolekul pada skala waktu 10-12s (lebih cepat dari pada
proses fluoresensi).
C. Absorbsi
Ketika suatu atom atau molekul mengabsorbsi energi cahaya sebesar hA
maka

elektron-elektron pada kondisi dasar (ground sate) S0akan

berpindah ke tingkat energi yang lebih tinggi ke tinggat S1 atau S2. Waktu
yang dibutuhkan untuk proses tersebut kurang dari 1piko detik.

Atom akan mengalami konversi internal atau relaksasi pada kondisi S1

dalam waktu yang sangat singkat sekitar 10-1ns, kemudian atom tersebut
akan melepaskan sejumlah energi sebesar hfyang berupa cahaya.
Karenanya energi atom semakin lama semakin berkurang dan akan
kembali menuju ke tingkat energi dasar S0 untuk mencapai keadaan suhu
yang setimbang (thermally equilibrium). Emisi fluoresensi dalam bentuk
spektrum yang lebar terjadi akibat perpindahan tingkat energi S1 menuju
ke sub-tingkat energi S0 yang berbeda-beda yang menunjukan tingkat
keadaan energi dasar vibrasi atom 0, 1, dan 2 berdasarkan prinsip FrankCondon.
D. Instrumen

Pengukuran intensitas fluoresensi dapat dilakukan dengan suatu fluorometer

filter sederhana. Fluorometri adalah suatu metode analisis yang erat
hubungannya dengan spektrofluorometri. Energi yang di serap oleh molekul
untuk transisi elektronik ke level energi yang lebih tinggi harus dilepaskan
kembali pada waktu kembali ke level energi terendah. Energi yang dilepaskan
ini dapat berupa panas dan untuk beberapa molekul tertentu sebagian dari
energi yang diserap dipancarkan kembali berupa cahaya (fluoresensi).
E. Penerapan dari Spektroskopi Fluoresensi
Hanya sedikit ion anorganik yang berpendar, yang paling dikenal adalah
ionuranil, UO22+. Umumnya alanisis fluorometrik melibatkan molekul
organik. Adabeberapa senyawa kelat logam yang berpendar yang memberikan
metode yang pekauntuk beberapa ion logam. Seringkali kelat logam
diekstraksi dari dalam larutanberair menjadi suatu pelarut organik sebelum
pengukuran, suatu proses dan sekaligusmemisahkannya dari ion-ion
pengganggu dan mengkonsentrasikan spesies yangberpendar. Misalnya,
banyak terdapat reagensia flourometrik untuk aluminium danberilium.
Logam-logam

yang

lebih

berat

seperti

Fe2+,

Co2+,

Ni2+dan

Cu2+

sebaliknyacenderung mematikan flourosens yang diperagakan oleh banyak

zat pengkelat itusendiri, hadinya logam itu dalam kompleks mendorong
dibuangnya energi yangdiserap secara tak radiantif.Kadang suatu analit yang
tidak berpendar dapat diubah menjadi suatu molekulyang berpendar kuat,
dengan suatu reaksi yang cepat dan kuantitatif, yang denganmuadah
digabungkan ke dalam suatu prosedur analitik keseluruhan. Misalnya,hormon

epinefrin (adrenalin) mudah diubah menjadi adrenolutin. Dalam larutan

basa,anion folat dari adrenolutin berpendar dengan kuat (eksitasi 360 nm;
pancaran 530nm). Pasien dengan tumor tertentu pada kelenjar adrenalin dan
juga beberapa penderita tekanan darah tinggi menunjukkan kadar efinefrina
yang meningkat dalamair seninya. Hormon yang terdapat pada kadar yang
sangat rendah dapat dipekatkandari dalam volume besar air seni dengan suatu
prosedur penukar ion pada suatu pHdimana nitrogen amino diprotonkan
untuk membentuk suatu kation RNH2-CH2,dielusi dalam sedikit volume
dengan ditukar-ganti dengan H+dan diolah seperti diatas untuk membentuk
flourofor itu.
Beberapa

vitamin

dapat

ditetapkan

secara

fluorometrik.

Oksidasi

lembuttiamina (vitamin B1) oleh Fe(CN)63-, misalnya akan menghasilkan

suatu produk yangdisebut tiokrom yang memperagakan fluoresens biru pada
kondisi yang tepat. Jikapancaran pendaran itu diukur terhadap dua porsi
sampel, satu diolah denganferisianida dan yang lain tidak, orang dapat
mengurangi kontribusi pengganggu non-tiamina yang berpendar untuk
meningkatkan selektivitas. Riboflavin (vitamin B1) danpiridoksin (B6)
merupakan vitamin lain yang dapat ditetapkan oleh fluoresensi.Meskipun
kebanyakan asam amino tidak berpendar, tetapi mudah bereaksidengan
reagen fluoresamina untuk membentuk senyawa yang sangat berpendar
yangtelah digunakan dalam biokimia untuk mendeteksi kuantitas.Metode
fluoresensi sangat baik untuk menetapkan beberapa hidrokarbon aromatik
polisiklik yang telah dikelompokkan sebagai polutan prioritas oleh Jawatan

Perlindungan Lingkungan Amerika Serikat (EPA), yang mengatakan

bahwafluoresens memberi deteksi yang sangat peka terhadap komponenkomponen sampeltertentu dalam kromatografi cairan. Misalnya pada produk
Susu :Produk-produk susu mengandung beberapa fluorophores intrinsik.
Misalnya asamamino aromatik dan asam nukleat, triptofan, tirosin dan
fenilalanin dalam protein,vitamin A dan B2, Nikotinamida adenin
dinukleotida (NADH) dan klorofil, danberbagai senyawa lainnya yang dapat
ditemukan pada konsentrasi rendah atau sangatrendah di produk makanan.