Fluoremetri merupakan salah satu metode yang cukup sensitif untuk mendeteksi biomolekul dalam

jumlah yang sedikit seperti hormon, amina, asam amino, peptida, protein, karbohidrat,
lemak,maupun asam nukleat (DNA atau RNA). Sehingga metode ini menjadi metode yang paling
tepat untuk deteksi, identifikasi dan kuantifikasi protein dalam analisis proteomik.
Namun, kebanyakan protein tidak memiliki sifat fluoresen, sehingga derivatisasi fluoresen dengan
reagen menjadi hal yang penting untuk deteksi protein. Dalam hal ini sangat direkomendasikan
menggunakan reagen fluoregenik untuk dapat menghasilkan fluoresen protein yang telah
mengalami derivatisasi dengan reagen tersebut. Beberapa reagen fluoregenik untuk amina yaitu
orthophthaladehida dan fluorescamina. Sedangkan untuk derivatisasi residu sistein dalam protein
diperlukan

reagen

yang

benzoxadiazole-4-sulfonate

mengandung

gugus

thiol

seperti

Ammonium-7-fluoro-2,1,3-

(SDB-F),

dan

7-chloro-N-[2-(dimethylamino)ethyl]-2-1,3-

benzoxadiazole-4-sulfonamida (DAABD-Cl). Hal ini dikarenakan beberapa alasan yaitu :

1. Karena reagen tersebut merupakan molekul kecil sehingga dapat bereaksi sempurna denga residu
sistein dalam protein.
2. Derivat protein bersifat hidrofiliksehingga tidak mengalami pengendapan setelah derivatisasi
sempurna.
3. derivat protein memiliki kemampuan fluoresen yang tinggi pada panjang gelombang emisi yang
lebih besar dibandingkan biomolekul yang berfluoresensi secara alami (> 400 nm).
Teknik kromatografi dengan instrumen HPLC dapat memisahkan senyawa dalam matriks
yang kompleks dari suatu biomolekul. Namun dalam pemisahan protein kromatografi dengan
HPLC jarang digunakan. Metodelain yang umumnya dipakai untuk analisis proteomik adalah FDLC-MS/MS. Analisis yang dilakukan diawali dengan proses derivatisasi protein dengan reagen
fluorogenik seperti SBD-F dan DAABD-Cl, kemudian diikuti dengan proses pemisahan derivat
protein, deteksi, dan kuantifikasi dengan HPLC. Selanjutnya dilakukan isolasi dari protein target
dan mendestruksi protein tersebut dengan enzim. Identifikasi protein target tersebut menggunakan
HPLC dan tandem MS, dengan analisis komputasional. Metode FD-LC-MS/MS secara umum
ditunjukkan pada gambar 1.
1. Campuran protein diderivatisasi dengan reagen fluorogenik dan dianalisis dengan deteksi
fluoresensi-HPLC.
2. Derivat protein target diisolasi tanpa menghilangkan informasi urutan asam amino termasuk
isoform protein dan modifikasi translasional dari protein.
3. Hasil isolasi derivat protein target didestruksi dengan enzim trypsin.
4. Campuran peptida diinjeksikan ke dalam instrumen HPLC dengan menggunakan instrumen
metode ionisasi ESI yang dikoneksikan dengan tandem MS (ESI-MS/MS).
5. Identifikasi, kunatifikasi protein dilakukan dengan menggunakan pendekatan algoritma secara

komputasional.