PRAKTIKUM BIOMOLEKUL

ISOLASI DNA KROMOSOM DAN PLASMID

Kelompok 2:
1.

Handariatul Masruroh

(121810301003)

2.

Endah Retno K.

(121810301019)

3.

Beny Akhmat Saputra

(121810301034)

4.

Lia Lazimatur Rofiah

(121810301055)

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2014

BAB 1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) merupakan molekul yang
mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme
pada setiap organisme.
Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil dan terletak di luar kromosom
dengan utas ganda dalam sel prokariot khususnya bakteri dan sel eukariot tingkat
rendah seperti khamir.Plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel
inang. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan
menggunakan Escherichia coli sebagai inang sehingga dalam rekayasa genetika,
plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang
Pada dasarnya plasmid merupakan identitas genetik yang ditemukan
secara alami di dalam sel beberapa kelompok prokariot dan eukariot. Dengan
teknik rekayasa genetik, sekarang telah dikembangkan plasmid artifisial dengan
cara menggabungkan gen-gen dari plasmid alami maupun genom tertentu.
Pengamatan

DNA

plasmid

dilakukan

melalui

proses

isolasi

plasmid,

elektroforesis, dan visualisasi menggunakan sinar ultraviolet (UV). Berdasarkan

pernyataan diatas maka dilakukanlah praktikum isolasi DNA plasmid dan
kromosom untuk mempelajari cara mengisolasi DNA dan bagaimana mengetahui
berat molekul dari DNA tersebut.
1.2 Rumusan Masalah
Adapun rumusan masalah yang akan dibahas dalam praktikum ini adalah:
a. Apa yang dimaksud dengan DNA?
b. Bagaimana metode isolasi DNA plasmid?
c. Bagaimana cara untuk mengetahui berat molekul DNA plasmid?

1.3 Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah:
a. Melatih kemampuan mahasiswa untuk mengisolasi DNA kromosom dan
plasmid.
b. Memahami dan mengetahui berat molekul DNA kromosom dan plasmid.
c. Membedakan DNA kromosom dan plasmid.
1.4 Manfaat
Manfaat yang didapatkan dari praktikum kali ini adalah dapat
mengisolasi DNA, mengetahui perbedaan dari DNA kromosom dan plasmid serta
mengetahui berat molekulnya.

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian DNA
DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok
basa berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimidin. DNA
memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponenkomponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa.
Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin.
Basa purin terdiri atas Adenin (A) dan Guanin (G) yang memiliki struktur cincin
ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan Timin (T) yang
memiliki struktur cincin tunggal. Guanin berikatan dengan sitosin maka akan
terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika adenin berikatan dengan timin
maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen (Sudjadi, 2008).
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan
terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti
mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi
asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA
genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA
genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA
penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau
dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear
sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Prokariot juga mengandung
satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran
yang jauh lebih kecil dibanding kromosom. DNA terdapat di setiap sel makhluk
hidup yang memiliki peranan sangat penting yaitu sebagai pembawa informasi
hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain. Teknik
isolasi DNA dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor,
khususnya plasmid (Calladine dan Horace, 2004).
DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan
penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein
dan proses metabolisme lain. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan,

baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk
memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat
digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam
struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently
closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan
kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan
tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila
dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi
denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom
(Susanto, 2012).
Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat
herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi
genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi
kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia maupun pada
tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah (Campbell, 2002).
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel,
yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi,
beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah
berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan
mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan
yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus
disertai dengan perusakan membran nukleus (Susanto, 2012).
Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya
pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa
dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk
kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase.
DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur
dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari
RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan
penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan
menggunakan CsCl (Susanto, 2012).

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA

genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara
kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua
pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang
sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC),
sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan
mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan
DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan
DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat
memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom (Sakura, 2010).
2.2 Isolasi DNA plasmid
Isolasi DNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam
rekayasa genetika sebelum melangkah keproses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi
total DNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan
tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan
DNA. Ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pellet sel yang mengandung
DNA total. Prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA
dari jaringan (Muladno, 2002).
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar
kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang
terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan
kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering menjadi sintesis protein untuk
resistensi untuk antibiotik. Plasmid dalam rekayasa genetika sering digunakan
sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu
sel inang. Gen-gen selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu
seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim isolasi DNA. Prinsip isolasi DNA
adalah sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya, yang memiliki berat molekul besar
akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian
atas tabung. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin
sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi (Campbell, 2002).

Langkah awal untuk mendapatkan plasmid adalah dengan menumbuhkan

sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Sel yang telah
ditumbuhkan kemudian dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi
sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan
sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Homogenisasi yang dilakukan
menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi sel dan
tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA (Muladno, 2002).
Plasmid bakteri yang biasanya merupakan molekul DNA untai ganda
dengan ukuran dari 1 kb sampai dengan lebih dari 200 kb. Plasmid ini terdapat
dalam berbagai spesies bakteri dan merupakan satuan genetik tambahan yang
bereplikasi dengan tidak tergantung pada kromosom bakteri dan diturunkan
kepada anakan. Replikasi dan transkripsi tetap tergantung pada enzim yang
terdapat pada sel inang. Plasmid membawa gen yang menjadi enzim yang pada
keadaan tertentu menguntungkan sel inang, di antaranya resisten terhadap
antibiotik, produksi antibiotik, degradasi senyawa organic kompleks, produksi
kolkisin, produksi enterotoksin, enzim restriksi, dan enzim modifikasi (Sudjadi,
2008).
Plasmid mempunyai suatu urutan basa tertentu yang berfungsi sebagai
daerah awal replikasi (replikon), yang tanpa lokus ini plasmid tidak dapat
memperbanyak diri dalam sel inang. Jenis replikon ini yang menentukan jumlah
duplikat plasmid dalam setiap sel inang. Plasmid terdapat dalam jumlah 10, 30,
sampai 100 molekul plasmid dalam setiap sel. Plasmid jenis ini dinamakan
plasmid berduplikat tinggi, sedangkan plasmid jenis lain terdapat 2, 4 dan 8
duplikat persel yang dinamakan plasmid berduplikat rendah (Sudjadi, 2008).
Sebagai penyusun genetik yang dapat replikasi sendiri, plasmid dapat
merupakan vector yang membawa DNA yang diklon. Akan tetapi, plasmid alam
tidak mempunyai sifat-sifat yang diperlukan sebagai vector cloning yang baik.
Sifat yang diperlukan sebagai vektor kloning antara lain:
1. Berukuran kecil, sehingga mudah diisolasi dan menaikkan efisiensi
transformasi ke dalam E. Coli. Efisiensi transformasi ini menurun sesuai
dengan kenaikan ukuran plasmid.

2. Mempunyai

lokus

tunggal

restriksi

endonuklease

tertentu

untuk

penyisipan DNA yang diklom.

3. Mempunyai satu atau lebih penanda genetik seleksi sebagai identifikasi sel
yang telah membawa plasmid rekombinan (Calladine dan Horace, 2004).
Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam
proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali
digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya.
Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran
kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara
autonom (Lehninger, 1982).
Pemetaan plasmid merupakan penentuan posisi relatif dari gen-gen
pada sebuah molekul DNA (kromosom atau plasmid) dan dari jarak antara
molekul DNA tersebut baik dalam unit-unit ikatan atau dalam unit-unit fisik.
Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap
kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi
yaitu memberikan kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga
pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis
(pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan
membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid,
lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran
fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Brock et al., 1994).
DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui
elektroforesis dan spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan
protein berdasarkan bobot molekul dan muatannya dengan menggunakan media
pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung
pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus
listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul. Hasil elektroforesis DNA total
akan menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteri Escherichia
coli yang kemungkinan adalah DNA plasmid (Alatar et al., 2012).
Sebuah isolasi yang baik harus sederhana, cepat dan efisien serta
menghasilkan jumlah DNA yang cukup berkualitas tinggi yang cocok untuk

analisis molekuler. Hasil DNA dari protokol yang dioptimalkan diamati secara
luas bebas dari polyphenolik dan metabolit sekunder, sebagaimana ditentukan
oleh digesti yang sukses dengan restriksi endonuklease dan amplifikasi PCR.
Semua metode tersebut pada umumnya menggunakan detergen seperti SDS untuk
melisiskan dinding sel, dan sering menghambat manipulasi pemurnian lebih lanjut
(Alatar et al, 2012).

BAB 3. METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
Tabung reaksi
Shaker incubator
Termometer
Pipet mohr
Pipet tetes
Waterbath
Erlenmeyer
Gelas beaker
Mikro pipet
Sentrifuge
Tabung eppendorf
3.1.2 Bahan
Aquades
Buffer TE (50 Mm tris HCl Ph 8 dan 50 Mm EDTA)
Larutan STEP (SDS 1%, tris Cl, EDTA Ph 8 proteinase K)
Larutan fenol jenuh
Natrium asetat 0,3 M
Etanol absolut
Etanol 70%
ddH2O
E.coli
Larutan I (Glukosa 50 Mm, Tris-Cl 2.5 Mm Ph 8, Na2EDTA 10 Mm Ph 8)
Larutan II (NaOH 0.2 N 20 L, SDS 1% 100 L, aqudes steril 880 L)
Larutan III (Kalium asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin)

 Campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1)

Agarosa
Buffer TAE
Larutan EtBr
3.2 Alur Percobaan
3.2.1 Isolasi DNA plasmid Pet-endo
E. coli
Sampel diinokulasi di dalam 5 Ml media LB cair yang mengandung 2,5 L
kanamisin dan diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 370C dengan
kecepatan 150 rpm selama 16 jam.
5 Ml suspensi sel disentrifugasu selama 2 menit dengan kecepatan 10.000
rpm pada suhu 40C, pellet disuspensi dengan larutan I sebanyak 100 L
dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit.
Ditambahkan 200 L larutan II, dihomogenkan dengan cara membolak
balik tabung eppendorf.
Diinkubasi di es selama 15 menit.
Ditambahkan 150 L larutan III, diinkubasi dalam es selama 10 menit.
Campuran disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm
suhu 40C.
Supernatan yang diperoleh dipindah dalam tabung eppendorf, dan
ditambah campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali
volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi 2
menit pada 12.000 rpm.
Terbentuk 3 fase, fase atas (fase cair) dipipet dan dipindah dalam tabung
eppendorf, fase cair dipekatkan dengan menambah etanol absolut dingin 2
kali volume total dan diinkubasi dalam es selama 1 jam.
Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, pellet dicuci dengan
etanol dingin 70%.
Disentrifugasi lagi dan tabung eppendorf di keringkan dari etanol dengan
cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit.

 Pellet dilarutkan dalam 30 L ddH2O.

Hasil
3.2.2 AnalisisDNA dengan elektroforesis gel agarosa
0,4 gram agarosa
Gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan sampel dalam 40 Ml bufer TAE
(40 Mm Tris-asetat dan 1 Mm Na2EDTA Ph 8/ stok buffer TAE 5X : 24.2
gram, 5.72 Ml asam asetat glasial dan 10 Ml dengan pemanasan).
Setelah agarosa terlarut dan didinginkan sampei kira-kira temperatur 450C,
gel dituangkan pada cetakan dan dibiarkan memadat.
Sampel yang akan dielektroforesis dicampur dengan bufer pembeban 1x
(bufer pembeban 6x : bromofenol biru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40%
(b/v)), elektrolisis dilakukan dalam bufer TAE pada tegangan 70-100 volt.
Elektroforesis dihentikan ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira
2/3 dari panjang gel.
Gel agarosa direndam dalam larutan EtBr 250 g/Ml selama 3-5 menit,
selanjutnya direndam dalam bufer TAE selam 5-10 menit atau aquades.
Pita-pita DNA dapat diamati dengan sinar UV.
Hasil
3.3 Prosedur Kegiatan
3.3.1

Isolasi DNA plasmid Pet-endo

Koloni tunggal transforman E. Coli diinokulasi ke dalam 5 Ml media LB

cair yang mengandung 2.5 L kanamisin dan diinkubasi pada shaker incubator
pada suhu 370C dengan kecepatan 150rpm selama 16 jam. Kemudian sebanyak 5
Ml suspensi sel disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada
suhu 40C, pellet disuspensi dengan larutan I (Glukosa 50 Mm, Tris-Cl 2.5 Mm Ph
8, Na2EDTA 10 Mm Ph 8) 100 L dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit.
Ditambahkan 200 Llarutan II (NaOH 0.2 N 20 L, SDS 1% 100 L, aquades
steril 880 L) dan dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung eppendorf,
larutan diinkubasi di es selama 15 menit, setelah 15 menit ditambahkan 150 L

larutan III (kalium asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin), diinkubasi
dalam es selama 10 menit. Campuran tersebut disentrifugasi selama 5 menit
dengan kecepatan 12.000 rpm suhu 40C, supernatan yang diperoleh dipindah
secara perlahan dengan menggunakan pipet ke dalam tabung eppendorf baru yang
steril dan ditambahkan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1
kali volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi
12.000 rpm selama 2 menit. Dihasilkan 3 lapis, fasa paling bawah adalah fasa
organikk, fasa tengah adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas adalah fasa
cair, fasa cair dipindah dengan cara memipet secara hati-hati ke dalam tabung
eppendorf baru yang steril, fasa cair tersebut dipekatkan dengan penambahan
etanol absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam.
Campuran disentrifugasi lagi dan tabung eppendorf dikeringkan dari etanol
dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit. Kemudian pellet
dilarutkan dalam 30 L ddH2O.
3.3.2

Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa

Gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0,4 gram agarosa dalam 40 Ml

buffer TAE (40 Mm Tris-asetat dan 1 Mm Na 2EDTA Ph 8/ stok buffer TAE 5X :

24.2 gram, 5.72 Ml asam asetat glasil dan 10 Ml dengan pemanasan). Setelah
agarosa terlarut dan didinginkan sampai kira-kira temperatur 450C, selanjutnya gel
dituangkan pada cetakan dan dibiarkan memadat. Sampel yang akan
dielektroforesis dicampur dengan buffer pembeban 1x (buffer pembeban 6x :
bromofenol biru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40% (b/v)). Elektroforesis dilakukan
dalam buffer TAE pada tegangan 70-100 volt. Elektroforesis dihentikan ketika
bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel. Gel agarosa
kemudian direndam dalam larutan buffer EtBr 250 g/Ml selama 3-5 menit,
selanjutnya direndam dalam buffer TAE selama 5-10 menit atau aquades. Pitapita DNA dapat diamati dengan sinar UV.

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
4.1.1 Isolasi DNA plasmid
No.
1.
2.

3.
4.

Perlakuan
Suspensi disentrifugasi

Hasil
dengan Dihasilkan pellet dan supernatan

suhu 40C
Warna kekuning
Pelet +100L larutan I
Dihomogenkan (disentil) dalam Homogen
es, diamkan 5 menit
+200L larutan II
Dihomogenkan (dibolak-balik)
Diinkubasi
+larutan III 150L, diinkubasi 10

Warna kekuningan
Homogen
Warna kekuningan
Terbentuk supernatan dan pelet

menit, disentrifugasi (I)

Supernatan diambil 0,15mL
Tidak berwarna
+larutan IV dengan perbandingan Tidak berwarna
1:1 (150L), dikocok
Sentrifugasi (II)

Terbentuk 2 fase (atas: tidak

5.

berwarna, bawah: keruh)

Bagian atas diambil (0,1mL), Tidak berwarna

6.

+200L etanol
Diinkubasi 1 jam
Tidak berwarna
Disentrifugasi (III)
Didapat pelet dan supernatan
Pelet ditambah etanol dingin 70%, Didapat pelet dan supernatan
disentrifugasi

4.2.2 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa

No.

Perlakuan

Gambar

1.

Dielektroforesis menggunakan
agarosa pada tegangan 70-100
volt dan hasilnya diamati dengan
sinar UV

4.2 Pembahasan
DNA merupakan molekul yang sangat panjang, terdiri dari ribuan
deoksiribonukleotida (ada empat jenis), yang bergabung dalam suatu urutan yang
bersifat khas bagi setiap organisme. Molekul ini biasanya berbentuk untaian
ganda. Kromosom sel prokariot merupakan suatu molekul besar DNA yang
berkaitan erat-erat menjadi suatu daerah inti atau nukleoid. DNA adalah materi
genetik yang mengandung purin dan pirimidin. Purin terdiri atas adenine dan
guanine, sedangkan piridin terdiri atas sitosin dan timin.
Sel eukariot mengandung sejumlah molekul DNA, yang masing-masing
pada umumnya berukuran jauh lebih besar dari satu molekul DNA didalam
prokaryota. Molekul DNA didalam eukaryota bergabung dengan protein dan
dikelompokkan menjadi serabut kromatin di dalam nukleus, yang dikelilingi oleh
system membran ganda yang bersifat kompleks. DNA berfungsi untuk
menyimpan informasi genetik secara lengkap yang diperlukan untuk mencirikan
struktur semua protein dan RNA tiap-tiap spesies organisme, untuk membuat
program pada saat yang tepat dan menempatkan biosintesis sel dan komponen
jaringan secara teratur, untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus
hidupnya, dan untuk menentukan kekhususan organisme tertentu.
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar
kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang
terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan
kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein
untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering
digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke

dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan

produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.
Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri E. Coli. Inti dari isolasi plasmid
bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat
keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal
(plasmid). Untuk memperoleh plasmid harus dilakukan pemurnian dari debris
membran sel, organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk
isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline
lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan dalam
isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki perbedaan
sifat pada keadaan alkalis.
Prosedur pertama yang dilakukan adalah mensentrifugasi sampel
suspensi.kemudian diberikan perlakuan dengan penambahan larutan I larutan II
dan larutan III yang masing masing memiliki fungsi yang berbeda-beda pada
setiap penambahan dan perlakuannya. DNA kromosom dan DNA plasmid dapat
merenaturasi dengan membutuhkan lama waktu yang berbeda. Tahapan yang
harus dilalui selama proses ini adalah resuspention, lysis, neutralization, dan
clearing of lysate.
Campuran heterogen terdiri dari senyawa-senyawa dengan berat jenis
berdekatan sulit dipisahkan. Membiarkan senyawa tersebut terendapkan karena
adanya grafitasi berjalan sangat lambat. Salah satu teknik yang dapat
dipergunakan untuk memisahkan campuran ini adalah teknik sentrifugasi, yaitu
metode yang digunakan dalam untuk mempercepat proses pengendapan dengan
memberikan gaya sentrifugasi pada partikel-partikelnya.
Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana objek diputar secara
horizontal pada jarak tertentu. Apabila objek berotasi di dalam tabung atau
silinder yang berisi campuran cairan dan partikel, maka campuran tersebut dapat
bergerak menuju pusat rotasi, namun hal tersebut tidak terjadi karena adanya gaya
yang berlawanan yang menuju kearah dinding luar silinder atau tabung, gaya
tersebut adalah gaya sentrifugasi. Gaya inilah yang menyebabkan partikel-partikel
menuju dinding tanbung dan terakumulasi membentuk endapan.

Setelah itu, supernatan dalam tabung kolektor dibuang. Supernatan adalah

substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah. Posisi
dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jerbih. Sementara
pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih
tinggi. Posisinya berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih
keruh.
Pada tahap resuspensi, pellet sel hasil dentrifuge diresuspensikan dalam
buffer STE (Sodium Tris EDTA) berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan
bahan lain. saat sel dicampur dengan Larutan I, maka tris-EDTA dapat mengikat
Mg 2+ dan Ca2+ untuk mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada
protein membran hilang) dan juga menghambat DNAse sehingga molekul DNA
tidak terdenaturasi. sedangkan glukosa dari Larutan I akan mencegah buffer (tris)
merusak sel dan membuat lingkungan hiperosmotik.
Tahap lysis tetap menggunakan pelet hasil sentrifuge pada tahap sebelumnya.
Pellet ini diresuspensikan ke dalam buffer lisis yang terdiri dari Sodium Dodecyl
Sulphate ( SDS ) dari Larutan II dapat melubangi membran sel karena SDS adalah
salah satu jenis deterjen yang mampu mengikat (menyelimuti) protein membran
sehingga terpisah dari bilayer lipid. NaOH akan memecahkan dinding sel dan juga
mendenaturasi DNA kromosom sehingga tampak lebih kusut. plasmid juga
terdenaturasi, namun yang membedakan adalah ukurannya, plasmid mudah untuk
renaturasi. plasmid dan RNA akan keluar dari pori-pori membran tapi DNA
kromosom masih tetap di dalam sel karena terlalu besar untuk keluar. NaOH juga
mulai menghidrolisis RNA, enzim lisosim menghancurkan dinding sel bakteri,
dan larutan glukosa untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu
membantu proses pelisisan. DNA plasmid dan DNA kromosomal akan
terdenaturasi dengan cara yang berbeda dengan menggunakan NaOH, karena
plasmid berbentuk sirkuler maka setelah mengalami denaturasi bentuknya akan
tetap utuh. DNA kromosomal yang berbentuk linier akan segera kehilangan
bentuknya setelah terdenaturasi. Selanjutnya adalah tahap neutralizer, dengan
menambahkan larutan penetralisir yang berisi kalium asetat dan asam asetat pada
pH 5. Kegunaan dari asam asetat adalah untuk menetralkan pH sehingga pH tidak
basa dan DNA bisa renaturasi

Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single

stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. Ion-ion seperti kation (Na+
Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. jika di dalam air,
gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian
rantai DNA masih berikatan dengan air, atau dapat dikatakan air punya konstanta
dielektrik yang tinggi. fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah
menurunkan konstanta dielektrik tersebut, atau memperbanyak ikatan DNA
dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi
Penambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid,
mengendapnya single stranded DNA karena molekulnya yang besar dan tidak
dapat larut dalam larutan dengan kadar garam tinggi, pembentukan KDS yang
tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang. Yang perlu diperhatikan
pada tahap ini adalah proses renaturasi pada DNA plasmid lebih cepat daripada
renaturasi dari DNA kromosomal. Selain itu pada saat penambahan larutan lisis
ini sebaiknya tidak digunakan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena
akan ikut menyebabkan DNA kromosomal menjadi lebih kecil sehingga akan
terlarut pada supernatant.
Kemudian masuk ke tahap clearing of lysates, pada tahap ini diperoleh
supernatant yang berisi DNA plasmid. Penambahan etanol absolut berguna untuk
mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas, etanol yang ditambahkan
harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang mengendap. Selanjutnya
untuk menghilangkan pengotor yang masih ada ditambahkan etanol 70% sehingga
sisa etanol yang tersisa dapat diuapkan dengan evaporasi. Plasmid yang
didapatkan berupa pellet dilarutkan kembali dengan ddH2O sehingga dapat
dilakukan analisis lebih lanjut dengan menggunakan elektroforesis.
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang
biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan
untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000
pasang basa (bp).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan
bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode) dengan diberikan

tegangan sebesr 70 volt. Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju
migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan
memsumuraningkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen
molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi
DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih
dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan ethidium bromide (EtBr)
yang merupakan pewarna fluoresen untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan
mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas
DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara
langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat
digunakan untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA
atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam
nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum. EtBr ini powerful
mutagen, pengguna harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja, dan
melindungi mata dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UVtransilluminator.
Proses running dari elektroforesis berjalan sangat lambat dimana pada
proses ini terjadi pergerakan 3 warna sampel pada agarosa, yakni ungu biru dan
kuning, running diberhentikan ketika sampel telah bergerak sampai tanda batas,
kemudian dilakukan analisa dengan sinar UV untuk melihat adatidaknya DNA.
Pita-pita pada lajur-lajur yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses
pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pitapita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung
molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan
kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut
berukuran sama. Pada hasil pengamatan menunjukkan bahwa terdapat lekukan
atau lajur yang berwarna nyala api orange yang menunjukkan bahwa terdapat
DNA yang berhasil diisolasi menggunakan metode elektroforesis.

BAB 5. PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan untuk praktikum isolasi DNA kromosom dan Plasmid
adalah sebagai berikut
a. Suatu DNA plasmid diisolasi dengan beberapa tahap yakni
resuspention, lysis, neutralization, dan clearing of lysate.
b. Proses elektroforesis digunakan untuk menandai adanya suatu DNA
yang berhasil diisolasi dan diindikasi dengan adanya suatu lekukan
berwarna orange nyala api pada agarosa yang dianilasa menggunakan
sinar ultraviolet
5.2 Saran
Adapun saran untuk praktikum ini adalah setiap penambahan larutan baik
laritan I, II dan III harus dilakukan dengan hati-hati karena perlakuan masingmasing dapat mempengaruhi hasil dari percobaan, seperti tidak munculnya 3 fase,
tidak munculnya pellet dan sedikitnya jumlah tersusupensi yang merupakan DNA
yang akan diisolasi dan dielektroforesis untuk mebuktikan adanya DNA.

DAFTAR PUSTAKA
Alatar, AA, et al. 2012. Simple And Rapid Protocol For The Isolation Of PCRAmplifiable DNA From Medicinal Plants. Genetics and Molecular
Research.
Brock, T. D., Michael T. Madigan, John M. Martinko and Paker. 1994. Biology of
Microorganisms. New Jersey: Prentice Hall.
Calladine, C. R., Horace RD. 2004. Understanding DNA. Amsterdam : Academic
Press.
Campbell, N.A. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta: Erlangga.
Lehninger. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Muladno, 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.
Sakura. 2010. Isolasi DNA. [serial online].

http://www.muslimahsakura90.com /

2010/02/24/isolasi-dna/. Diakses Pada Tanggal 10 Oktober 2014].

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kasinius.
Susanto, Agus Hery. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Purwokerto: Fakultas
Biologi Universitas Jenderal Soedirman.