Materi Prak Bioanalisis A2 Pertemuan Ke 3
Materi Prak Bioanalisis A2 Pertemuan Ke 3
PERCOBAAN 4
PENETAPAN KADAR OBAT
DAN JUMLAH METABOLITNYA DALAM URIN
DISUSUN OLEH :
Ayu Mayangsari
Rendi Nurhidayat
Andardian WIdiniyah
Kurnia Aulia K.
(G1F009022)
(G1F009023)
(G1F009024)
(G1F009025)
A. Tujuan
Melakukan penetapan kadar obat dalam urin dan menentukan jumlah
metabolitnya dalam urin.
B. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah beaker glass, labu ukur, pipet
ukur, pipet tetes, gelas ukur, tabung reaksi, tabung sentrifuse, rak tabung reaksi,
ASILdibuatlkHvhesog(0,5;12)/pncmr
jarum sonde, alat penampung urin tikus, plat KLT silika GF, Detektor UV 366
nm, spektrofotometer UV-Vis.
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah urin tikus, parasetamol tablet,
aquades, asam klorida 6 N, Natrium Nitrit 10%, Asam sulfanilat, dan NaOH 10%.
Fase gerak 1 = etil asetat-methanol-air-asam asetat (60:30:9:1), Fase gerak 2 = nbutanol-asam asetat-air (4:1:1).
C. Prosedur Percobaan
a. Pembuatan Kurva Baku
ASILdiukatmvopnsebHrlh2,51xC6fy3NO0%gjc.
ASILdiamtgunkblHVcjKT36,90:yehsrUpfo
D. Data Pengamatan
a. Pembuatan Kurva Baku
Panjang gelombang maksimum yang didapat = 424 nm
Larutan Baku
Konsentrasi
Absorbansi
0,05
0,333
0,075
0,394
0,1
0,493
0,125
0,667
Dari hasil regresi linier
a= 0,0825
b= 4,44
r = 0,975
jadi, persamaan regresinya adalah Y = 0,0825 + 4,44 x
Hasil Kurva Baku
absorbansi
0.8
0.6
absorbansi
0.4
0.2
0
0,05
0,075
0,1
absorbansi
0,500
0,209
0,462
0,425
0,125
c. Volume pemberian
10 mg 19,5 mg
=
1 ml
x
x=1,95 ml
= 2 ml
d. Larutan stok 10 mg/ml
Dibuat 0,06 mg/ml
M1xV1 = M2xV2
10xV1 = 0,25x25
V1 = 0,625 add 25 ml
e. Kadar sampel urin (larutan standar y=0,0864+4,404x)
A4 0,425 = 0,0864+4,404x
4,404x=0,425-0,0864
4,404x=0,3386
x=0,0769 . 5 . 2
x=0,769 mg/ml
f. Fase gerak 1
5,5
Rf standar= =0,917
6
Rf sampel=
g. Fase gerak 2
5,5
=0,917
6
3
spot 1 Rf = =0,5
6
spot 2 Rf =
5,5
=0,917
6
spot 3 Rf =
5,2
=0,87
6
Rata-rata Rf = 0,762
F. Pembahasan
Monografi Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :
a. Paracetamol
Nama resmi
Nama lain
RM / BM
Pemerian
: Acetaminophenum
: Paaracetamol
: C8H9NO2 / 151,56
: Hablur atau hablur serbuk putih, tidak berbau,rasa
pahit.
Kelarutan
(Anonim,1995)
b. Asam klorida
HCl ; BM 36,46;
Larutan natrium nitrit P10 % b/v yang dibuat segar (Anonim, 1995).
d. Asam sulfanilat
Sinonim
Asam 4-Aminobenzensulfonat; Asam p-Anilinsulfonat
Formula : (H2N)C6H4SO3H
Berat Molekul : 173,19
Toksisitas : LD50 pemberian secara oral pada tikus: 12300 mg/kg
Bentuk Fisik : Serbuk halus abu-abu
Titik Leleh : 288 C
Kelarutan dalam Air : 1 g / 100 ml
Aplikasi
Asam sulfanilat adalah serbuk halus atau kristal abu-abu; agak larut dalam
air, alkohol dan eter, larut dalam air panas dan HCl pekat, hangus pada suhu
288 - 300 C. Asam sulfanilat adalah hasil sulfonasi dari anilin. Anilin adalah
bahan baku dalam industri penghasil bahan pewarna celup. Asam sulfonat
dan garam-garamnya yang terkandung dalam bahan pewarna celup organik
memberikan fungsi yang berguna pada kelarutan dalam air dan atau
meningkatkan kecepatan pencucian bahan pewarna yang disebabkan karena
kemampuan keduanya mengikat lebih rapat dengan kain. Asam sulfanilat
dipakai sebagai perantara untuk pewarna (bahan pewarna celup, pewarna
NaOH mengandung
alkali jumlah, dihitung sebagai NaOH, mengandung Na 2CO3 tidak lebih dari
3,0%.). NaOH dapat merusak jaringan dengan cepat.
Pemerian
: putih atau praktis putih, massa melebur, berbentuk
pellet, serpihan atau batang atau bentuk lain, keras, rapuh dan menunjukkan
pecahan hablur. Bila dibiarkan di udara akan cepat menyerap karbon dioksida
dan lembap. NaOH mudah larut dalam air dan dalam etanol.
Kelarutan
: mudah larut dalm air dan dalam etanol
Wadah dan penyimpanannya : dalam wadah tertutup rapat (Anonim, 1995).
f. Aquades
Rumus molekul
:H2O
Berat molekul
: 18,02 g/mol
Air murni adalah air yang dimurnikan yang diperoleh dengan destilasi,
perlakuan menggunakan penukar ion, osmosis balik atau proses lain yang
sesuai. Dibuat dari air yang memenuhi persyaratan air minum dan tidak
mengandung zat tambahan lain. Densitas 0,998 g/cm dalam fase cairan dan
0,92 g/cm dalam fase padatan. Titik leburnya 0 C (273,15 K) (32 F) dan
titik didihnya 100 C (373.15 K) (212 F).
Pemeriaan
( Anonim, 1995).
g. Etil asetat
asetat
adalah
senyawa
organik
dengan
rumus
n-Butanol C4H9OH
j. Urin
Urin atau air kencing merupakan salah satu sisa metabolisme tubuh yang
dapat memberikan gambaran keadaan kesehatan tubuh kita. Mungkin tanpa
sadar kita sering memperhatikan bahwa urin yang kita keluarkan terkadang
jernih tetapi dilain waktu keruh atau bahkan berwarna gelap. Sebenarnya
perubahan yang terjadi menunjukkan keadaan sistem metabolisme didalam
tubuh kita. Pemeriksaan urin bisa memberikan gambaran tentang fungsi
ginjal, saluran kemih baik bagian atas maupun bagian bawah, fungsi hati,
infeksi pada saluran kemih dan lain-lain. Pemeriksaan urin lebih banyak
dilakukan sebagai pemeriksaan skrining suatu penyakit karena biaya
pemeriksaannya relatif lebih murah daripada pemeriksaan darah atau cairan
tubuh lainnya (Anonim, 2012).
Prinsip kerja Spektrofotometer UV-Vis dan KLT yang digunakan dalam analisis
adalah :
Prinsip Spektrofotometri UV/Vis
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu
sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan
spektrofotometer
ini,
metoda
yang
digunakan
sering
disebut
dengan
A = log ( Io / It )
= abc
Keterangan : Io = Intensitas sinar datang
It = Intensitas sinar yang diteruskan
a = Absorptivitas
b = Panjang sel/kuvet
c = konsentrasi (g/l)
A = Absorban
Spektrofotometri dapat dibayangkan sebagai suatu perpanjangan dari
penilikan visual dimana studi yang lebih terinci mengenai pengabsorpsian energi
cahaya oleh spesies kimia memungkinkan kecermatan yang lebih besar dalam
pencirian dan pengukuran kuantitatif. Dalam penggunaan dewasa ini istilah
spektrofotometri menyiratkan pengukuran jauhnya pengabsorpsian energi cahaya
oleh suatu sistem kimia itu sebagai fungsi dari panjang gelombang radiasi,
demikian pula pengukuran pengabsorpsian yang menyendiri pada suatu panjang
gelombang tertentu ( Underwood, 1995).
Semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV tampak. Oleh
karena mereka mengandung electron, baik yang dipakai bersama maupun tidak
yang dapat dieksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi (Underwood, 1986).
Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi
radiasi elektromagnet. Cahaya terdiri dari radiasi terhadap mana mata manusia
peka, gelombang dengan panjang berlainan akan menimbulkan cahaya yang
berlainan sedangkan campuran cahaya dengan panjang-panjang ini akan
menyusun cahaya putih. Cahaya putih meliputi seluruh spektrum nampak 400760 nm. Keuntungan utama pemilihan metode spektrofotometri bahwa metode ini
memberikan metode sangat sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang
sangat kecil (Anonim, 1979).
Spektrofotometri ini hanya terjadi bila terjadi perpindahan elektron dari
tingkat energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Perpindahan
elektron tidak diikuti oleh perubahan arah spin, hal ini dikenal dengan sebutan
tereksitasi singlet. Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang
terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari
spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur
intensitas
cahaya
yang
ditransmisikan
atau
yang
diabsorbsi.
Jadi,
atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan
blanko ataupun pembanding (Khopkar,1990).
Syarat syarat analisis dengan spektrofotometer UV Vis
a. Larutan harus berwarna atau mengandung senyawa organic tak
jenuh
b. Sinar harus monokromatis
c. Larutan harus jernih (tidak keruh)
d. Pelarut tidak boleh bereaksi secara kimia dengan sampel yang
dianalisis.
Pemilihan pelarut
a. Dapat melarutkan cuplikan
b. Dapat meneruskan sinar dari panjang gelombang yang dipakai (tidak boleh
menyerapnya.
c. Tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkojugasi pada struktur
molekulnya
d. Tidak berwarna
e. Tidak terjadi
interaksi
dengan
molekul
senyawa
yang
dianalisisf.
sekaligus
Celah keluar, tempat keluarnya sinar monokromatis yang selanjutnya akan
Sel atau kuvet adalah tempat sampel, harus terbuat dari bahan yang tembus
radiasi pada panjang gelombang yang akan digunakan untuk pengukuran
absorbansi
1) Berdasarkan pemakaiannya ada dua kuvet:
Kuvet permanen dibuat dari bahan gelas atau leburan silika
Kuvet dispossable dibuat dari teflon atau plastik
2) Berdasarkan bahannya ada dua macam kuvet :
Kuvet dari silica, dapat dipakai untuk analisis kuantitatif dan kualitatif
pada daerah pengukuran 190 1100 nm
Kuvet dari gelas, dapat dipakai untuk analisis kuantitatif dan kualitatif
pada daerah pengukuran 380 1100 nm, karena bahan dari gelas dapat
mengabsorpsiradiasi UV
3) Berdasarkan penggunaannya ada dua macam kuvet :
kuvet bermulut sempit, untuk mengukur kadar zat alam pelarut yang
mudah menguap
Kuvet bermulut lebar, untuk mengukur kadar zat alam pelarut yang tidak
mudah menguap.
4) Cuvet harus memenuhi syarat- syarat sebagai berikut :
a. Tidak berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua cahaya.
b. Permukaannya secara optis harus benar- benar sejajar.
c. Harus tahan (tidak bereaksi) terhadap bahan- bahan kimia.
d. Tidak boleh rapuh.
e. Mempunyai bentuk (design) yang sederhana
c. Detektor
1) Syarat detektor yang baik :
- Harus punya kepekaan yang tinggi terhadap radiasi yang diterima
- Harus memberikan noise yang sangat minim, sehingga mampu mendeteksi
intensitas sinar yang rendah
- Harus mampu memberi respon terhadap radiasi pada daerah panjang
gelombang yang lebar
- Harus memberi respon terhadap radiasi dalam waktu yang serempak
- Harus memberikan jaminan terhadap respon kuantitatif
- Sinyal elektronik yang diteruskan oleh detektor harus dapat diamplifikasikan
oleh amplifier ke recorder
Spektrofotometer UV-Vis dibagi menjadi :
a. Spektrofotometer single beam (berkas tunggal)
Pada spektrofotometer ini hanya terdapat satu berkas sinar yang dilewatkan
melalui cuvet. Blanko, larutan standar dan contoh diperiksa secara bergantian.
b. Spektrofotometer double beam (berkas ganda)
Pada alat ini sinar dari sumber cahaya dibagi menjadi 2 berkas oleh cermin yang
berputar (chopper).
- Berkas pertama melalui cuvet berisi blanko
- Berkas kedua melalui cuvet berisi standar atau contoh Blanko
Blanko berguna untuk menstabilkan absorbsi akibat perubahan voltase atau IO
dari sumber cahaya. Dengan adanya blanko dalam alat kita tidak lagi
mengontrol titik nolnya pada waktu-waktu tertentu, hal ini berbeda jika pada
single beam.
merupakan
metode
yang
digunakan
secara
luas
yang
kimia
dalam
campuran
yangkompleks.
Metode
kromatografi
berupa
silika
memiliki
permukaan
yang
bersifat
polar,
untuk
memisahkan campuran heterogen dengan berat jenis berdekatan yang sulit untuk
dipisahkan.
a. Pembuatan kurva baku
Kurva baku dibuat dengan mengambil larutan stok dengan konsentrasi
10mg/ml sebanyak 0,625 ml dan di add dengan 25 ml aquades. Kemudian
dibuat dalam berbagai konsentrasi, yaitu : 0,05;0,075;0,1;0,125. Dan diukur
absorbansinya pada spektrofotometer. Hasilnya adalah :
Konsentrasi
Absorbansi
0,05
0,333
0,075
0,394
0,1
0,493
0,125
0,667
Dari hasil regresi linier didapatkan :
a= 0,0825
b= 4,44
r = 0,975
jadi, persamaan regresinya adalah Y = 0,0825 + 4,44 x
NaNO2
(M
ursyidi & Rohman, 2006)
Dilakukan penambahan NaOH 10% sebanyak 2,5 ml untuk menambah suasana
alkali dan didiamkan selama 3 menit. Reaksi yang terjadi adalah:
2 H+ (aq) + NaOH (aq) Na+ (aq) + H2O (l)
Hasil absorbansi yang didapat dari penetapan kadar parasetamol adalah
Dari hasil regresi linier larutan baku :
a= 0,0825
b= 4,44
r = 0,975
jadi, persamaan regresinya adalah Y = 0,0825 + 4,44 x
Didapatkan nilai Absorbansi sampel (A4) = 0,425
0,425 = 0,0864+4,404x
4,404x=0,425-0,0864
4,404x=0,3386
x=0,0769 . 5 . 2
x=0,769 mg/ml
Jadi, kadar parasetamol yang ada pada sampel urin adalah 0,769 mg/ml.
c. Penetapan jumlah metabolit dalam sampel urin
Tahapan tahapan dalam penetapan kadar obat dan jumlah metabolitnya
dalam urin adalah sebagai berikut:
1. Persiapan Sampel
Urin tikus diambil,yang sebelumnya diberi parasetamol dengan dosis 150
mg/kg BB yang telah ditampung selama 24 jam. Lalu urin yang sudah ditampung
dipisahkan dari kotoran-kotoran yang ada termasuk pakannya ,kemudian
dilakukan pengenceran dan uji KLT dua arah.
2. Penotolan Sampel
Disiapkan lempeng KLT lalu dipotong dengan lebar 7 cm, panjang 7 cm,
garis start dibuat setinggi 0,5 cm dari tepi bawah dan garis front 0,5 cm dari tepi
atas. Bercak ditotolkan pada garis start (totolan pertama standar parasetamol dan
totolan kedua sampel urin) dan dilakukan 3 kali penotolan bercakyang
sebelumnya dikeringkan terlebih dahulu untuk setiap penotolannya.
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya
jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin.
Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan
terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih dari pada penotolan secara
manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 l. Penotolan
sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak
ganda. (Mulya,1995).
3. Elusi Sampel (Fase Gerak I)
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan
mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling
sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua
pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi
secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan
mengoptimasi fase gerak :
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
Eluen pertama pada chamber yang berisi (etil asetat : metanol : air : asam
asetat = 60 : 30 : 9 : 1) dibuat dan ditunggu hingga jenuh. Kemudian, lempeng
KLT dimasukkan ke dalam ruang (chamber) dijenuhi dengan uap eluen dengan
arah elusi naik. Chamber ditutup dengan rapat dan eluen dibiarkan naik sampai
garis front. Jika eluen telah sampai pada garis front, maka lempeng KLT diangkat
dengan hati-hati dan dilakukan pengeringan menggunakan kipas angin. Setelah
kering dan proses elusi selesai, maka lempeng KLT dimasukkan kedalam kotak
flouresens dan bercak yang nampak diamati pada sinar UV 366 nm. Jarak masing-
masing bercak komponen sampel dan bercak standar diukur. Harga Rf dihitung
dan hasil data yang didapatkan dievaluasi (Gandjar dan Rohman, 2007).
4. Elusi Sampel (Fase gerak II)
Jika Nilai Rf dari standar parasetamol dan sampel urin didapat,maka lempeng
KLT dipotong sedemikian rupa sehingga pada lempeng KLT hanya terdapat
bercak sampel urin,lalu lempeng diputar 900. Bercak sampel urin yang didapat
dielusi. Elusi dilakukan dengan dimasukkan bercak tersebut ke dalam chamber
yang beisi eluen ke-2 (n-butanol : asam asetat : air = 4 : 1 : 1) yang sudah jenuh.
Chamber ditutup dengan rapat dan eluen dibiarkan naik sampai garis front. Jika
eluen telah mencapai garis front, lempeng KLT diangkat dengan hati-hati dan
dilakukan pengeringan dengan menggunakan kipas angin.Setelah kering dan
proses elusi usai, lempeng KLT dimasukkan kedalam kotak flouresens .
Selanjutnya dilakukan pengamatan bercak tampak pada sinar UV 366 nm.. Jarak
masing-masing bercak komponen sampel dan bercak standar diukur. Pada
identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah bewarna dapat langsung
diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilai dari Jarak relative pada
pelarut. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi
dengan jarak tempuh oleh eluen ( fase gerak ) Harga Rf dihitung dan
dibandingkan dengan pustaka.Jumlah metabolit dapat diketahui dari analisis
metode KLT dengan standar paracetamol dan sampel urin.
Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak
bergeraknya
senyawa
tersebut
pada
plat
kromatografi
lapis
tipis.Saat
Fase gerak 1
Rfstandar=
Rfsampel=
5,5
=0,917
6
5,5
=0,917
6
Fase gerak 2
3
spot 1 Rf = =0,5
6
spot 2 Rf =
5,5
=0,917
6
spot 3 Rf =
5,2
=0,87
6
Rata-rata Rf = 0,762
Dari hasil tersebut bisa disimpulkan bahwa sampel urin mengandung parasetamol.
Sedangkan sampel urin sendiri memiliki 3 metabolit. Metabolit ini bisa berupa
protein ataupun zat pengganggu lainnya yang tidak terpisah pada sampel ini. Hal
ini dikarenakan bahan TCA yang tidak digunakan pada praktikum ini.
G. Kesimpulan
- Kadar paracetamol dalam sampel urin tersebut adalah 0,769 mg/ml.
- Sampel urin mengandung parasetamol. Sedangkan sampel urin sendiri
memiliki 3 metabolit. Metabolit ini bisa berupa protein ataupun zat
pengganggu lainnya yang tidak terpisah pada sampel ini. Hal ini dikarenakan
bahan TCA yang tidak digunakan pada praktikum ini.
H. Daftar Pustaka
Anonim, 1979. Farmakope Indonesia Ed. III. Jakarta : Departemen Kesehatan
Republik Indonesia.
Anonim. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta : Depkes RI