Anda di halaman 1dari 11

SITOTOKSISITAS ANESTESI LOKAL TERHADAP SEL STEM MESENKIMAL

MANUSIA

LATAR BELAKANG:
Anestesi lokal sering digunakan secara intraartikular untuk mengontrol nyeri perioperatif.
Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa obat yang biasa digunakan yaitu lidokain,
ropivakain, dan bupivakain dapat menjadi toksik terhadap kondrosit manusia. Penelitian ini
dilakukan untuk menentukan apakah efek toksik dari obat bius lokal pada kondrosit manusia
dapat berektensi ke sel stem mesenkimal manusia.
METODE:
Sel stem mesenkimal manusia didapatkan dari tiga donor yang sehat dan dibiakkan di dalam
kultur jaringan dan diekpos terhadap anestesi berikut selama enam puluh menit: (1) 1% lidokain,
(2) 2% lidokain, (3) bupivacaine 0,25%, (4) 0,5% bupivacaine, (5) ropivakain 0,2%, dan (6)
ropivacaine 0,5%. Sel-sel tersebut kemudian dibiarkan untuk pulih selama dua puluh empat jam
dalam media pertumbuhan biasa, dan viabilitas diukur dengan menggunakan pewarnaan
fluoresen terhadap sel hidup atau uji luminescence untuk konten ATP.
HASIL:
Jumlah sel hidup dan konten ATP adalah berkorelasi (r 2 = 0,79), dan 2% lidokain ditemukan
secara signifikan lebih betoksik berbanding semua dosis pada bupivakain dan ropivacaine.
Secara signifikan, pengobatan dengan 1% lidokain mengakibatkan lebih sedikit sel-sel hidup
(49%) dibandingkan dengan kelompok kontrol, dan secara signifikan juga, jumlah sel hidup
lebih kurang berbanding anestesi lainnya. Namun, tingkat ATP dalam kelompok lidokain 1%
tidak signifikan lebih rendah dibandingkan dengan kelompok lainnya. Bupivakain dan
ropivacaine tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam toksisitas dibandingkan dengan
kontrol atau dengan satu sama lain.

KESIMPULAN:
Ropivakain dan bupivakain memiliki toksisitas terbatas pada sel stem mesenkimal manusia.
Namun, lidokain secara signifikan dapat menurunkan viabilitas sel stem mesenkimal. Oleh
karena penelitian lain telah menunjukkan ropivacaine kurang betoksik terhadap kondrosit
dibanding bupivakain, ropivakain merupakan anestesi intraartikular yang lebih aman.
RELEVANSI KLINIS:
Sel stem mesenkimal mungkin memainkan peran kunci dalam penyembuhan setelah prosedur
pembedahah seperti mikrofraktur dan rekonstruksi ligamen. Jika anestesi lokal digunakan setelah
operasi gabungan, pemilihan agen dengan toksisitas rendah terhadap sel-sel stem mesenkimal,
seperti ropivakain, dapat memaksimalkan potensi jaringan penyembuhan.
Anestesi lokal sering digunakan pada sendi untuk memberikan analgesia pascaoperasi.
Pemberian anestesi lokal secara intraartikular setelah arthoskopi dapat dilakukan secara suntikan
tunggal atau terus menerus dengan pompa dan kateter, telah terbukti secara substansial
mengurangi nyeri pasca operasi dan mempertahankan gerakan sendi. Penggunaan anestesi lokal
tersebut adalah sering dilakukan dalam praktek umum di seluruh dunia. Dalam satu survei dari
semua unit ortopedi terkait dengan Swedish Arthroscopic Society, semua kecuali satu dari tiga
puluh tujuh praktik menggunakan anestesi lokal untuk menangani nyeri intraartikular pasca
operasi setelah artroskopi lutut.
Meskipun keberhasilan mereka dalam mengontrol rasa sakit, anestesi lokal juga mungkin
memiliki efek yang merugikan. Banyak penelitian telah menghubungkan penggunaannya yang
menyebabkan kondrolisis, komplikasi yang ditandai dengan penghancuran yang cepat dari tulang
rawan artikular. Hal ini terjadi pada pasien artroskopi bahu yang didiagnosis dengan onset
kondrolisis glenohumeral yang cepat secara rutin memiliki riwayat pemberian bupivakain atau
lidokain secara intraartikular. Konsisten dengan temuan klinis, banyak studi in vivo dan in vitro
telah menunjukkan bahwa anestesi lokal umum seperti bupivakain, ropivakain dan lidokain dapat
menjadi toksik terhadap kondrosit. Toksisitas tersebut tergantung pada anestesi yang spesifik,
durasi paparan dan dosis yang diberikan. Misalnya, secara in vitro, kematian sel setelah paparan
tiga puluh menit dari 0,5% ropivacaine adalah kurang dibandingkan dengan bupivakain 0,5%
pada kondrosit artikular manusia yang terisolasi dan tulang rawan artikular yang utuh.

Meskipun kondrotoksisitas anestesi lokal telah diteliti dengan baik, efek obat ini pada sel-sel
reparatif dalam sendi tidak diketahui. Banyak prosedur ortopedi, termasuk perbaikan tendon,
rekonstruksi ligamen dan prosedur pembedahan stimulasi sumsum seperti mikrofraktur, adalah
tergantung pada respon penyembuhan pasien. Sel stem mesenkimal mungkin memainkan peran
kunci dalam proses ini. Di bawah kondisi yang tepat, sel-sel ini dapat membentuk tulang, lemak,
tendon dan tulang rawan. Sel-sel regeneratif ini ditemukan di beberapa jaringan, termasuk
sumsum tulang, adiposa dan sinovium. Di samping itu, penyembuhan dari endogen sel stem
mesenkimal, pembedahan administrasi eksogen sel stem mesenkimal juga dapat meningkatkan
regenerasi jaringan.
Kami membuat hipotesis bahwa toksisitas anestesi lokal pada kondrosit juga akan meluas ke selsel stem mesenkimal. Jika demikian, anestesi lokal baik dapat secara langsung melukai jaringan
dalam sendi dan menurunkan kemampuan jaringan untuk sembuh. Dalam studi in vitro ini, kami
mengevaluasi efek dari dosis umum lidokain, ropivakain dan bupivakain yang digunakan
terhadap viabilitas sel-sel stem mesenkimal dari tiga donor sehat. Tujuan kami adalah untuk
mengidentifikasi pengobatan yang meminimalkan toksisitas.

BAHAN DAN METODE


Kultur Monolayer Sel Stem Mesenkimal
Sumsum tulang yang tersedia secara komersial berasal sel induk manusia mesenkimal (Lonza,
Walkersvile, Maryland) dari seorang laki-laki berusia dua puluh tahun (Lot 8F354), seorang pria
berusia tiga puluh tahun (Lot 0F4452) dan wanita berusia dua puluh dua tahun (Lot 0F3825),
dikultur secara lapisan monolayer pada DMEM (Dulbeccos Modification of Eagles medium)
dengan glukosa yang tinggi (Mediatech, Manassas, Virginia) ditambah dengan serum sapi 10%
(Hyclone, Logan, Utah), dan 1% larutan antibiotik / antimikotik (Hyclone) pada polistiren kultur
jaringan dengan kepadatan 5000 cells/cm2.
Sel-sel ditumbuhkan pada suhu 37oC dalam inkubator CO2 5% yang dilembabkan sehingga
konfluen 90%, lalu ditrypsinasi (trysinized) dan diperluas sampai bagian kelima atau keenam.
Kemudian mereka ditempatkan ke sembilan puluh enam piring baik dengan kepadatan 2500
sel/sumur (8000 sel/cm2) dan dikultur selama empat puluh delapan jam, yang mengarah ke
konfluen 90% sebelum dilakukan pengobatan eksperimental.
Grup Pengobatan
Kultur sel stem mesenkimal dibagi ke dalam enam sumur replikasi per kondisi dan diberikan
salah satu dari pengenceran obat berikut: (1) 2% lidokain, pH 6 (APP Pharmaceuticals,
Schumburg, Illinois), (2) 1% lidokain, pH 6, (3) 0,5 bupivacaine, pH 6 (Hospira, Lake Forest,
Illinois), (4) 0,23% bupivacaine pH 6, (5) 0,5% ropivacaine pH 5 (APP Pharmaceuticals) dan (6)
0,2 ropivacaine%, pH 5. Konsentrasi yang lebih tinggi dari setiap jenis anestesi disediakan oleh
produsen. Solusi yang disediakan adalah bebas pengawet, mengandungi natrium klorida (untuk
menyesuaikan osmolaritas) dan natrium hidroksida atau asam hidroklorik (untuk menyesuaikan
pH) ditambahkan oleh produsen. Kelompok kontrol diobati dengan larutan garam 0,9% (APP
Pharmaceuticals), yang juga digunakan untuk menyiapkan konsentrasi rendah lidokain dan
bupivakain dari konsentrasi yang lebih tinggi. Solusi ropivacaine 0,2% disediakan oleh produsen
atau terdilusi dari ropivacaine 0,5% dengan larutan garam 0,9%.
Media kultur sel itu diaspirat dan 200 uL larutan pengobatan ditambahkan ke setiap sumur. Sel
diinkubasi dalam larutan pengobatan selama enam puluh menit pada suhu 37oC dalam inkubator

CO2 5% yang dilembabkan, lalu dicuci 1x dengan solusi phosphate buffered saline (PBS) dan
kembali ke inkubator dalam media kultur segar. Viabilitas sel stem mesenkimal diukur dua puluh
empat jam kemudian.
Penilaian Viabilitas
Hitungan Sel Hidup
Media kultur sel diaspirat dari setiap sumur dan viabilitas sel stem mesenkimal diwarnai dengan
Kit LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity (Life Technologies, Grand Islan, New York). Secara
singkat, 100uL dari pengenceran 1:2000 dari calcein AM (acetomethoxy) dalam solusi PBS telah
ditambahkan ke dalam setiap sumur. Sel diinkubasi selama empat puluh lima menit pada suhu
kamar dan kemudian divisualisasikan dengan menggunakan mikroskop fluorescent Axiovert
200M (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, Ney York) dengan filter flouresin. Foto digital dari
pusat setiap sumur diambil pada 5x perbesaran. Viabilitas sel di lapangan setiap dikuantifikasi
dengan melapiskan grid ke imej digital di Photoshop (Adobe System, Sn Jose, California) dan
calcein berwana pada sel hidup, akan memperlihatkan flouresen hijau dihitung. Jumlah sel-sel
mati juga dikuantifikasi pada subset dari toksik dengan pewarnaan etidium homodimer-1 dan
visualisasi dengan menggunakan filter rhodamine. Etidium berwarna pada sel-sel mati dan sel
hidup calcein berwarna dihitung dan persentase sel hidup untuk setiap toksik dihitung.
Konten ATP (Adenosine Triphosphate)
Kandungan ATP dalam sampel diobati diukur dengan menggunakan Assay CellTiter-Glo
Luminescent Cell Viabilty Assay (Promega, Madison, Winconsin) sesuai dengan instruksi dari
pabriknya. Secara singkat, buffer CellTiter-Glo dan substrat CellTiter-Glo digabung untuk
membentuk reagen CellTiter-Glo. Reagen ditambahkan ke media kultur di setiap sumur dalam
rasio 1:1, dicampur dengan baik dan diinkubasi selama sepuluh menit pada suhu kamar.
Luminesen kemudian diukur dengan penggunaan Wallac 1420 VICTOR 2 Mulitlabel Counter
(PerkinElmer, Waltham, Massachusetts)
Analisis statik
Jumlah sel hidup dari tiga toksik independen, dihitung sebagai persentase dari kontrol, dianalisis
bersama-sama dengan menggunakan analisis model campuran varians (ANOVA), dengan

konsentrasi obat tertentu sebagai faktor tetap dan toksik sebagai faktor acak. Hasil hitungan sel
hidup dilaporkan untuk setiap konsentrasi obat sebagai rata-rata kuadrat terkecil (nilai terbaik
dihitung dari seluruh cobaan) dan standard error. Hasil konten ATP dilaporkan untuk masingmasing dari tiga donor individu sebagai rata-rata luminesen (output CellTiter-Glo) dan standard
error. Perbedaan dalam konten ATP antara kelompok percobaan dinilai untuk setiap donor
dengan menggunakan ANOVA. Hasil untuk tiga donor yang dikombinasikan dengan penggunaan
ANOVA model campuran, dengan konsentrasi obat tertentu sebagai faktor tetap dan donor
sebagai faktor acak. Hasil konten ATP dilaporkan sebagai kuadrat terkecil berarti luminescence
dan standard error. Karena beberapa perbandingan dibuat, pentingnya perbedaan antara
percobaan dihitung dengan menggunakan uji signifikan berbeda Tukey , dengan nilai p <0,05
dianggap signifikan. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan IMP (versi 9,0, SAS
Institute, Cary, North Carolina).
Sumber Pendanaan
Studi ini dilakukan dengan dana dari Departemen Bedah Ortopedi dari Universitas San Francisco
dan dengan sumber daya dari Veterans Affair Medical Center, San Francisco, California. Tidak
ada sumber pendanaan eksternal.

HASIL
Perbandingan Viabilitas Sel Diukur dengan Count Sel Live, Persentase Sel Live dan Konten
ATP
Dalam pilot experiment, sel-sel stem mesenkimal dari salah satu donor (laki-laki berusia dua
puluh tahun) diletakkan masing-masing dalam enam kondisi anestesi dan viabilitas ditentukan
dengan masing-masing tiga metode evaluasi: (1) jumlah sel hidup, (2) persentase sel hidup, (3)
konten ATP. Enam replikasi dilakukan pada setiap tiga metode evaluasi pada setiap kondisi.
Regresi linier menghasilkan nilai r2 dari 0,84 antara jumlah sel hidup dan persentase sel hidup
dan nilai r2 dari 0,79 antara jumlah sel hidup dan konten ATP. Mengingat kekuatan korelasi ini,
kami mengevaluasi kelayakan dengan menggunakan jumlah sel hidup dan konten ATP untuk
donor ini dan hanya konten ATP untuk dua donor lainnya.
Hidup Hitungan Sel
Jumlah sel-sel hidup yang tersisa setelah pengobatan dengan anestesi lokal ditentukan dengan
menggunakan sel stem mesenkimal dari donor laki-laki dua puluh tahun. Pengobatan dengan
0,25% dan 0,5% bupivacaine dalam tiga percobaan independen mengurangi jumlah sel hidup
menjadi 94% dan 79%, masing-masing, berbanding nilai pada kelompok kontrol. Pengobatan
dengan 0,2% dan 0,5% ropivacaine mengurangi jumlah sel hidup menjadi 83% dan 84%,
masing-masing, berbanding nilai pada kelompok kontrol. Tidak ada perbedaan yang signifikan di
antara keempat kelompok. Pengobatan dengan kedua konsentrasi lidokain, bagaimanapun,
menghasilkan penurunan yang signifikan dalam jumlah sel hidup dibandingkan dengan semua
kelompok lainnya. Pengobatan dengan 1% lidocaine mengurangi jumlah sel hidup sampai 49%
dari nilai pada kelompok kontrol (p <0,0001) dan 2% lidokain mengurangi hingga 32% (p
<0,0001) (Gambar 1 dan 2).
Konten ATP
Sebagai alternatif, pengukuran independen dari kelangsungan hidup sel, konten ATP seluler
setelah perawatan anestesi lokal ditentukan dengan menggunakan sel stem mesenkimal dari
masing-masing dari tiga donor (laki-laki dua puluh tahun, wanita dua puluh dua tahun dan lakilaki tiga puluh tahun). Hasil untuk masing-masing donor serta informasi hasil gabungan model

dari ketiga donor ditunjukkan pada Gambar 3. Pada semua empat kasus, pengobatan 2% lidokain
secara signifikan mengurangi viabilitas dibandingkan dengan pengobatan dengan baik
ropivacaine dan bupivakain. Dalam model gabungan, konten ATP dalam kelompok lidokain 2%
adalah hanya 49% terhadap kelompok ropivacaine 0,2%. Untuk donor berusia dua puluh tahun,
konten ATP dalam 1% dan 2% kelompok lidokain adalah hanya 56% dan 39%, masing-masing,
terhadap kelompok ropivacaine 0,2% (p <0,05). Namun, perbedaan antara kelompok lidokain
1% dan kelompok percobaan lainnya tidak signifikan terhadap dua donor lain atau untuk model
gabungan. Tidak ada perbedaan signifikan yang ditemukan antara kelompok ropivacaine dan
bupivakain.

DISKUSI
Kondrotoksisitas anestesi lokal termasuk bupivakain, ropivakain dan lidokain pada manusia dan
hewan telah banyak dilaporkan. Namun untuk pengetahuan kita, efek dari obat ini pada sel stem
mesenkimal manusia belum pernah diketahui. Mengingat peran kemungkinan sel-sel dalam
penyembuhan jaringan setelah prosedur ortopedi, toksisitas anestesi lokal pada sel-sel ini
mungkin penting secara klinis. Penelitian ini menunjukkan bahwa bupivakain dan ropivacaine
pada konsentrasi 0,5% yang umum digunakan secara signifikan kurang toksik berbanding
konsentrasi lidokain dengan potensi anestesi setara. Hasil in vitro menunjukkan bahwa
pemberian lidocaine intrartikular mungkin memiliki efek merugikan pada populasi sel stem
mesenkimal.
Toksisitas relatif bupivakain, ropivakain dan lidokain pada sel stem mesenkimal berbeda dari
toksisitas mereka pada kondrosit manusia. Studi in vitro dan in vivo sebelumnya telah
menunjukkan bahwa bupivakain lebih toksik bagi sel-sel tulang rawan berbanding ropivacaine
dan lidokain. Secara khusus, Piper dan Kim langsung membandingkan toksisitas ropivacaine
0,5% dengan yang bupivakain 0,5% dan menemukan bahwa meskipun ropivacaine menginduksi
kematian sel pada kondrosit manusia, namun secara signifikan lebih kurang kondrotoksik
dibanding bupivakain. Perbedaan sitotoksisitas diamati antara populasi stem sel kondrosit dan
mesenkimal menunjukkan efek diferensial anestesi lokal pada jenis sel yang berbeda.
Perbedaan dalam sifat fisik dan kimia antara obat ini kemungkinan berkontribusi pada perbedaan
dalam toksisitas relatif mereka pada jenis sel yang berbeda. Bupivakain dan ropivacaine adalah
molekul yang sangat lipofilik, sedangkan lidokain sedikit lipofilik. Pengobatan sel leukemia
manusia dengan anestesi menginduksi pola kematian sel yang berbeda. Bupivakain dan
ropivacaine dominan menyebabkan nekrosis, sedangkan lidokain menginduksi fragmentasi DNA
dan apoptosis (kematian sel terprogram). Studi sel-T limfoma manusia dan sel neuroblastoma
menunjukkan bahwa pengobatan lidokain mengarah ke apoptosis namun ropivacaine tidak.
Perbedaan-perbedaan ini mungkin karena perbedaan aktivasi caspases, yang merupakan enzim
proteolitik yang memainkan peran kunci dalam apoptosis. Ketiga-tiga anestesi ini juga dapat
berbeda dalam

mempengaruhi inflamasi. Bupivakain menginduksi aktivitas nitrat oksida

sintase-2 dalam sel glial tikus dan astrosit namun tidak pada ropivacaine. Jalur ini biasanya
diaktifkan sebagai bagian dari respon inflamasi, menunjukkan bahwa toksisitas bupivacaine

mungkin disebabkan produksi oksida nitrat selama peradangan yang sedang berlangsung.
Sebaliknya, ropivakain memiliki sifat antiinflamasi.
Potensi yang relatif pada lidokain, bupivakain dan ropivacaine juga dapat dibandingkan.
Bupivakain dan ropivacaine adalah anestesi sangat ampuh dengan efek jangka panjang,
sedangkan lidokain anestesi cukup kuat dengan efek yang lebih pendek. Secara khusus,
bupivakain dan ropivacaine adalah sekitar empat kali lebih kuat daripada anestesi lidokain. Oleh
karena itu, efek dari bupivakain 0,5% dan 0,5% ropivacaine pada nyeri adalah setara dengan
lidokain 2%, namun mempunyai durasi yang lebih lama dan kurang toksik terhadap sel stem
mesenkimal. Meskipun uji CellTiter-Glo untuk konten ATP adalah sedikit kurang sensitif
terhadap perbedaan antara kondisi jumlah sel hidup, tren yang serupa ditemukan pada kedua
metode analisis.
Salah satu keterbatasan dari studi ini adalah kenyataan bahwa ujicoba ini dilakukan secara in
vitro. Ujicoba yang lebih lanjut diperlukan untuk menilai efek in vivo pada obat ini terhadap
viabilitas sel stem mesenkimal. Namun, kondisi eksperimental dalam penelitian ini
(pertumbuhan sel dalam kultur jaringan untuk menghasilkan monolayer pada bagian kelima atau
keenam) yang umum digunakan dalam penelitian sel stem mesenkimal, dan sel-sel tersebut
didefinisikan dalam sebagian kemampuan mereka untuk menempel, berkembang biak dan
berdiferensiasi menjadi jaringan mesenkimal seperti dalam kondisi in vitro. Keterbatasan lainnya
adalah kenyataan bahwa pengukuran viabilitas hanya dilakukan setelah enam puluh menit
pengobatan anestesi. Durasi paparan ini terpilih atas dasar studi farmakokinetik sebelumnya pada
injeksi bupivacaine intrarticular ke lutut. Penyerapan anestesi ini dari sendi ke dalam aliran darah
yang cepat, dengan konsentrasi darah puncak yang dicapai dalam satu jam pertama setelah
injeksi. Kami tidak menyadari data yang sama untuk lidokain atau ropivakain. Kami tidak
menguji ketergantungan waktu atau untuk potensial toksisitas pada awal pemberian obat. Efek
pengobatan anestesi lokal pada potensi diferensiasi sel stem mesenkimal juga interes dalam
ujicoba kedepannya. Meskipun sel-sel diobati dengan bupivakain dan ropivacaine dalam
penelitian ini tampaknya normal dari segi metabolik dan morfologi, obat ini bisa secara tidak
kentara dapat mempengaruhi pola diferensiasi. Untuk mempelajari efek ini, sel-sel stem
mesenkimal diperlakukan dengan kelas dan dosis anestesi lokal yang bervariasi untuk dapat diuji
kemampuan membentuk tulang, tulang rawan dan lemak.

Kesimpulannya, kontras terhadap toksisitas yang diamati dalam kondrosit manusia dan sapi,
konsentrasi umum digunakan ropivacaine dan bupivakain tampaknya memiliki toksisitas terbatas
pada manusia sel stem mesenkimal. Sebaliknya, lidokain secara signifikan menurun viabilitas sel
stem mesenkimal. Meskipun ujicoba ini dibatasi oleh dengan ujicoba in vitro, data ini
menunjukkan bahwa ropivacaine dan bupivacaine dapat menjadi pilihan yang lebih baik
sehubungan dengan sel stem mesenkimal. Dengan mempertimbangkan lebih lanjut terhadap
kondrotoksisitas dari bupivakain dan kondrolisis terkait dengan pemberian bupivakain pasca
operasi, ropivakain adalah paling aman berbanding tiga pilihan analgesia intraartikular.

Beri Nilai