Anda di halaman 1dari 12

Latar Belakang

M. tuberculosis merupakan bakteri yang mempunyai banyak protein dan


memberikan respon imun seluler dan humoral yang bervariasi. Respon imun tergantung
pada titik tangkap mediator imun pada protein M. tuberculosis. Pemahaman tentang
protein antigenik bakteri ini akan membuka peluang pengembangan metoda diagnostik.
Pengembangan teknik komputasi dengan memprediksi epitop sel B memungkinkan
mendapatkan peptida target lebih mudah dan murah.

Analisis sekuens genom M. tuberculosis memberikan banyak informasi tentang


karakteristik gen dan protein yang ada pada bakteri ini sehingga informasi tentang
patogenesitas dan virulensi menjadi lebih jelas.

Pengetahuan tentang proteonomik M. tuberculosis sangat diperlukan dalam


pengembangan metoda diagnostik, terapi dan vaksinasi. Protein yang dihasilkan atau
bagian dari bakteri mempunyai fungsi yang bervariasi, seperti mekanisme penghindaran
respon imun tubuh, metabolisme, struktur dan regulator (Cole et al., 1998).

Pada infeksi M. tuberculosis, respon antibodi lebih banyak dikaji sebagai


komponen diagnostik. Pemahaman terhadap protein antigenik terhadap sel B menjadi
sangat penting dalam mengembangkan metoda diagnosis cepat. Salah satu masalah
utama dalam mendapatkan protein antigenik adalah biaya dan waktu yang lama untuk
sintesis protein rekombinan. Mengingat antibodi hanya mengenal sekuens asam amino
atau epitop tertentu dari suatu protein, maka saat sekarang berkembang berbagai

metoda komputasi untuk mengidentifikasi dan memprediksi epitop spesifik sel B, seperti
PEOPLE, PREDITOP, ABC pred, BCPreds dan lain sebagainya (Alix, 1999; Odorico and
Pellequer, 2003; Saha et al., 2005).

Analisis dan prediksi epitop sel B akan memberikan banyak keuntungan, yaitu
respon imunogenik tidak terlalu berbeda dengan protein utuh, mudah disentesis karena
hanya terdiri dari 10-20 asam amino serta tidak memerlukan biaya yang besar dan
waktu yang lama.

Penelitian ini bertujuan untuk mendesain dan mengidentifikasi epitop sel B dari
protein M. tuberculosis yang berukuran 20kDa serta menilai potensinya sebagai kit
diagnostik dini.

Penelitian dilakukan dalam dua model, yaitu model komputasi untuk


menganalisis epitop sel B menggunakan B-cell epitope prediction server (BCPreds).
Metoda ini memungkinkan mendapatkan epitop sel B yang bersifat linear. Pada tahap
kedua dilakukan penilaian respon antibodi terhadap peptida sintesis menggunakan
metoda ELISA. Respon antibodi ditentukan dalam bentuk nilai Optical Density (OD).

BAHAN DAN CARA

Bahan
Antibodi recombinan, 5 peptida sintetis, goat anti human anti IgG conjugated
Alkali posfatase, pNPP, Media LJ, Washing buffer, Stop Solution, N asetil sistein, PBS,
NaOH.
Prosedur Penelitian
Pengumpulan sampel
Subjek penelitian berjumlah 150 orang. Sampel teliti adalah sputum dan darah
dari subjek yang dicurigai dengan TB Paru berdasarkan data klinis. Setiap subjek akan
dilengkapi dengan catatan rekam medik khusus penelitian dan disimpan sebagai
dokumentasi penelitian.

Analisis Proteonomik protein 20kDa M. tuberculosis


Analisis proteonomik protein 20kDa M.tb dilakukan menggunakan data base
tuberculosis yang diakses melalui http://tuberculist.epfl.ch. Semua protein didata dan
diidentifikasi protein yang disekresikan atau komponen dinding sel.
Prediksi sekuens epitop sel B
Prediksi epitop sel B ditujukan terhadap epitop linear karena epitop jenis ini akan
memberikan respon antibodi yang lebih baik. Pada penelitian ini epitop sel B ditentukan
menggunakan B-cell epitope prediction server (BCPREDS). Data selanjutnya dianalisis
terhadap hidropobisitas, residu asam amino dan struktur. Berdasarkan analisis ini akan
didapatkan 5-10 peptida pendek yang terdiri dari 10-20 asam amino. Peptida selanjutnya
dipesan ke gen script sesuai dengan urutan asam amino.
Pengumpulan dan preparasi sputum
Sputum yang memenuhi kriteria dipreparasi dengan N-asetil sistein dan NaOH
(NAlc NaOH). Sputum dicampur dengan NAlc NaOH sama banyak, selanjutnya
divortex selama 15 menit. Hasil yang didapat disentrifus selama 20 menit pada suhu 4C
dengan kecepatan 3000 g. Supernatan disimpan untuk analisis antibodi dan pelet
dipersiapkan untuk kultur.
Pewarnaan tahan asam

Pewarnaan tahan asam dilakukan terhadap sputum menggunakan metoda Ziehl


Neelsen. Sputum yang telah difiksasi pada kaca objek dituangkan dengan carbolfuchsin
dan dipanaskan. Hal ini akan merusak dinding sel sehingga zat warna merah masuk.
Saat dicuci dengan alkohol, zat warna tidak hilang. Penambahan warna sekunder
dengan Metilen Blue tidak dapat menggeser pewarna primer. Hal ini menyebabkan
bakteri M. tuberculosis berwarna merah dengan latar biru.
Kultur
Kultur

dilakukan

dalam

medium

Lowenstein

Jensen.

Medium

dibuat

menggunakan LJ base dan telur serta ditambahkan dengan malacheet green. Sampel
yang telah dipreparasi dimasukkan ke dalam medium LJ dan diinkubasi pada suhu 37C.
Amati pertumbuhan bakteri sejak minggu ke-2 hingga minggu ke-8

Pemeriksaan antibodi anti peptida sintetik


Kadar antibodi anti peptida sintetik dihitung menggunakan metoda Elisa. Peptida
sintetik ditempel pada plat elisa dan diinkubasi semalam selanjutnya antibodi dari
sputum dan serum ditambahkan sebanyak 100 ul per sumuran. Deteksi menggunakan
goat anti mouse anti IgG yang diikatkan dengan enzim alkalifosfatase. Perubahan warna
akibat penambahan substrat pNPP dibaca pada panjang gelombang 495 nm.
Konsentrasi antibodi spesifik peptida dihitung berdasarkan kurva normal yang dibuat dari
antibodi standart.
Hasil dan pembahasan
Sampel teliti
Total sampel yang didapatkan pada penelitian ini adalah 155 orang yang terdiri
dari 85 orang (54.8%) laki-laki dan 75 orang (45.2%) perempuan. Rerata umur sampel
teliti adalah 55.8 8.12 tahun. Sampel berasal dari BP4 Lubuk Alung dan RS. DR. M.
Djamil Padang. Semua proses pengadaan sampel dilakukan oleh dr. Oea Khairsyaf dan
residen bagian Paru FK. Unand/RS. DR. M. Djamil Padang.
Hasil kultur memperlihatkan 93 sampel (60.0%) adalah Tuberkulosis sedangkan
sisanya 62 (40.0%) bukan tuberkulosis. Data ini selanjutnya dijadikan sebagai pedoman
dalam analisis potensi diagnostik peptida sintetik.
Analisis genomik gen penyandi protein 20kDa M. tuberculosis

Analisis genomik dilakukan menggunakan blast untuk melihat variasi molekuler


diantara gen-gen yang menyandi protein 20kDa M. tuberculosis. Hingga saat ini telah
dilakukan analisis terhadap 25 gen. Hasil analisis memperlihatkan variasi molekuler
antara 1-3%.
Analisis terhadap gen yang menghasilkan protein berukuran 20kDa dilakukan
berdasarkan data yang ada pada tuberculolist (http://tuberculist.epfl.ch), KEEG
(http://www.genome.jp) dan TB data base (http://genome.tbdb.org).

Tabel 2. Karakteristik gen penyandi protein 20kDa M. tuberculosis


No

Kode

Nama

BM

Produk

Fungsi

Rv0004

Rv0004

19.9

CHP

RV0009

ppiA

549nt/182aa

19.2

PPIase A

Folding protein

Rv0098

fcoT

552nt/183aa

20.5

Rv0113

gmhA/lpc
A

591nt/196aa

20.9

Rv0114

gmhB

573nt/190aa

20.5

fatty acyl CoA


thioesterase type III
phospho heptose
isomerase
D-glycero-D-mannoheptose 7-phosphate
kinase

Rv0137
c

msrA

549nt/182aa

20.4

Peptide methionine
sulfoxide reductase

Rv0262
c

aac

546nt/181

20

Aminoglycoside 2'-Nacetyltransferase

Metabolisme
lipid
Sintesis
innercore LPS
Biosintesis
gliceromano
heptosa
Perbaikan enzim
yang dirusak
oleh proses
oksidasi
Resisten
terhadap
aminoglikosida

Rv0321

dcd

573nt/190aa

20.8

Rv0380
c

Rv0380c

552nt/183aa

19.9

10

Rv0429
c

Ukuran
664
nt/187aa

Interconversi
dCTP ke dUTP
Metilasi RNA
Sintesis protein
melalui
pelepasan gugus
formil

def

594nt/197aa

20.9

formyl methionine
deformylase

Rv0481c

525nt/174aa

19.1

Rv0487

552nt/183aa

20.7

Integral membran
protein

Transpor lisin

12

Rv0481
c
Rv0487

13

Rv0488

Rv0488

606nt/201aa

20.9

14

Rv0513

RV0513

549nt/182aa

19.4

11

deoxycytidine
triphosphate
deaminase
RNA methyl
transferase

Transmembran protein

peptidyl-tRNA
hydrolase

Transpor tRNA
ke ribosom

potassium-transporting
ATPase C
Pyrazinamidase
/nicotinamidase

Tranport
potasium
Metabolisme
necotamide
Pengenalan
promoter,
inisiasi
transkripsi

15

Rv1014

pth

576nt/191aa

20.4

16

Rv1031

kdpC

570nt/189aa

20

17

Rv2043
c

pncA

561nt/186aa

19.6

18

Rv2069

sigC

558nt/185aa

19.9

sigma Faktor RNA


polimerase

19

Rv2080

lppJ

564nt/187aa

20.3

Lipoprotein

Dinding sel?

20

Rv2116

lppK

570nt/189aa

19.7

Lipoprotein

Dinding sel?

21

Rv2240
c

Rv2240c

591nt/196aa

20

22

Rv3146

nuoB

555nt/184aa

20.2

.NADH-ubiquinone
oxidoreductase chain
B

23

Rv3233
c

Rv3233c

591nt/196aa

20.4

triacylglycerol
synthase

Sintesis triasil
gliserol

24

Rv3405
c

Rv3405c

567nt/188aa

20.6

Regulator
transkripsi

25

Rv3456
c

rplQ

543nt/180aa

19.5

50S ribosomal protein

Translasi

Aerob/anaerob
respirasi

Berdasarkan analisi menggunakan Tbpred, PSL pred, Psipred dab VCIM Pred
didapatkan Rv0009, 0429c, Rv1031 dan Rv3146 disekresikan ke dalam lingkungan.
Kondisi ini menyebabkan analisis epitop antibodi dilakukan terhadap keempat gen
tersebut.
Analisis Epitop antibodi
Analisis epitop dilakukan menggunakan software ABCpred sehingga didapatkan
epitop linear antibodi. Seluruh epitop disusun berdasarkan karakteristik asam amino
penyusun, sehingga didapatkan masing-masing 3 (tiga) epitop pilihan untuk antibodi.

Tabel 3. Epitop linear M. tuberculosis dari 4 protein tersekresi

No
1

Gene
Rv0009

Rv0429c

Rv1031

Rv3146

Epitope linear
GGTGGGAGAGDAAASA

kode
0009*A

ARLIGHGGAGGAGGDR

0009*B

GADTGGNSSSVPNA
YQALSAQAL

0009*C
429*A

YQALSAQAA

429*B

MSLLITSPATVA
FVSVAPEIV

429*C
1031*A

FVIAAPEVI

1031*B

EAQVEQQLL
DGATGGKGNNGNPG

1031*C
3146*A

GLPNTGQDGGPGG

3146*B

GADTGGNSSSVPNA

3146*C

Pada saat sekarang sedang dilakukan pemesanan epitop linear peptida sintetik
terhadap 12 sekuens asam amino yang ada. Diperkirakan semua bahan datang pada
pertengahan oktober, sehingga semua sampel dapat dianalisis.
Analisis epitop dengan antigenik diskriminan
Tahapan ini bertujuan untuk mendapatkan peptida sintetik yang imunogenik dan
mempunyai titer antibodi yang yang berbeda secara bermakna antara kelompok TB dan
non TB. Hasil analisis dengan Elisa memperlihatkan hanya dua peptida sintetik yang
mempunyai potensi sebagai diagnosis.
Berdasarkan hasil elisa diketahui pada kelompok 009*C ditemukan OD antibodi
0.312 0.138 pada TB dan 0.074 0.045 pada non TB. Analisis statistik dengan Mann
Whitney memperlihatkan perbedaan yang bermakna (p = 0.000). Hasil yang sama juga
ditemukan pada kelompok 3146*B, dimana rerata OD dari kelompok TB berbeda secara
bermakna dengan non TB (0.353 0.157 vs 0.088 0.064, p = 0.000).
Pada dasarnya perbedaan nilai OD antibodi yang bermakna juga ditemukan
pada beberapa peptida lain, seperti 009*A (p = 0.007), 429*B (P = 0.014), 1031*A (P =
0.041) dan 3146*C (p = 0.016), namun karena variasi antara kedua kelompok tersebut
kecil maka tidak dilanjutkan untuk analisis.

Tabel 4. Perbandingan OD antibodi antara kasus TB dan non TB


menggunakan epitop pepetida
Kode

Kelompok

Rerata + SD

P*

009*A

0.040 0.017

TB

0.035 0.025

Non TB
009*B

009*C

429*A

429*B

429*C

1031*A

1031*B

1031*C

3146*A

3146*B

3146*C

TB

0.042 0.019

Non TB

0.043 0.026

TB

0.312 0.138

Non TB

0.074 0.045

TB

0.044 0.019

Non TB

0.041 0.027

TB

0.041 0.018

Non TB

0.056 0.034

TB

0.065 0.029

Non TB

0.071 0.052

TB

0.052 0.023

Non TB

0.047 0.032

TB

0.061 0.027

Non TB

0.058 0.031

TB

0.034 0.015

Non TB

0.034 0.024

TB

0.050 0.022

Non TB

0.049 0.032

TB

0.353 0.157

Non TB

0.088 0.064

TB

0.067 0.029

Non TB

0.061 0.044

0.007

0.504

0.000

0.118

0.014

0.439

0.041

0.445

0.158

0.229

0.000

0.016

* Analisis dilakukan dengan uji Mann Whitney U test, karena distribusi data tidak normal

Uji potensi diagnostik peptida 0009*C dan 3146*B


Nilai cut off peptida 0009*C ditentukan menggunakan kurva ROC. Pembuatan
kurva ROC menggunakan grafik x dan y, dimana x adalah sensitivitias dan y merupakan
1- spesifisitas dari nilai yang diasumsikan sebagai cut off.

Analisis peptida 3146*B

memperlihatkan area dibawah dibawah kurva mempunyai ukuran 90.6%. Data ini
menunjukan bahwa akurasi nilai cut off sangat baik. Berdasarkan data kurva diketahui
nilai cut off terbaik untuk peptida 3146*B adalah 0.287 dengan sensitivitas 100% dan
spesifisitas 75%.

Tabel 5. Area Under the Curve peptida 3146*C


Area

Std.
Error(a)

Asymptotic
Sig.(b)

0,906

0,076

0,006

Asymptotic 95% Confidence Interval


Lower Bound

Upper Bound

0,757

1,056

Gambar 1. Kurva ROC peptida


3146*C

Tabel 6. Identifikasi nilai cut off berdasarkan koordinat kurva

Positive if Greater Than


or Equal To(a)

Sensitivity

1 - Specificity

-1,00000

1,000

1,000

,00800

1,000

,625

,02400

1,000

,500

,08850

1,000

,375

,28750

1,000

,250

,45700

,875

,250

,52150

,750

,250

,59400

,625

,250

,64200

,625

,125

,66100

,625

,000

,73650

,500

,000

,87050

,375

,000

,96750

,250

,000

Analisis terhadap peptida 0009*C diketahui nilai dibawah kurva ROC adalah
94.2% dengan nilai cut off 0.261. Sensitivitas dan spesivisitas pada nilai ini masingmasing 100% dan 72.7%.
Tabel 7. Area Under the Curve peptida 0009*C

Area
0.942

Std.
Error(a)
0.046

Asymptotic
Sig.(b)
0.000

Asymptotic 95% Confidence


Interval
Lower Bound
0,852

Upper Bound
1,033

Gambar 1. Kurva ROC peptida 3146*C


Tabel 8. Identifikasi nilai cut off berdasarkan koordinat kurva

10

Positive if Greater
Than or Equal
To(a)

Sensitivity

1 - Specificity

,01600

1,000

,727

,04850

1,000

,636

,07300

1,000

,545

,12900

1,000

,455

,20950

1,000

,364

,26100

1,000

,273

,32550

,909

,273

,40050

,909

,182

,48900

,818

,182

,55350

,818

,091

,60750

,727

,091

,69900

,636

,091

,76350

,636

,000

,82800

,545

,000

,89250

,455

,000

,94600

,364

,000

7. Kesimpulan dan saran


Kesimpulan
1. Telah berhasil diidesain 12 epitop peptida dari 4 protein M. tuberculosis
2. Epitop 0009*C dan 3146*B memberikan respon antibodi yang berbeda antara
penderita TB dan bukan TB
3. Nilai cut off pepetida 0009*C adalah 0.261, sedangkan 3146*B adalah 0.287
4. Sensitvitas dan spesifisitas peptida 0009*C adalah 100% dan 94.2%, sedangkan
pepetida 3146*B adalah 100% dan 75%
Saran
1. Perlu dilakukan uji diagnostik menggunakan nilai cut off yang telah diketahui
pada sampel yang besar

11

12