Terdapat penelitian mengenai metode untuk memantau komponen serum non-transferrinin

binding iron (NTBI), yang disebut desferioksamin-chelatable iron (DCI). Metode tersebut
dapat dinilai dengan pemeriksaan fluorescein desferioksamin (Fl-DFO) di mana fluoresensi
stoikiometri akan padam bila terdapat besi. DCI lebih banyak ditemukan dalam serum pasien
dengan thalassemia mayor dibandingkan pada pasien dengan hemokromatosis. Metode ini
diterapkan untuk memeriksa kadar besi pada serum pasien yang dalam masa terapi khelasi.
Dalam waktu singkat (2 jam) segera setelah pemberian oral deferriprone (L1) menunjukan
peningkatan DCI dalam serum
Jangka pendek (2 jam) follow up dari pasien segera setelah pemberian oral deferriprone (L1)
menunjukkan mobilisasi besar DCI ke serum (maksimal 10 mM dalam waktu 30-60 menit).
Pengalihan DCI dari L1 ke Fl-DFO diamati in vitro dengan preformed kompleks L1-besi, dan
terjadi bahkan pada L1 / besi rasio melebihi 3: 1. Administrasi simultan dari L1 oral dan
intravena DFO kepada pasien membatalkan kenaikan L1-dimediasi di DCI, konsisten dengan
bolak besi dari L1 ke DFO in vivo. Transfer besi serupa dari L1 ke apo-transferin diamati in
vitro, memberikan dukungan eksperimental untuk gagasan bahwa L1 besi shuttle bisa in vivo
untuk ligan afinitas tinggi lainnya. Hasil ini memberikan alasan untuk menggunakan
kombinasi chelator, dengan sangat
bertindak L1 tetap sebagai intraseluler chelator-shuttle dan kurang permanen DFO melayani
sebagai tenggelam besi ekstraseluler. Potensi aplikasi dari uji DCI mungkin untuk
mempelajari tindakan chelator dan sebagai indeks status khelasi pasien.

Kapasitas desferioksamin (DFO) untuk khelasi besi (Fe) ekskresi pada pasien kelebihan zat
besi didokumentasikan dengan baik.

Kinerja deferoksamin (DFO) untuk khelasi besi pada pasien yang kelebihan zat besi telah
diketahui dengan baik. DFO mengikat Fe yang berada dalam hati dan sistem
retikuloendotelial yang membawa sebagian beban Fe dalam tubuh. Akan tetapi efisiensi DFO
sebagai kelator intraseluler terbatas karena ukuran molekulnya yang besar dan hidrofobik
sehingga DFO relatif lambat menembus ke dalam sel. DFO tidak mengangkut sejumlah besar
Fe yang berada pada transferrin, kecuali ditambah dengan mediator eksogen seperti
nitrilotriasetat (NTA) atau sitrat . Sebagian besar pasien kelebihan zat besi memiliki NTBI di
dalam serum. NTBI dinyatakan lebih labil dibandingkan Fe-terikat Tf , sehingga NTBI
merupakan target yang berpotensi dan lebih mudah diikat oleh DFO.
DFO diduga mengakses kolam dari Fe dalam hati dan sistem retikuloendotelial, yang
membawa sebagian besar beban Fe tubuh. Namun, karena DFO menembus ke dalam sel
relatif lambat, karena ukuran molekul yang besar dan hidrofobik, efisiensi sebagai chelator
intraseluler terbatas. Serum Fe merupakan target potensial lain dan lebih mudah diakses
untuk DFO. Meskipun DFO tidak memobilisasi sejumlah besar Fe dari transferin (Tf),
protein Fe-pembawa serum, kecuali mediator eksogen seperti nitrilotriasetat (NTA) atau sitrat
ditambahkan, 5 sebagian besar pasien Fe-kelebihan beban juga memiliki non transferin
terikat besi (NTBI) di serum.6-10 yang NTBI telah diasumsikan lebih labil daripada Tfterikat Fe dan karena itu bisa menjadi sumber potensial dari katalis aktif Fe dan target untuk
khelasi oleh DFO. Namun, in vitro pengukuran fisikokimia dalam serum pasien dengan
hemochromatosis keturunan menunjukkan bahwa DFO tidak efektif chelate NTBI.11 studi
serupa mengenai kolam DFO diakses di serum dari pasien dengan thalassemia mayor yang
tidak dilaporkan. Kami telah mempertimbangkan kemungkinan bahwa sifat NTBI mungkin
berbeda pada pasien yang berbeda dan mungkin bergantung pada derajat Fe berlebihan.
Dengan demikian, serum dari pasien dengan thalassemia mayor, yang cenderung memiliki Tf

tingkat kejenuhan tinggi dari serum dari pasien dengan hemochromatosis, mungkin juga
mengandung bentuk NTBI yang DFO-chelatable.
Pada penelitian ini kami memperkenalkan assay untuk besi DFO-chelatable (DCI)
berdasarkan fluorescein-DFO (Fl-DFO), penyelidikan yang memiliki sifat Fe mengikat sama
seperti DFO tetapi berisi kelompok pelapor fluoresen yang mengalami menghilangkan pada
pengikatan Fe, analog dengan yang dipublikasikan sebelumnya analog nitrobenzofurazan
kami (NBD-DFO) .12 penggunaan fluoresen pemeriksaan Fe-responsif memungkinkan kita
untuk langsung memeriksa keberadaan komponen DFO-chelatable dari NTBI. Selain
menentukan DCI dalam serum, uji ini memungkinkan kita untuk mengikuti fraksi Fe serum
ini selama terapi chelator dengan deferriprone (L1) dan DFO. Usaha-usaha sebelumnya untuk
mengukur efek pengobatan DFO pada tingkat NTBI menunjukkan penurunan awal diikuti
oleh rebound menuju level asli dalam hours.10,13 tes ini berbeda dari uji hadir dalam bahwa
mereka mengukur total tingkat NTBI dimobilisasi dengan konsentrasi yang sangat tinggi
agen seperti NTA13 atau oxalate.10 bisa dibayangkan bahwa proporsi yang signifikan dari
NTBI mungkin tidak dapat diakses oleh chelator in vivo. Dengan mengukur hanya sebagian
kecil dari NTBI langsung tersedia untuk DFO, uji yang digunakan di sini disediakan ukuran
efisiensi khelasi dari fraksi ini dan, dengan implikasi, manfaat potensial langsung bahwa
pasien mungkin berasal dari terapi DFO. Uji juga mendeteksi mobilisasi L1-dimediasi
signifikan Fe ke serum, terdeteksi sebagai DCI, menunjukkan bahwa pengalihan Fe dari
kompleks L1-Fe ke DFO dapat terjadi. Hasil penelitian ini memberikan dasar mekanistik
untuk kemanjuran terapi chelator gabungan yang melibatkan administrasi simultan dari L1
dan DFO, 14-16 mirip dengan apa yang telah diusulkan sebelumnya untuk chelators lainnya
hasil
Konfigurasi uji untuk DCI

Uji schematized pada Gambar 1 didasarkan pada fluoresen, penyelidikan Fesensitif Fl-DFO, yang dipadamkan pada pengikatan Fe. Fl-DFO merespon
terpercaya untuk Fe ketika Fe disajikan secara, larutan jelas Fe-NTA (tidak
ditampilkan). Namun, bentuk deteksi Fe tidak dapat diterapkan pada sampel
serum dengan cara yang sama, karena ini sangat bervariasi dalam warna dan
kekeruhan, yang keduanya dapat secara signifikan mempengaruhi sinyal
fluoresensi. Oleh karena itu, setiap penurunan Fl-DFO fluoresensi bisa
disebabkan baik kehadiran Fe atau beberapa komponen fluoresensi-gangguan.
Kesulitan ini diatasi dengan mengukur setiap sampel di bawah 2 kondisi yang
terpisah: A, dengan Fl-DFO saja, dan B, seperti dalam kondisi A, namun dengan
adanya kelebihan besar non fluoresen DFO. Perubahan fluoresensi yang
diperoleh dalam kondisi A adalah karena pengikatan Fe (jika ada) ke Fl-DFO dan
efek kemungkinan lain, faktor yang tidak diketahui dalam sampel. Fluoresensi
yang diperoleh dalam kondisi B hanya ditentukan oleh yang lain, faktor yang
tidak diketahui, karena kelebihan DFO disekap Fe dalam sampel, mencegah yang
mengikat Fl-DFO. Rasio sinyal fluoresensi yang diperoleh dalam 2 kondisi (kondisi
A / B kondisi) menunjukkan ada atau tidaknya Fe dalam sampel. Pada prinsipnya,
rasio A / B =1 menunjukkan tidak ada Fe terdeteksi dalam sampel, dan rasio A /
B < 1 menunjukkan adanya Fe.
Afinitas relatif Fl-DFO dan DFO untuk Fe dibandingkan dengan pra pencampuran
Fl-DFO dan DFO pada konsentrasi setara (2,5 mM) dan pengujian respon
terhadap peningkatan konsentrasi Fe: NTA (1,25-10 mM Fe). DFO menurunkan
pencelupan dari Fl-DFO sekitar 50%, menunjukkan bahwa fluorescein
diturunkanDFO memiliki afinitas kurang lebih sama untuk Fe sebagai DFO (tidak
ditampilkan).

Gambar 1. Skema uji DCI. Skema ini menggambarkan langkah-langkah uji untuk
baik yang normal (kiri) dan NTBI mengandung serum (kanan). Besi digambarkan
sebagai sebuah lingkaran penuh dan molekul Tf dilambangkan dengan 'T'.
Langkah 1: Sampel serum dicampur dengan reagen A (HBS mengandung 2,5 mM
fluorescein-DFO [Fl-DFO, *]) atau reagen B (sama dengan reagen A, tetapi
mengandung 100 mM DFO, **) di sumur. Dalam reagen A diakses Fe mengikat
Fl-DFO dan memadamkan fluoresensi nya, sedangkan pada reagen B Fe
mengikat kelebihan non fluoresen DFO daripada Fl-DFO. Langkah 2: Fluoresensi
ditentukan setelah 2 jam inkubasi. Dalam serum normal, rasio fluoresensi sampel
diobati dengan reagen A dan B sudah dekat 1, sedangkan di Fe yang
mengandung serum, fluoresensi dalam reagen A lebih rendah daripada di B,
memberikan rasio kurang dari 1. Rasio fluoresensi bacaan (A / B) berbanding
terbalik dengan konsentrasi DCI dalam sampel asli.

DISKUSI
Dalam tulisan ini kami memperkenalkan assay untuk mendeteksi langsung DCI
dalam serum, yang menggunakan probe Fe-sensitif Fl-DFO. Ini memiliki
keuntungan dari kesederhanaan, biaya yang relatif rendah, dan kapasitas
throughput tinggi. Uji ini berbeda secara fundamental dari tes yang diterbitkan
sebelumnya untuk penentuan serum NTBI, komponen yang ditemukan dalam
serum pasien dengan berbagai Kondisi fe-kelebihan dan ketidakseimbangan Fe
metabolism. Sedangkan tes untuk NTBI menggunakan mobilisasi agen untuk
sehingga membuat NTBI diakses oleh chelator atau pemeriksaan, metode yang
disajikan di sini tidak. Ciri khas dari pendekatan ini adalah bahwa hanya Fraksi
langsung DFO diakses serum Fe terdeteksi. Karena DFO adalah digunakan secara
luas untuk pengobatan Fe-kelebihan kondisi, penelitian ini memiliki klinis dan
farmakologis implikasi.
Pemeriksaan dengan FI-DFO ini mempunyai beberapa keuntungan yaitu, cukup
sederhana, biaya yang relatif murah, dan kapasitas tinggi. Ciri khas pada
pemeriksaan ini ialah DFO secara langsung mengikat Fe yang telah terdeteksi
dalam serum. Karena DFO telah banyak digunakan untuk mengobati kelebihan
Fe, maka hal tersebut dapat dilibatkan untuk tujuan klinis maupun farmakologi.

DCI dan NTBI

Kami berhipotesis bahwa DCI merupakan subfraksi dari NTBI, atas dasar 3
tempat: (1) penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa meskipun DFO

memiliki afinitas yang lebih tinggi untuk Fe dibandingkan Tf, ia bisa

menghilangkan sedikit Tf-terikat Fe, karena bergerak lambat . Dalam penelitian
ini, 13 dari total 95 sampel serum hemochromatotic diuji, yang memiliki Tf
saturasi di atas 80% (kisaran, 81% -97%), tidak memiliki tingkat DCI terdeteksi
(tidak ditampilkan).

Terdapat hipotesa bahwa DCI merupakan sebagian dari NTBI berdasarkan 3 hal
yaitu, pada penelitian sebelumnya menunjukan DFO memiliki afinitas yang lebih
tinggi terhadap Fe dibandingkan denga transferrin, akan tetapi DFO juga dapat
menghilangkan transferrin , oleh sebab itu pergerakannya lambat. Pada
penelitian ini menunjukan 13 dari 19 sampel serum yang telah diuji, yang
memiliki saturasi Tf diatas 80% , tingkat DCI tidak dapat terdeteksi.
Oleh karena itu, DCI tidak berasal dari transferrin melainkan terkait dengan
beberapa komponen NTBI. Dan NTBI sendiri terdiri dari bentuk heterogen Fe
kompleks yang beberapa diantaranya secara tidak langsung berikatan dengan
DFO.
Oleh karena itu, kami menganggap bahwa DCI tidak berasal dari Tf tetapi
dikaitkan dengan beberapa komponen NTBI.We juga menegaskan hal ini secara
langsung, dengan menunjukkan bahwa DCI dipertahankan dalam sampel serum
talasemia mayor, bahkan setelah Tf adalah kuantitatif dihapus dari itu dengan
manik-manik agarosa membawa anti-Tf antibodi (data tidak ditampilkan). (2)
NTBI mungkin terdiri dari bentuk heterogen Fe kompleks, beberapa di antaranya
mungkin tidak secara langsung diakses DFO. Ini tersirat dalam sebuah penelitian
yang dilakukan pada hemochromatosis serum, menggunakan resolusi tinggi
resonance.11 magnetik nuklir penelitian menunjukkan bahwa kompleks sitrat
dan sitrat-asetat-Fe adalah komponen dari NTBI tetapi chelated oleh DFO pada

tingkat yang sangat lambat, bahkan pada konsentrasi chelator tinggi (mM). Juga,
mobilisasi sebelumnya NTBI dengan agen seperti EDTA, sitrat, 6 NTA, 20 atau 10
oksalat diperlukan untuk deteksi di berbagai tes NTBI. (3) Sembilan
hemochromatosis serum dari Belanda semua ditemukan negatif untuk DCI (Tabel
1). serum ini juga diuji untuk NTBI, menggunakan uji di mana NTBI digerakkan
dengan oksalat. Lima dari 9 serum terkandung NTBI (kisaran, 0,9-4,5 mM). Oleh
karena itu, DCI adalah definisi operasional untuk sebagian kecil dari serum Fe,
yang mungkin merupakan komponen NTBI tetapi belum tentu identik dengan itu.
Aspek metodelogi dari DCI uji
Variabilitas karena kombinasi dari kesalahan pipetting dan instrumen suara
pembaca plat fluoresen biasanya kurang dari 10%, berdasarkan duplikat sampel
dalam lempeng yang sama. Reproduksibilitas uji tersebut dinilai dengan tes
ulang beberapa serum. Hari-hari variabilitas nilai DCI tidak melebihi 15%. Kami
mendirikan nilai empiris 0 mM DCI berdasarkan nilai yang diperoleh dengan 48
serum dari individu tanpa Fe berlebihan (Gambar 2B). Nilai DCI tertinggi dalam
kelompok ini adalah 0,3 mM, dan diadopsi sebagai 0 nilai dalam sistem kami.
Sejumlah serum memberi nilai DCI sangat negatif. Ini jelas artifactual, meskipun
mereka juga telah diperoleh dalam tes NTBI lainnya. Meskipun sumber nilai-nilai
negatif tidak jelas, mereka tampaknya disebabkan oleh penghapusan
kontaminan Fe oleh aktivitas Fe-mengikat dalam serum, seperti digambarkan
pada Gambar 4 dan 8, di mana penambahan apo-Tf atau DFO dengan sampel
menyebabkan generasi nilai-nilai negatif. Oleh karena itu semua konsentrasi
kurang dari 0,3 mM dianggap DCI-negatif, dan nilai nol ini ditunjukkan oleh garis
putus-putus pada gambar.
Fluoresensi dari probe Fl-DFO dipadamkan oleh CU+ dan Cu2+, Co3+, dan Fe2+
dan Fe3+, tapi tidak dengan CA2+, Mg2+, Zn2+, Cd2+, atau Mn2+. Fl-DFO,

seperti DFO sendiri, mengikat Al3+ dan Ga 3+, tapi itu tidak akan padam oleh
mereka (data tidak ditampilkan). Karena tidak Cu atau Co yang mungkin
ditemukan dalam serum pada konsentrasi mikromolar, kita mengasumsikan
bahwa sinyal yang diperoleh dalam uji adalah semata-mata karena Fe.

Mobilisasi Fe oleh L1 dan transfer ke DFO in vitro dan in vivo

Deteksi meningkat DCI dalam serum pasien segera setelah pemberian L1
(Gambar 3) ditafsirkan hasil dari Fe mobilisasi L1-dimediasi dari jaringan diikuti
dengan transfer ke Fl-DFO dalam in vitro uji. Kesimpulan ini didasarkan pada
kapasitas didokumentasikan dari L1 untuk memobilisasi Fe di vivo23 dan dari selsel di vitro4 dan mentransfernya ke Fl-DFO in vitro (Gambar 5). Selain itu, kami
menemukan bahwa peningkatan serum Fe disebabkan oleh L1 dan diidentifikasi
sebagai DCI (Gambar 3), disejajarkan dengan peningkatan jumlah serum kadar
Fe yang diukur dengan metode asam-bathophenanthroline (data tidak
ditampilkan).

Potensi aplikasi dari uji ini

Pemeriksaan ini dapat digunakan sebagai indeks untuk pasien yang sedang
menjalani terapi khelasi atau untuk yang berencana melakukan terapi khelasi.
Meskipun tidak adanya DCI dari serum pasien tidak akan berarti bahwa pasien
baik chelate, kehadirannya akan menjadi indikasi yang jelas bahwa terapi khelasi

lebih agresif dibenarkan. Aplikasi masa depan uji ini termasuk adaptasi terhadap
pengukuran serum NTBI membutuhkan Fe mobilisasi oleh agen shuttle (Breuer
dan rekan kerja, dalam persiapan).
Pemeriksaan ini dapat digunakan untuk pasien yang sedang menjalani atau pun
pasien yang baru berencana melakukan terapi khelasi . Dengan adanya DCI pada
serum pasien akan menjadi indikasi yang jelas untuk melakukan terapi khelasi
yang lebih agresif lagi.